Cố định enzyme

2.7.1. Định nghĩa về enzyme cố định

Enzyme cố định là enzyme được giới hạn hay khác biệt về mặt vật lý ở một vùng không gian nhất định, nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác và có thể tái sử dụng nhiều lần sau một quá trình xúc tác.

2.7.2. Ưu nhược điểm của quá trình cố định enzyme

 Ưu điểm:

Có thể tái sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần 1 lượng enzyme xác định trong 1 thời gian dài, do đó làm giảm giá thành sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao tiết kiệm enzyme, đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền, thuận lợi trong các quá trình tự động hóa và liên tục.

- Tăng độ tinh sạch của sản phẩm vì enzyme được cố định ở những pha riêng rẽ do đó dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm. Tránh được ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm. Điều này đặc biệt là có ý nghĩa khi sử dụng enzyme cố định trong sản xuất thực phẩm, trong công nghiệp sản xuất hóa chất tinh khiết và trong phân tích.

- Có thể dừng quá trình phản ứng ở bất cứ giai đoạn nào khi cần thiết, chỉ cần tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất.

- Kéo dài thời gian bảo quản và bền vững với chất kiềm hãm cũng như với các tác nhân gây biến tính so với enzyme hòa tan.

21

- Hoạt tính ổn định so với enzyme tự do khi có những thay đổi của môi trường như: pH, nhiệt độ…. Nhờ vào các liên kết của enzyme với chất mang như liên kết cộng hóa trị, liên kết hydro, liên kết ion và các liên kết khác.

 Nhược điểm:

Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme cho nên hoạt tính riêng của enzyme cố định thường thấp hơn so với enzyme tự do.

- Một lượng enzyme đáng kể bị mất hoạt tính khi cố định bằng phương pháp cộng hóa trị là do chất hoạt hóa và do phản ứng gắn kết không đặc hiệu của các liên kết trên vật liệu cố định vào trung tâm hoạt động của enzyme.

2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định

Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hoà tan). Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme không hoà tan là:

 Bản chất và tính chất hóa học của chất mang.

 Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ học, độ trương điện tích, tính háo nước và kị nước,… đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định. Bản chất hóa học của các chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tới khả năng hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng.

 Dẫn xuất enzyme không hòa tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên. Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydro và liên kết kỵ nước.

 Sự khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác.  Tốc độ khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất phụ khác.

22

2.7.4. Phương pháp cố định enzyme

 Cố định enzyme thông qua liên kết hóa trị

Tạo liên kết hóa trị với vật liệu mang được hoạt hóa thông qua các gốc tự do – NH2, OH và SH ở mạch bên của các amino acid. Theo nguyên tắc, liên kết hình thành trong quá trình tương tác giữa nhóm ưa nhân (nucleophilic) của enzyme với các nhóm chất được hoạt hóa trước đó trên bề mặt chất mang.

 Cố định enzyme bằng cách nhốt trong gel

Tiến hành nhốt enzyme vào nền chất tạo gel tự nhiên, hay tổng hợp, có bản chất là polymer, là khá đơn giản. Các polymer như Na-alginate, carrageenan, carboxymethyl-cellulose (CMC) hoặc polymer cationic như chitosan, thường được sử dụng để tạo liên kết với các ion trái dấu như Ca+2 hoặc polyphosphate. Tuy nhiên phương pháp này có một số hạn chế. Ion Ca+2 đóng vai trò làm chất kết nối gel thường dễ bị hòa tan khi bổ sung thêm muối. Gel dạng hình cầu lại mềm và xốp, độ bền cơ học thấp, khó có thể nhồi vào cột phản ứng, nên ít được sử dụng. Tuy nhiên hướng công nghệ này vẫn được tiếp tục nghiên cứu, theo hướng làm cứng nền gel bằng cách tạo phức gel với hạt epoxide.

2.7.5. Ứng dụng của enzyme cố định

2.7.5.1. Trong công nghiệp

Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như: công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất… Rượu bia: Các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở quy mô lớn.

Chế biến sữa: Enzyme lactase cố định để thủy phân lactose trong sữa.

- Năm 1969 Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoseamylase cố định. - Năm 1971 đã dùng Chimotrypsin liên kết cộng hóa trị với carboximethyl cellulose làm đông tụ sữa thay cho rennin đắt tiền.

23

Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học, để chữa các bệnh di truyền do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu. Năm 1954, Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme bị biệt lập với môi trường xung quanh. Do đó cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme thiếu mà không bị ảnh hưởng của các phản ứng phụ.

