Phễu đổ gel
Bình hút chân không
Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1,5 cm, thể tích 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3,14 (π) = 30 x (1.5/2)2 x 3,14 .
Bình đựng dung dịch đệm Ống nghiệm: 20 cái
Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch.
3.7.1.2. Hóa chất
Gel “Sephadex G-100”, có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90 µm, khả năng ngậm nước: 12ml/1 g gel khô, phạm vi phân tách: 5.000-100.000 Daltons. Đệm Acetate 50 Nm, pH 5.0: khử bọt khí trước khi dùng
3.7.1.3. Tinh sạch enzyme
Dịch enzyme sau khi được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100 với tổng thể tích 10 ml. Cột có
42
kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM potassium phosphate, pH 7.5. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích
mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.
Dịch enzyme sau khi qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, chọn những phân đoạn có hoạt tính endo- β -1,4-glucanase cao được đưa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Cột có kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, thôi mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy là 3320 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định cho mỗi phân đoạn. Quá trình tinh sạch endoglucanase có thể được tóm tắt như sơ đồ:
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Dịch enzyme thô Ly tâm 10000 vòng/10 phút Dịch trong Cột Sephadex G100 Cột DEAE Enzyme tinh sạch
43