Cho đến năm 1979, người ta còn rất hy vọng có thể áp dụng công nghệ này cho tất cả các loại enzyme. Tuy nhiên đánh giá thực sự cho thấy hiện mới chỉ có 2 công nghệ sử dụng glucose isomerase và penicillin amidase cố định là có hiệu quả. Hiện tại enzyme amino acid acyclase, aspartase, fumarase cũng đã bắt đầu được ứng dụng thực tiễn (chủ yếu là ở Nhật).
25
Bảng 2.2 Một số enzyme cố định đang được sử dụng trong sản xuất Enzyme cố định Sản lượng
(tấn/năm)
Phương pháp cố định
Hãng sản xuất
Aminoacid acylase 1000 t DEAE sepharose Reactor màng Eupergit
Tanabe Degussa Rohm Aminoglucosidase 5000 t sirô glucose Than hoạt tính Tate % Lyle Aspartate 1000 t Nhốt tế bào trong
carrageeman
Tanabe
Furmarase Malic acid Nhốt tế bào trong carrageeman
Tanabe
Glucose Isomerase 6-7 triệu tấn
Lactase < 1000 t sirô lactose Hạt ceramic, trao đổi ion, sợi nylon
Corning Sumomoto
Lipatse Chuyển ester, thủy phân
Trao đổi ion celite Novo Unillever
Nitrilase 6000 t acrylamide Nhốt tế bào trong polyacrylamide
Nitto
RNAase >500 t RNA Thủy tinh, cellulose hoạt hóa, Eugergit
VR China, Japan Rohm Penicillin G amidase 4500 t 6-amino- penicillanic Eupergit Rohm Beecham Penicillin V amidase 500 t Polyacrylamide, sợi nylon Toyo Jozo Boehringer Novo
26
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 3.1. Thiết bị và hóa chất 3.1.1. Thiết bị Bể ổn nhiệt Cân phân tích Máy ly tâm Máy quang phổ UV Máy lắc nuôi cấy Nồi khử trùng Máy đo pH Tủ sấy Ống nghiệm Bình tam giác Phễu lọc, giấy lọc Đũa khuấy
Pipet man các loại
Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 500ml Gía đựng ống nghiệm Ống đong 100ml, 250ml Xi lanh Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-rad, Mỹ Các dụng cụ chạy điện di Tủ lạnh
27
Hình 3.1 Máy đo pH Hình 3.2 Cân phân tích
28 Hình 3.5 Bể ổn nhiệt 3.1.2. Hóa chất Triton X-100 Tween-20 Tweeen-80
Sodium carboxymethyl cellulose Coomassie Brilliant Blue
Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 960, muối ammonium sulphate, acetone
Dung dịch đệm phosphate: NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4 Hóa chất xác định hàm lượng protein: Thuốc thử Bradfosd CaCl2 0,02M
29
3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô (quy mô công nghiệp)
↓ (Trộn tỷ lệ nước) ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
3.2.1. Thuyết minh quy trình
Chủng nấm Trichoderma Reesei được nuôi cấy trên môi trường BM:CM (bã mía:cám mì), sau quá trình nuôi cấy ta thu được chế phẩm enzyme thô từ môi trường.
Cân 5 g chế phẩm enzyme thô cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 20 ml nước cất. Chế phẩm Dịch Khuấy Lọc Thu Dịch Ly tâm (8000 vòng/p) Dịch
Tủa (bằng : cồn, aceton, muối amoni sunfat)
Ly tâm
Enzyme thô
30
Khuấy đều dịch enzyme trong khoảng thời gian 30 phút (có thể khuấy trong khoảng thời gian 40, 50 phút, nhưng khoảng thời gian khuấy 30 phút là phù hợp nhất).
Lọc lấy dịch chiết được thể tích khoảng 17,5 ml. Đem dịch lọc được đi ly tâm.
Thu dịch ly tâm.
Tủa dịch ly tâm (bằng cồn, acetone, hoặc muối amoni sulphate), trong trường hợp này ta tủa dịch ly tâm bằng cồn 960, với tỷ lệ 1:3, tức là: 17,5 ml dịch chiết enzyme thô với 52,5 ml cồn 960.
Tách lấy phần tủa ở dưới đem đi ly tâm.
Thu dịch ly tâm đem cân phân tích thu được khoảng 20,1g enzyme thô. Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme cellulase ở 400 C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương).
Sau đó ta đem enzyme thô đi tinh sạch bằng quá trình lọc gel hay sử dụng phương pháp cố định enzyme để thu được enzyme cellulase thành phẩm.
31
Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm
3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase
3.3.1. Xác định hàm lượng enzymecellulase theo phương pháp Bradford
Các Protein khi phản ứng xanh với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue- CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
Hóa chất, thiết bị:
- Dung dịch mẫu enzyme cellulase cần xác định.
- Dung dịch albumine 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumin pha trong 100ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200 C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumine có nồng độ 0.01mg/ml.