Enzyme được cố định còn được dùng trong chuẩn đoán bệnh. Ngoài các ứng dụng điện cực enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như lượng: glucose, urea, cholesterol…Enzyme Horseradish peroxidase cố định trên polystyren cùng với kháng thể , giúp chuẩn đoán nhanh và chính xác (kĩ thuật ELISA).

Enzyme L-asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của u ác tính, nếu đưa trực tiếp enzyme này vào cơ thể sẽ bị đưa ra ngoài nhanh chóng và gây nên hiện tượng dị ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả cao hơn.

2.7.5.3. Trong nghiên cứu khoa học

Năm 1967, điện cực enzyme đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucoxydase cố định. Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt gel polyacryamide. Nhúng điện cực vào dung dịch glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuếch tán vào gel chứa enzyme. Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và nồng độ glucose.

Kaetsu dùng điện cực urease trong máu, dùng cholesterol oxydase đo nồng độ cholesterol.

Clark dùng điện cực alcohol oxyreductase để xác định nồng độ cồn.

Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa enzyme zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng trong phương pháp sắc kí ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme. Ngày nay có nhiều quy trình sử dụng tế bào cố định để xử lí nước thải đạt hiệu quả cao.

24

2.7.5.4. Trong bảo vệ môi trường

Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường…chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu chất hữu cơ. Do đó có thể sử dụng enzyme cố định để xử lí nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra ngoài môi trường bên ngoài.

2.7.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.7.6.1. Tình hình nguyên cứu trong nước

Nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam trong vài năm gần đây, kết quả thu được cũng còn nhiều hạn chế.

Năm 1994 -1995, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu enzyme glucoisomerase trên các hạt Silochrom B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde.

Lê Văn Hiệp (1995), cố định vi khuẩn tả (Vibrio cholerea) lên giá thể PHEMA bằng kĩ thuật bức xạ, Nguyễn Quốc Hiến (1996) đã nghiên cứu chế tạo chế phẩm hormone progesterone thải chậm bằng kĩ thuật bức xạ.

Lê Quang Luân (1997) đã cố định vi khuẩn Pseudomonas mastophlla để xử lí chất hữu cơ nước.

Nguyễn Quang Tâm (2002) đã nghiên cứu cố định pectinase thu thập từ các chủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) đã nghiên cứu cố định α – amylase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis…

2.7.6.2. Tình hình nguyên cứu ngoài nước

Cho đến năm 1979, người ta còn rất hy vọng có thể áp dụng công nghệ này cho tất cả các loại enzyme. Tuy nhiên đánh giá thực sự cho thấy hiện mới chỉ có 2 công nghệ sử dụng glucose isomerase và penicillin amidase cố định là có hiệu quả. Hiện tại enzyme amino acid acyclase, aspartase, fumarase cũng đã bắt đầu được ứng dụng thực tiễn (chủ yếu là ở Nhật).

25

Bảng 2.2 Một số enzyme cố định đang được sử dụng trong sản xuất Enzyme cố định Sản lượng

(tấn/năm)

Phương pháp cố định

Hãng sản xuất

Aminoacid acylase 1000 t DEAE sepharose Reactor màng Eupergit

Tanabe Degussa Rohm Aminoglucosidase 5000 t sirô glucose Than hoạt tính Tate % Lyle Aspartate 1000 t Nhốt tế bào trong

carrageeman

Tanabe

Furmarase Malic acid Nhốt tế bào trong carrageeman

Tanabe

Glucose Isomerase 6-7 triệu tấn

Lactase < 1000 t sirô lactose Hạt ceramic, trao đổi ion, sợi nylon

Corning Sumomoto

Lipatse Chuyển ester, thủy phân

Trao đổi ion celite Novo Unillever

Nitrilase 6000 t acrylamide Nhốt tế bào trong polyacrylamide

Nitto

RNAase >500 t RNA Thủy tinh, cellulose hoạt hóa, Eugergit

VR China, Japan Rohm Penicillin G amidase 4500 t 6-amino- penicillanic Eupergit Rohm Beecham Penicillin V amidase 500 t Polyacrylamide, sợi nylon Toyo Jozo Boehringer Novo

26

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 3.1. Thiết bị và hóa chất 3.1.1. Thiết bị  Bể ổn nhiệt  Cân phân tích  Máy ly tâm  Máy quang phổ UV  Máy lắc nuôi cấy  Nồi khử trùng  Máy đo pH  Tủ sấy  Ống nghiệm  Bình tam giác  Phễu lọc, giấy lọc  Đũa khuấy

