Khảo sát quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichoderma Reesei

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đê Hiện nguồn phế thải hữu các nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm thải là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose Cellulose có thể bị thủy phân môi trường kiềm hoặc axit Tuy nhiên việc phân hủy cellulose phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn và gây độc hại cho môi trường Trong đó, việc xử lý các chất thải hữu chứa cellulose công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có điều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và số trường hợp, các nhà khoa học thấy cả nấm men tham gia qúa trình phân giải này Vì nếu ta sản xuất lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phí thấp thì ta có thể tận dụng nguồn phế thải lớn từ các nhà máy chế biến thực phẩm như: bã mía, trấu, rơm rạ, mạt cưa…góp phần vào bảo vệ môi trường và cung cấp lượng lớn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến thực phẩm Nấm Trichoderma spp diện gần tất cả các loại đất và số môi trường sống khác Chúng diện với mật độ cao và phát triển mạnh vùng rễ của cây, số giống có khả phát triển rễ Những giống này có thể bổ sung vào đất hay hạt giống nhiều phương pháp Ngay chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào giống Các nhà khoa học đã thành công việc phân lập chủng nấm Trichoderma Reesei KY-746 để tổng hợp nên enzyme cellulase cách có hiệu quả nhất mà giá thành lại rẻ Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Xuất phát từ thực tế này với sự hướng dẫn của kỹ sư Huỳnh Văn Thành đã thực khóa luận này: “Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei” 1.2 Mục tiêu đê tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát  Quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trihoderma Reesei  Cố định enzyme cellulase Natrialginate 1.2.2 Mục tiêu cụ thê  Thu nhận enzyme cellulasse từ nấm Trichoderma Reesei  Xác định tỷ lệ tủa tối ưu của các tác nhân tủa: Muối ammonium, cồn, aceton  Xác định nhiệt độ, pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme cellulase  Cố định enzyme cellulase Natrialginate  Tinh sạch enzyme cellulase Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào Mặc dù có nhiều loại vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase, có số ít vi sinh vật là có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase với số lượng lớn Sau là kết quả nguyên cứu các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase Bảng 2.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào Hoạt tính STT Tên chủng B26 B505 CFd CFh MSM 04 MSM 11 Li A-62 Y-519 10 Y-529 11 Y-32 12 F273 13 708 14 1’ 15 V2 16 V3 17 V4 (-): chưa phân loại Tên phân loại Bacillus subtilis Bacillus subtilis Bacillus lichenformis Streptomyces sp Sarcharomyces Thuộc nhóm celulase (unit/ml) 5,20 9,95 7,71 1,45 0,90 0,92 9,76 0,90 Vi khuẩn Xạ khuẩn 1,35 fibuligera Sarcharomyces 2,67 fibuligera Sarcharomyces Nấm men 1,81 capsularis Aspergillus niger Tricoderma konigii - 1,08 0,89 1,32 0,93 1,10 1,07 Nấm mốc Nấm sợi - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 2.2 Giới thiệu Trichoderma reesei 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu về Trichoderma Gần 200 năm về trước, Trichoderma phát và loài biết là Trichodermaviride Hơn 150 năm sau, Trichoderma là đối tượng của vài nhà phân loại nấm học không hấp dẫn mối quan tâm của các ngành khoa học khác Tình hình thay đổi thế chiến lần thứ II, quân đội Mỹ cảnh báo về tượng các trang bị quân sự bị mục xứ nhiệt đới, đặc biệt là Nam Thái Bình Dương Chương trình điều tra của quan đội Mỹ Trichoderma"viride" mã số QM 6a là loài nấm phân hủy cellulose khu vực này Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến chủng Trichoderma QM 6a này nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người đã khám phá loài này là Elwyn T.Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến chủng Nhờ những công trình mà nhiều phòng thí nghiệm khác Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma vào cuối thập niên 60 Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster Anh lần phân loại và mô tả loài Trichoderma, việc nuôi cấy dể dàng và không tốn các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu vào các hướng nghiên cứu bản là nghiên cứu ứng dụng về phân giải cellulose của chúng Một phát quan trọng nghiên cứu về Trichoderma là khả kích thích tăng trưởng cho trồng và khả đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma dùng là tác nhân kiểm soát sinh học nông nghiệp Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thế giới Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Hình 2.1 Ảnh nhìn qua kính hiển vi vê sợi tơ phát triển dòng nấm Tricoderma reesei Trong hình, các protein các tế bào nấm đánh dấu màu đỏ chất chitin – thành phần của các thành tế bào – đáng dấu màu xanh dương (Ảnh: Mari Valkonen, VTT Finland) 2.2.2 Nuôi cấy Trichoderma reesei môi trường bã mía kết hợp cám mi Trichoderma reesei VTT-D-80133 sinh trưởng môi trường bán rắn với chất bã mía kết hợp với cám mì Tỷ lệ BM:CM (7:3), lần nồng độ dinh dưỡng, độ ẩm ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy ngày là tối ưu cho Trichoderma reesei VTT-D80133 sinh tổng hợp cellulase môi trường lên men bán rắn 2.2.3 Hinh thái của nấm Trichoderma reesei Trichoderma là loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính đính bào tử từ khuẩn ty Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, cuối nhánh phát triển thành khối tròn mang các bào tử trần vách ngăn, không màu, liên kết thành chùm nhỏ đầu cành nhờ chất nhầy Bào tử hình cầu, hình Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh elip hoặc hình thuôn Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm Hình 2.2 Hình thái Trichoderma Reesei 2.2.4 Đặc điêm Nấm Trichoderma spp diện gần tất cả các loại đất và số môi trường sống khác, chúng là loại nấm nuôi cấy thông dụng nhất Nấm Trichoderma diện với mật độ cao và phát triển mạnh vùng rễ của cây, số giống có khả phát triển rễ, những giống này có thể bổ sung vào đất hay hạt giống nhiều phương pháp Nấm Trichoderma chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào giống Vì vậy, dùng xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất phát triển bề mặt rễ cả rễ phát triển dài 1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tại và hiệu lực cho đến 18 tháng sau sử dụng, nhiên không nhiều giống có khả này Ngoài sự hình thành khuẩn lạc rễ, nấm Trichoderma tấn công, ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, và Trichoderma sở hữu nhiều chế cho việc tấn công Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh các loài nấm gây bệnh chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triển của Nhiều phương pháp mới kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh trưởng của đã chứng minh rõ ràng Quá trình này điều khiển nhiều gen và sản phẩm từ gen khác Sau là số chế chủ yếu: Ký sinh nấm, kháng sinh, cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian, sự chịu đựng các điều kiện bất lợi việc gia tăng sự phát triển của và rễ, làm hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ, cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào là chế sinh sản vô tính Tuy nhiên, có số giống sinh sản hữu tính đã ghi nhận những giống này không thích hợp để sử dụng các phương pháp kiểm soát sinh học Phương pháp phân loại truyền thống dựa sự khác về hình thái chủ yếu là phận hình thành bào tử vô tính, gần nhiều phương pháp phân loại dựa cấu trúc phân tử đã sử dụng Hiện nấm Trichoderma có ít nhất là 33 loài Hình 2.3 Cấu trúc không gian nấm Trichoderma reesei 2.2.5 Ứng dụng 2.2.5.1 Lương thực ngành dệt Trichoderma là những vi sinh vật sản xuất nhiều enzyme ngoại bào có hiệu quả cao Chúng thương mại hóa việc sản xuất enzyme cellulase và các enzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp Nhờ chúng thường sử dụng Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh công nghiệp chế biến thực phẩm và ngành công nghiệp dệt cho các mục đích tương tự 2.2.5.2 Chất kiểm soát sinh học Hiện loài nấm này đã sử dụng cách hợp pháp đăng ký việc kiểm soát bệnh thực vật Các chế phẩm nấm Trichoderma sản xuất và sử dụng là chất kiểm soát sinh học cách có hiệu quả Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc phối trộn vào phân hữu để bón cho trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho vừa tăng khả kháng bệnh của 2.2.5.3 Kích thích tăng trưởng trồng Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã biết đến từ nhiều năm qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật việc kích thích sự hình thành nhiều và phát triển mạnh của rễ so với thông thường Những chế giải thích cho các tượng này mới hiểu rõ ràng thời gian gần Hiện nay, giống nấm Trichoderma đã phát là chúng có khả gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu m dưới mặt đất) Những rễ sâu này giúp các loài như: bắp hay cảnh có khả chịu hạn hán Một khả có lẽ đáng ý nhất là những bắp có sự diện của nấm Trichoderma dòng T22 rễ có nhu cầu về đạm thấp đến 40% so với những sự diện của loài nấm này rễ 2.2.5.4 Nguồn gen để sử dụng chuyển gen Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa số lượng lớn gen mã hoá các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng kiểm soát sinh học Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã tạo dòng và có tiềm ứng dụng rất lớn chuyển gen để tạo có khả kháng nhiều bệnh Chưa có gen nào thương mại hóa, nhiên có số gen nghiên cứu và phát triển 2.2.5.5 Biện pháp canh tác hữu Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Hiện nay, việc bón phân hữu cho cao su chưa bà nông dân trọng dẫn đến mất cân sinh thái môi trường đất Hệ vi sinh vật suy giảm đã làm cho nấm bệnh, đặc biệt là nấm Corynespora cassiicola có điều kiện phát triển và phát tán rất nhanh mùa mưa Vì vậy, việc bón phân hữu là những giải pháp quan trọng cần quan tâm thúc đẩy Trong bệnh vàng lá, rụng lá có chiều hướng lây lan nhanh việc bón phân hữu có chứa nấm đối kháng Trichoderma là giải pháp rất hữu hiệu Ngoài việc giúp cho rễ phát triển, đất giữ ẩm tốt, đồng thời nấm đối kháng Trichoderma tấn công các mầm bệnh corynespora và các loai nấm bệnh khác có đất Việc phun các chế phẩm sinh học có chứa Trichoderma lên tán là giải pháp rất tốt nhằm đưa các bào tử nấm đối kháng phát tán rộng rãi môi trường của vườn cao su tạo nên hệ thống phòng thủ hữu hiệu lâu dài Qua nhiều kết quả thực tiễn cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium, nấm Trichoderma đã khuyến cáo sử dụng rộng rãi sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng những năm qua Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Hình 2.4 Ủ phân hữu có sử dụng nấm đối kháng Trichoderma 2.3 Giới thiệu sơ lược vê enzyme Enzyme hay gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzyme có thể sinh vật, không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định thể sinh vật (invivo) mà xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (invitro) Vì có nguồn gốc từ sinh vật enzyme thường gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy điều kiện thường ngoài thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) thể xảy hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…) 10 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 4.2 Đê nghị Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn các dòng nấm Trichoderma Reesei bị đột biến xem dòng nào mang lại hiệu quả sản xuất enzyme cellulase là cao nhất, mà giá thành sản xuất lại ít tốn Ngoài chủng nấm Trichoderma Reesei ra, thì nên tiến hành khảo sát thêm khả sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm mốc khác : Bacillus subtilis, Apergilus, vi khuẩn, xạ khuẩn…xem khả tổng hợp enzyme cellulase của chủng nào là mạnh nhất, mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất Tận dụng và xử lý có hiệu quả nguồn phế thải hữu từ các nhà máy : mạt cưa, bã mía, cám mì, bã đậu nành Nó không góp phần vào bảo vệ môi trường mà tạo lượng lớn enzyme cellulase ứng dụng công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất bột giặc, dược phẩm… Bên cạnh ứng dụng của các chủng nấm để sản xuất enzyme cellulase thì ta nên nghiên cứu thêm nhũng ứng dụng khác của chủng nấm để phục vụ cho khoa học, đời sống hàng ngày TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Phạm Thị Ánh Hồng, Kỹ thuật sinh hóa, nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh,113 - 114, 2003 [2] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 1- Thí nghiệm hóa sinh học, nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 128 129, 2003 [3] Lê Hồng Phú, Nghiên cứu sinh tổng hợp Enzyme Pectinase và Cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê sản xuất phân hữu cơ, Luận 51 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh văn thạc sĩ ngành sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, 2003 [4] Nguyễn Văn Tuân, tuyển chọn nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất của Endo-β-1,4-glucanase, luận văn Thạc sĩ Khoa Học Sinh Học, Trường Đại Học Thái Nguyên [5] Trần Thạnh Phong, Hoàng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phượng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Thu nhận enzyme cellulase của Trichoderma Reesei môi trường bán rắn, Viện Sinh Học Nhiệt Đới-Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam [6] PGS TS Nguyễn Tiến Thắng, Giaó trình công nghệ Enzyme, TP HCM 2010 Tài liệu tiếng anh Okada G., The growth of Trichoderma viride on media containing cotton fibres, J Biochem, trang 591 – 607, 1963 Ruy D.D.Y And Mandels M – Cellulase, Biosynthesis and applications - Enzyme Microbiology Technology, 1980 Gary J Samuels, Trichoderma a guide to identification and biology Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA, 2004 Science & Technology Development, Vol 12, No.13 – 2009 52 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh PHỤ LỤC Phụ lục A Bảng 1.1: Đại diện vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase Vi Sinh Vật Acremonium cellulolyticus Aspergillus acculeatus Vi Khuẩn Actinomycetes Nấm Chrysosporium Thermoactinomyces sp Actinomycetes Schizophyllum xã Thermomonospora curvata Aspergillus fumigates Aspergillus niger Sclerotium rolfsii Sporotrichum 53 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh cellulophilum Talaromyces emersonii Thielavia terrestris Trichoderma koningii Trichoderma reesei Trichoderma viride Fusarium solani Irpex lacteus Penicillium funmiculosum Phanerochaete Clostridium thermocellum Ruminococcus albus Streptomyces sp Phụ lục B Môi trường nuôi cấy các chủng Vi Sinh Vật Môi trường nuôi cấy: Môi trường (MT) nuôi cấy vi khuẩn: CMC 1%, peptone 0,05%, cao thịt 0,1%, NaCl 0,1%) MT nuôi cấy xạ khuẩn: CMC 1%, tinh bột 0,1%, cao nấm men 0,02% MT nuôi cấy nấm sợi: CMC 1%, cao malt 0.02% MT nuôi cấy nấm men: CMC 1%, glucose 0,1%, peptone 0,05%, cao nấm men 0,03%, cao malt 0,03% MT nuôi cấy các chủng vi sinh vật sinh cellulase sưu tập từ phòng thí nghiệm của trường Đại học khoa học Tự nhiên: CMC 1%, tinh bột 0,1%, MgSO4 0,02 %, NaHCO3 0.02%, K2HPO4 0,5%, CaCl2 0.02%, NaCl 0,02%, peptone 0,02% Môi trường AN: KH2PO4 0,1g, NaNO3 0,3g, MgSO4 H2O 0,05g, KCl 0,05g, FeSO4 7H2O 0,01g, Cao bắp 0,5g, giấy lọc 2g, nước cất 1l MT Zapek, Cell Phụ lục C Gel “Biogel-P-“Hãng Bio-Rad C.1.Giới thiệu Các loại gel “Bio-Gel P” là các hạt polyacrylamide tạo lỗ, điều chế quá trình đồng hóa polymer hóa acrylamide và N, N’ –methylene-bis-acrylamide Các gel này rất ưa nước và không mang điện tính, giúp việc lọc các hợp chất nhạy cảm qua gel đạt hiệu quả Độ phân giải cao xác định yếu tố (1) sự phân bố hẹp và consistent của đường kính hạt, (2) sự phân tách tốt theo trọng lượng phân tử Gel “Bio-Gel P” thích hợp với các acid hữu yếu, urê 8M, guanidine 6M, các tác nhân chatropic, các tác nhân khử dithiothreitol và mercaptoethanol, các tác 54 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh nhân tẩy SDS, CHAPS, và Triton X-100, Bio-Gel P có thể dùng với nước cất, nhiên các dung dịch đệm có cường độ ion > 50Mm mang lại hiệu quả phân tách protein tốt nhất Có thể cho dung môi hữu miscible vào chất giải hấp dùng với gel “Bio-Gel P” Cồn (có thể đến 20%) không làm thay đổi đặc tính phân tách của gel, và vài trường hợp làm tăng quá trình phân tách các hỗn hợp phức tạp của các phân tử hòa tan nước các nucleotide, peptide, tamin Có thể dùng dung môi formamide cường độ mạnh vì gel “Bio-Gel P” swell hoàn toàn dung môi này Gel “Bio-Gel P” có thể khử trùng pH 5.5-6.0 các dung dịch đệm HEPES 50Mm, MES, hoặc citrate 120 C 15-30 phút Ở nhiệt độ phòng, phạm vi pH nên điều chỉnh từ đến 10 Gel “Bio-Gel P” nhạy cảm với sự thủy phân các nhóm amide pH cao hoặc thấp Tốc độ dòng và độ phân giải gia tăng nhiệt độ phạm vi 4-800 C C.2 Các thông số kĩ thuật Bảng 3.1 Các thông số sản phẩm gel “Bio-Gel-P” Thông Số Chất nền (Matrix) Kích thước hạt Trung bình Mịn Rất mịn Shipping medium Phạm vi hoạt pH Áp suất động tốt Các dung môi hữu Đặc Tính Gel-Bio-Gel polyacrylamide 90-180 µm 45-90 µm < 45 µm Shipped dry 2-10 15 psi < 200 C Phạm vi nhiệt độ 4-800 C vận hành Phạm vi nhiệt độ Khử trùng autoclave, pH 5.5-6.5 nhiệt độ 1200 C cho phép 30 phút 55 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Bảo quản Khô, nhiệt độ phòng, nước cất hoặc dung dịch đệm 40 C với sodium azide 0.02% Bảng 3.2 Các dặc tính gel “Bio-Gel P” Gel Phạm vi kích Thể tích nên Tốc độ dòng Phạm vi thước hạt, đã hydrated điển hình phân tách các hạt đã bị điển hình, (cm/hr) tiêu biểu/giới ngậm ml/g gel khô hạn phân nước(µM) tách thong thường Bio-Gel P-2 45-90 5.0-10 (Daltons) 100-1.800 < 10 100-1.800 15-20 800-4.000 10-15 800-4.000 < 10 800-4.000 Gel, mịn Bio-Gel P-2, < 45 rất mịn Bio-Gel P-4 90-180 Gel, trung bình Bio-Gel P-4 45-90 Gel, mịn Bio-Gel P-4 < 45 56 Khóa luận tốt nghiệp Gel, rất mịn Bio-Gel p-6 90-180 Gel, SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 6.5 15-20 1.000-6.000 10-15 1.000-6.000 < 10 1.000-6.000 trung bình Bio-Gel P-6 45-90 Gel, mịn Bio-Gel P-6 < 45 Gel, rất mịn Bio-Gel P- 90-180 6.5 15-20 1.000-6.000 6DG Gel Bio-Gel P-10 90-180 7.5 15-20 1.500-20.000 10-15 1.500-20.000 15-20 2.500-40.000 10-15 2.500-40.000 15-20 3.000-60.000 10-15 3.000-60.000 15-20 5.000-100.000 10-15 5.000-100.000 Gel, trung bình Bio-Gel P-10 45-90 Gel, rất mịn Bio-Gel P-30 90-180 Gel, trung bình Bio-Gel P-30 45-90 Gel, mịn Bio-Gel P-60 90-180 Gel, 11 trung bình Bio-Gel P-60 45-90 Gel, mịn Bio-Gel 100 P- 90-180 12 Gel, trung bình Bio-Gel P- 45-90 57 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 100 Gel, mịn  Lưu ý: Tốc độ dòng xác định cột 1.5 x 70 cm Phạm vi phân tách 40.000 daltons đối với các phân tử hình cầu Đối với mục đích kiểm soát chất lượng, giới hạn phân tách xác định cách tính giá trị Kd, hoặc hệ số phân bố Hệ số phân bố là giá trị thời gian lưu của phân tử các lỗ gel, biểu diễn sau: (Ve – Vo)/ (Vt – Vo) Trong đó: Ve là thể tích giải hấp (thể tích = elution volumn) Vo là thể tích trống (void volumn) Vt là thể tích tổng xác định phân tử nhỏ vitamin B12 C.3 Hướng dẫn sử dụng Bio-Gel P C.3.1 Chọn cột Kích thước cột lý tưởng là những kích thước cho phép phân giải vạch ranh giới các chất phân tích mà không cần pha loãng mẫu nhiều Điển hình, chiều dài cột so với tỷ lệ đường kính khoảng pH 5-10, và thể tích lớp nền (bed volumn) gấp 4-20 lần thể tích của mẫu Hệ số pha loãng tối thiểu có thể thu đối với chất đã tách (excluded substance) khoảng 1,25 Nhìn chung, đối với quá trình phân tách khó thì cần chiều dài lớp nền so với tỷ lệ đường kính là 25-100 hoặc lớn hơn, và thể tích lớp nền gấp 25-100 lần thể tích mẫu  Chọn chất tách Chất tách (chất giải hấp) là chất lỏng dùng để chiết chất khỏi chất khác sắc ký Chất tách chọn cần tạo tính ổn định tối đa cho các chất tan không ổn định mẫu Nồng độ ion ít nhất là 20mM để loại trừ ảnh hưởng của số lượng nhỏ các nhóm mang điện âm gel 58 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Việc sử dụng các dung dịch muối nồng độ cao có thể gây những thay đổi nhỏ thể tích lớp nền gel và giới hạn phân tách (exclusion limits) Bio-Gel P tương thích với các trạng thái hòa tan và làm biến tính (solubilizing and denaturing condition) sử dụng việc xác định trọng lượng phân tử guanidine-HCl 6M, các tác nhân chaotropic, các tác nhân khử dithiothreitol và mercaptoethanol, và các thuốc tẩy SDS, CHAPS, và Triton X-100 Có thể sử dụng các muối đệm dễ bay pyridine, acetic acid, ammonium formate hoặc ammonium bicarbonate nếu sản phẩm cuối cần phải trạng thái muối đệm Có thể loại các chất này khỏi phân đoạn dòng chảy (effluent fractions) dễ dàng đông khô Nên loại các khí hòa tan CO để ngăn chặn sự tạo bọt hệ thống Thực điều này cách hút dung dịch đệm lọ chân không vòi nước tạo chân không hoặc máy tạo chân không Nên tránh sử dụng các chất tách có pH 10 hoặc nhỏ để ngăn sự thủy phân gel Tránh dùng các tác nhân 0xy hóa mạnh vì các chất này phản ứng với gel và làm gia tăng hàm lượng các nhóm tích điện chất lớp  Chuẩn bi gel Cho từ từ môi trường Bio-Gel P vào dung dịch đệm đã đựng cốc mỏ (beaker) Có thể ước tính lượng gel Bio-Gel P cần cho vào cột có thể tích đã biết cách sử dụng bảng 2, bảng này cho biết thể tích lớp neenfkhi hydrat hóa Lưu ý sự mất gel suốt quá trình tiến hành công việc Dùng dung dịch đệm nhiều gấp lần so với thể tích lớp nền cần cho cột Đối với các gel từ Bio-Gel P-2 đến Bio-Gel P-10 cần hydrat hóa vòng giờ nhiệt độ phòng (1 giờ nếu dung dịch đệm đã làm nóng đến 100 C và rồi làm lạnh sau đã cho gel vào dung dịch đệm) Đối với các gel từ Bio-Gel P-30 đến Bio-Gel P-100 cần 12 giờ 200 C để hydrat hóa hoặc giờ nếu bắt đầu 100 C Sauk 59 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh hi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định suốt quá trình hydrat hóa Sau quá trình hydrat xảy hoàn toàn, gạn lớp bề mặt Chuyển dung dịch vào bình lọc và gắn với nguồn chân không Khử khí của dung dịch khoảng 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình Không dùng đũa khuấy vì có thể làm hư hại gel Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ bình Để gel ổn định cho đến 90-95% số hạt ổn định Gạn hoăc loại lớp bề mặt cách hút để loại các hạt mịn Lặp lại công việc lần để loại > 99% hạt mịn Cho cái phễu đỉnh cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột Rót đều chất pha trộn loãng (slurry) vào cột thành dòng di chuyển nhẹ Tránh làm bắn (tung tóe) chất pha trộn loãng để đảm bảo việc nhồi cột đều và để tránh việc bẫy các bọt khí Khi 2-5 cm lớp nền đã hình thàh, cho cột chảy cho đến cột nạp đầy (packed) Khi cột đã nạp đầy, đóng đầu (outlet) của cột và gắn flow adaptor Mở đầu của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy Đóng đầu của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel Nạp mẫu vào bề mặt lớp nền cách bơm hoặc tiêm mẫu vào lớp nền gel qua flow adaptor Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị Nếu không dùng flow adaptor thì lấy lớp gel thừa cho đến đạt chiều cao lớp nền mong muốn mà cột đã nạp xong và gắn cột vào reservoir Cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ 60 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh dòng chảy Rút dung dịch đệm xuống lớp nền gel và mẫu nằm lớp nền gel, sau cho thêm dung dịch đệm để lấy mẫu vào lớp nền Thay lớp dung dịch đệm bề mặt và gắn cột vào reservoir Thu các phân đoạn để phân tích hoặc theo dõi thiết bị dòng liên tục (continuous flow equipment) UV/Vis, các máy đo độ dẫn (conductivity) và số khúc xạ (refractive index)  Mẫu Lọc gel phần lớn độc lập với nồng độ mẫu thể tích mẫu tương ứng với thể tích lớp nền lại khá quan trọng Với mục đích phân tích, mẫu không nên lớn 1-5% thể tích lớp nền Với mục đích khử muối, mẫu có thể là 30-35% so với thể tích lớp nền Độ nhớt của mẫu có thể giới hạn nồng độ mẫu mà có thể sử dụng Mẫu có độ nhớt cao có thể pha loãng để là giảm độ nhớt Có thể đạt kết quả tốt cách áp dụng mẫu có độ nhớt cao tốc độ chảy thấp Mẫu cần sạch và hòa tan hoàn toàn dung dịch đệm chạy mà không bị nhiễm bẩn và các hạt rắn Lọc mẫu làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột Nếu vì tính chất của mẫu mà không thể đem lọc thì nên ly tâm mẫu cho đến sạch Trình bày ảnh hưởng theo giả thuyết về các điều kiện sắc kí khác  Xác đinh thể tích trống (void volumn) hiệu chuẩn (calibration) Thể tích trống (Void volumn) = Vo của lớp nền với thể tích phân tách (elution volumn = Ve) của các nguyên liệu đã phân tách Nên xác đinh thể tích chân không của lớp nền và nên kiểm tra tính đồng nhất của chất phân tách của lớp nền trước áp dụng mẫu thí nghiệm Các protein có màu hemoglobin, ferritin phù hợp với phương pháp xác định thể tích chân không này Dextran xanh không đề nghị xác đinh thể tích chân 61 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh không vì không đồng nhất (heterogeneous) và có thể cho những kết quả khác Nó có thể liên kết không dặc hiệu với gel Sử dụng các protein chuẩn cho phép kiểm tra viecj nạp cột (colum packing) và sự phân tách protein (protein elution) Nó cho phép so sánh các loại cột với và các nguyên liệu để nạp cột khác mà không làm lãng phí mẫu Chuẩn lọc gel của hãng Bio-Rad là hỗn hợp protein có trọng lượng phân tử đã biết: thyroglobulin (Mr 670.000), gamma globulin bò (Mr 158.000), ovalbumin của gà (Mr 44.000), myoglobin của ngựa (Mr 17.000), và vitamin B12 (Mr 1350) Vitamin B12 và myoglobin có thể nhìn thấy chúng di chuyển qua cột  Vệ sinh khử trùng Gel Bio-Gel P có thể khử trùng bên cột cách sử dụng 3% hydrogen peroxide nước, dung dịch ethanol, diethyl pyrocarbonat hoặc thimerosal 1: 10.000 Gel Bio-Gel P đã hydrat hóa có thể khử trùng autoclave pH 5.5-6.5 1200 C 30 phút Khi khử trung autoclave, gel có thể bị phồng lên từ 4-20 lần thể tích ban đầu Sự phồng lên càng nhiều thì làm cho kích thước lỗ càng lớn • Bảo quản Các cột đã nạp gel Bio-Gel P có thể bảo quản không giới hạn nếu trì pH trung tính có mặt chất kháng khuẩn 0.02% sodium azide Nên bảo quản các cột 40 C • Xác đinh tốc độ dòng Lọc gel là quá trình có kiểm soát chất khyếch tán : hiệu quả phân tách tùy thuộc vào tốc độ và độ đồng nhất của kích thước hạt gel Độ phân tách cao nhất nhạn đươc tốc độ dòng trì phạm vi 2-10 cm/hr Đối với tốc độ dòng tuyến tính 5cm/hr (nghĩa là tốc đọ dòng theo chiều dài của cột), để xác định tốc độ dòng của cột ta lấy tốc độ dòng tuyến tính nhân với diện tích thiết diện (cross sectional area) của cột 62 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 63 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Bảng 3.3 Xác định tốc độ dòng Tốc độ dòng tuyến Đường kính cột Diện tích thiết diện Tốc độ dòng qua tính (cm/hr) (cm) (cm2) cột ml/hr 0.7 0.385 1.9 1.0 0.785 3.9 1.5 1.77 8.9 2.5 4.91 25 5.0 19.6 98 - Đối với cột có kích thước 1.5 x 70 cm Tốc độ dòng giảm nếu chiều dài cột tăng - ml/hr/cm2 (diện tích thiết diện) = cm3/hr/cm2 = cm/hr 64 [...]... hợp Hoạt tính của enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 550C  Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ Trichoderma reesei là 4,05,0... sinh tổng hợp enzyme cellulase cũng tăng tương ứng theo thời gian Ở Trichoderma viride, thời gian tăng trưởng chậm hơn nhưng tạo ra hệ enzyme cellulase rất tốt Sản phẩm của hệ enzyme cellulase là cellobiose, một chất kìm hãm hoạt tính của exo - β -glucanase Do đó mà quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase ở Trichoderma viride tăng trưởng mạnh trong khoảng thời gian từ 4 ngày 3.4.3... là máy sấy phun sương) Sau đó ta đem enzyme thô đi tinh sạch bằng quá trình lọc gel hay sử dụng phương pháp cố định enzyme để thu được enzyme cellulase thành phẩm 30 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm 3.3 Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 3.3.1 Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Bradford ... Nguyễn Trần Nhật Minh Hình 2.8 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase Cơ Chế Hoạt Động Của Enzyme Cellulase Hình 2.9 Cơ cấu chi tiết của các hoạt động beta-glucosidase của cellulase 2.5.2 Tính chất lý hóa của enzyme cellulase 17 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định... vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn khác nhau  Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:  Động vật (hạn chế)  Thực vật (hạn chế)  Vi sinh vật (phổ biến)  Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế  Việc sản xuất enzyme từ vi sinh... cồn, aceton, muối amoni sunfat) ↓ Ly tâm ↓ Enzyme thô ↓ Tinh sạch 3.2.1 Thuyết minh quy trinh Chủng nấm Trichoderma Reesei được nuôi cấy trên môi trường BM:CM (bã mía:cám mì), sau quá trình nuôi cấy ta thu được chế phẩm enzyme thô từ môi trường Cân 5 g chế phẩm enzyme thô cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 20 ml nước cất Khuấy đều dịch enzyme trong khoảng thời gian 30 phút (có... học Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học, để chữa các bệnh di truyền do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu Năm 1954, Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme 22 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh bị biệt lập với môi trường xung quanh Do đó cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme. .. hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm - Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh… - Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm 2.5 Sơ lược vê enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma reesei Cellulase là nhóm enzyme. .. hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63% Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34% 2.5.3 Ứng dụng của enzyme cellulase 18 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Enzym cellulase được... với hạt epoxide 2.7.5 Ứng dụng của enzyme cố định 2.7.5.1 Trong công nghiệp Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như: công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất… Rượu bia: Các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở quy mô lớn Chế biến sữa: Enzyme lactase cố định để thủy phân