- Dung dịch thuốc thử Bradford:
32 Ethanl tuyệt đối: 4,7g Acid phosphoric 85%: 8.5g
Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.
- Thiết bị: Máy quang phổ Lập đồ thị chuẩn
Để dung dich albumin chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau:
Bảng 3.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn
Ống số 1 2 3 4 5 6
Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50
Dung dich albuine(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2
Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại 2, 3, 4, 5, 6 các ống cách nhau 1 phút.
Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành 1 cách tương tự như trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn. Đo ở bước sóng 595nm.
Tính kết quả
Trị số mật độ quang (OD) của những ống chứng (ống 2 đến ống 6) sau khi trừ đi trị số của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml). Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml).
33
Tổng hàm lượng protein trong M (g) chế phẩm thô được tính theo công thức:
mg protein = b x 10-3 x m x M
Với:
b: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (µg/ml) m: hệ số pha loãng
M: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g)
3.3.2. Xác định hoạt tính enzyme cellulose bằng phương pháp đường chuẩn glucose
Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5,0 và 400 C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540 nm.
Dụng cụ, thiết bị - Máy ly tâm.
- Bộ ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy Vortex, pH kế, cân phân tích. - Bếp điện.
- Chậu nước lạnh. - Que khuấy thủy tinh. Hóa chất
- Cồn 960 .
- Sodium acetate. - NaOH 1N.
34
Bảng 3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase
Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 Ml dd DNS-Lactose 2 2 2 2 2 2 2 Ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm.
Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) - Ống nghiệm 1: Chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0.
Hút 1ml dung dịch đệm Na-acetac 50Mm, pH 5.0 cho vào ống nghiệm. Thêm 2ml dung dịch DNS-Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chưa enzyme và lắc đều.
Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm bằng 0.
- Ống nghiệm 2: Phản ứng enzyme
Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 400 C/5 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400 C/5 phút. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Để phản ứng ở 400 C chính xác 10 phút.
Thêm 2ml dung dịch DND-Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme.
Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
35 - Ống nghiệm 3: Không có phản ứng enzyme
Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi từ 5 đến 10 phút để bất hoạt enzyme.
Thêm 2ml dung dịch DNS-Lactose và lắc đều.
Thêm 1ml dung dịch CMC 1% chứa dung dịch enzyme và lắc đều.
Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
Định lượng đơn vị hoạt tính
Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng đường khử như glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng.
3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường, độ ẩm, thời gian, nhiệt độ tối ưu, độ pH tối ưu pH tối ưu
3.4.1. Nghiên cứu thành phần môi trường
Chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm với các thành phần môi trường tương ứng như sau.Cố định thành phần cám 75% và thành phần (NH4)2SO4 1%, thay đổi thành phần trấu. Trấu là tác nhân kích thích sinh tổng hợp cellulase. Ta có bảng thành phần môi trường thí nghiệm được bố trí như sau.
Bảng 3.3 Thành phần môi trường thí nghiệm theo phần trăm
Đơn Vị Tính Phần Trăm (%) Môi Trường Số 1 2 3 4 5 6 Cám 75 75 75 75 75 75 Trấu 22 20 18 16 14 12 (NH4)2SO4 1 1 1 1 1 1
Thêm nước điều chỉnh độ ẩm 60%. Cấy giống vào và nuôi cấy ở nhiệt độ phòng khoảng 28-300C. Thời gian khảo sát đối với Trichoderma.viride là 72 giờ. Sau đó xác
36
định hoạt tính enzyme cellulase (đối với Trichoderma.viride) bằng cách đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 540 nm cho cellulase.
Trong thành phần môi trường nhân giống, chúng tôi cố định hàm lượng cám và muối sunphat amôn ((NH4)2SO4), thay đổi thành phần trấu . Trấu là tác nhân làm cho môi trường thoáng xốp, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tốt. Ban đầu nấm mốc sẽ tận dụng những chất dễ tiêu trong môi trường như các loại đường nhưng khi môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt thì nấm mốc phải tiết ra những enzyme để phân hủy cơ chất khác thành đường để tiếp tục tồn tại và phát triển. Tuy nhiên, cũng tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất nhiều hay ít mà nấm mốc sẽ tiết ra lượng enzyme khác nhau. Sự tổng hợp của enzyme còn phụ thuộc vào khả năng tiết tối đa của từng loại vi sinh vật có nghĩa là nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt quá một giới hạn nhất định thì hoạt tính enzyme sẽ giảm do 2 nguyên nhân, thứ nhất do cơ chất tạo áp lực làm giảm quá trình sinh tổng hợp, thứ hai do cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tối đa không đổi làm hoạt tính enzyme giảm.
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian
Kết quả của thí nghiệm trên được áp dụng để tiếp tục cho thí nghiệm này. Sau khi chọn được môi trường tốt nhất cho sinh tổng hợp enzyme cellulase (đối với
Trichoderma. viride), ta tiến hành bố trí thí nghiệm nuôi cấy nấm mốc và lấy mẫu ở các thời điểm khác nhau. Thời gian khảo sát từ 28 – 32 – 36 – 40 – 44 – 48 – 52 giờ, giữ nguyên độ ẩm 60%.
Khi cấy nấm mốc vào môi trường, chúng sẽ không tiết ngay ra enzyme mà sẽ tiết kiệm năng lượng đến mức tối đa và sử dụng ngay những chất dễ sử dụng nhất là các đường đơn, khoáng chất có sẵn. Sau đó chúng sẽ tiết ra enzyme tùy vào thành phần các chất có trong môi trường. Nấm mốc phát triển được chia ra thành 4 giai đoạn như sau: thích nghi, phát triển, cân bằng và tử vong. Ở giai đoạn thích nghi và phát triển, nấm mốc sẽ tìm cách thích nghi và tiết ra loại enzyme nào và số lượng bao nhiêu để
37
có thể tồn tại và phát triển. Theo thời gian thì lượng enzyme tiết ra sẽ tăng dần và đến một mức độ ổn định, sau đó sẽ giảm đi khi môi trường dinh dưỡng cạn kiệt dần.
Quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase cũng tăng tương ứng theo thời gian. Ở
Trichoderma. viride, thời gian tăng trưởng chậm hơn nhưng tạo ra hệ enzyme cellulase
rất tốt. Sản phẩm của hệ enzyme cellulase là cellobiose, một chất kìm hãm hoạt tính của exo - β -glucanase.
Do đó mà quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase ở Trichoderma. viride tăng trưởng mạnh trong khoảng thời gian từ 4 ngày.
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng củađộ ẩm
Cũng giống như thí nghiệm trên, những kết quả khảo sát được áp dụng như thành phần môi trường và thời gian cho thí nghiệm này. Thay đổi độ ẩm theo các giá trị như sau: 50% - 54% -68% - 62% - 66% - 70%.
Các quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc đều có liên quan đến độ ẩm. Độ ẩm là yếu tố quan trọng trong môi trường. Nếu độ ẩm quá thấp thì xảy ra hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào nấm mốc và làm cho tế bào bị chết. Điều này sẽ làm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Nếu độ ẩm quá cao thì cũng không tốt cho sự sinh trưởng và phát triển. Ở một độ ẩm nhất định, khi đó hoạt động trao đổi chất diễn ra tốt nhất thì sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc sẽ diễn ra tốt nhất. Ở môi trường thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy ở độ ẩm 58% thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase có hoạt tính cao nhất ở Trichoderma. viride.
Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy để nấm mốc sinh trưởng và phát triển tốt và sản sinh ra từng loại enzyme cực đại thì tùy thuộc vào từng loại giống mà chúng ta bố trí độ ẩm thích hợp.
3.4.4 Xác định độ pH tối ưu
Để xác định pH phản ứng tối ưu cho phản ứng xúc tác của enzyme nghiên cứu, dịch enzyme tinh sạch (0.002 mg protein) được ủ với cơ chất CMC pha trong đệm 100 mM sodium acetate, pH từ 3.5-5.5 và 100 mM potassium phosphate, pH từ 6.0-8.0,
38
hỗn hợp phản ứng được ủ ở 500C trong 20 phút. Để đánh giá độ bền pH của enzyme nghiên cứu, trước hết cellulase (0.002 mg protein) được ủ trong các đệm có pH thay đổi trong khoảng 3.5-8.0, trong 2 giờ ủ ở 370 C. Sau đó, chọn ra khoảng pH thích hợp để tiếp tục xác định độ bền pH theo thời gian: 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ. Tốt nhất ở pH 5.0.
3.4.5. Xác định nhiệt độ tối ưu
Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu, chủng nấm nghiên cứu được nuôi trong môi trường: urea: 0.3, (NH4)2SO4: 1.4, KH2PO4: 2.0, CaCl2: 0.3, MgSO4.7H2O: 0.3, peptone: 1, cao nấm men: 10, tween 80: 1, CMC: 10, các yếu tố vi lượng: 0.1% (v/v) bao gồm các muối: FeSO4: 18 mM, MnSO4: 6.6 mM, ZnSO4: 4.8 mM, CoCl2: 15 mM, pH: 7.0 cơ bản cho sinh tổng hợp cellulase, lắc 200 vòng/phút ở 250C, 280C; 300C, 320C và 370C, pH 7.0. Dịch canh trường được thu sau 96 giờ nuôi cấy và xác định hoạt tính cellulase, tốt nhất ở 300 C.
3.5. Khảo sát tác nhân trợ tủa
3.5.1. Tủa protein-enzyme bằng muối, dung môi hữu cơ hoặc polymer
Thường được sử dụng như là bước tinh sạch đầu tiên, bởi chúng có độ chọn lọc không cao, dễ thay đổi. Ở nồng độ muối thấp, độ hòa tan của protein tăng với nồng độ muối gia tăng, gọi là staling in. Khi nồng độ muối tăng cao hơn, thì độ hòa tan của