 Pipet man các loại

 Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 500ml  Gía đựng ống nghiệm  Ống đong 100ml, 250ml  Xi lanh  Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-rad, Mỹ  Các dụng cụ chạy điện di  Tủ lạnh

27

Hình 3.1 Máy đo pH Hình 3.2 Cân phân tích

28 Hình 3.5 Bể ổn nhiệt 3.1.2. Hóa chất  Triton X-100  Tween-20  Tweeen-80

Sodium carboxymethyl cellulose  Coomassie Brilliant Blue

 Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 960, muối ammonium sulphate, acetone

 Dung dịch đệm phosphate: NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4  Hóa chất xác định hàm lượng protein: Thuốc thử Bradfosd  CaCl2 0,02M

29

3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô (quy mô công nghiệp)

↓ (Trộn tỷ lệ nước) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

3.2.1. Thuyết minh quy trình

Chủng nấm Trichoderma Reesei được nuôi cấy trên môi trường BM:CM (bã mía:cám mì), sau quá trình nuôi cấy ta thu được chế phẩm enzyme thô từ môi trường.

Cân 5 g chế phẩm enzyme thô cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 20 ml nước cất. Chế phẩm Dịch Khuấy Lọc Thu Dịch Ly tâm (8000 vòng/p) Dịch

Tủa (bằng : cồn, aceton, muối amoni sunfat)

Ly tâm

Enzyme thô

30

Khuấy đều dịch enzyme trong khoảng thời gian 30 phút (có thể khuấy trong khoảng thời gian 40, 50 phút, nhưng khoảng thời gian khuấy 30 phút là phù hợp nhất).

Lọc lấy dịch chiết được thể tích khoảng 17,5 ml. Đem dịch lọc được đi ly tâm.

Thu dịch ly tâm.

Tủa dịch ly tâm (bằng cồn, acetone, hoặc muối amoni sulphate), trong trường hợp này ta tủa dịch ly tâm bằng cồn 960, với tỷ lệ 1:3, tức là: 17,5 ml dịch chiết enzyme thô với 52,5 ml cồn 960.

Tách lấy phần tủa ở dưới đem đi ly tâm.

Thu dịch ly tâm đem cân phân tích thu được khoảng 20,1g enzyme thô. Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme cellulase ở 400 C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương).

Sau đó ta đem enzyme thô đi tinh sạch bằng quá trình lọc gel hay sử dụng phương pháp cố định enzyme để thu được enzyme cellulase thành phẩm.

31

Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm

3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase

3.3.1. Xác định hàm lượng enzymecellulase theo phương pháp Bradford

 Các Protein khi phản ứng xanh với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue- CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.

 Hóa chất, thiết bị:

- Dung dịch mẫu enzyme cellulase cần xác định.

- Dung dịch albumine 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumin pha trong 100ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200 C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumine có nồng độ 0.01mg/ml.

- Dung dịch thuốc thử Bradford:

32  Ethanl tuyệt đối: 4,7g  Acid phosphoric 85%: 8.5g

Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.

- Thiết bị: Máy quang phổ  Lập đồ thị chuẩn

Để dung dich albumin chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau:

Bảng 3.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn

Ống số 1 2 3 4 5 6

Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50

Dung dich albuine(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5

Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2

Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại 2, 3, 4, 5, 6 các ống cách nhau 1 phút.

Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành 1 cách tương tự như trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn. Đo ở bước sóng 595nm.

 Tính kết quả

Trị số mật độ quang (OD) của những ống chứng (ống 2 đến ống 6) sau khi trừ đi trị số của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml). Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml).

33

Tổng hàm lượng protein trong M (g) chế phẩm thô được tính theo công thức:

mg protein = b x 10-3 x m x M

Với:

b: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (µg/ml) m: hệ số pha loãng

M: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g)

3.3.2. Xác định hoạt tính enzyme cellulose bằng phương pháp đường chuẩn glucose

Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5,0 và 400 C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540 nm.

 Dụng cụ, thiết bị - Máy ly tâm.

- Bộ ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy Vortex, pH kế, cân phân tích. - Bếp điện.

- Chậu nước lạnh. - Que khuấy thủy tinh.  Hóa chất

- Cồn 960 .

- Sodium acetate. - NaOH 1N.

34

Bảng 3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase

Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 Ml dd DNS-Lactose 2 2 2 2 2 2 2 Ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm.