Khảo sát quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm trichoderma reesei

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU1.1. Đặt vấn đềHiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa trình phân giải này. Vì vậy nếu ta sản xuất được một lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phí thấp thì ta có thể tận dụng được nguồn phế thải lớn từ các nhà máy chế biến thực phẩm như: bã mía, trấu, rơm rạ, mạt cưa…góp phần vào bảo vệ môi trường và cung cấp một lượng lớn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến thực phẩm. Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống. Các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập được chủng nấm Trichoderma Reesei KY746 để tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả nhất mà giá thành lại rẻ.

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đê

Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thựcphẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải này cóthành phần chính là cellulose Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm

hoặc axit Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất

phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường Trong khi đó, việc xử lý các chấtthải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzymecellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế vàmôi trường Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase cótrong điều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn vàtrong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúatrình phân giải này

Vì vậy nếu ta sản xuất được một lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phíthấp thì ta có thể tận dụng được nguồn phế thải lớn từ các nhà máy chế biến thực phẩmnhư: bã mía, trấu, rơm rạ, mạt cưa…góp phần vào bảo vệ môi trường và cung cấp một

lượng lớn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến thực phẩm Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác.

Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống cókhả năng phát triển ngay trên rễ Những giống này có thể được bổ sung vào trong đấthay hạt giống bằng nhiều phương pháp Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng pháttriển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống

Các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập được chủng nấm

Trichoderma Reesei KY-746 để tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả

nhất mà giá thành lại rẻ

Xuất phát từ thực tế này với sự hướng dẫn của kỹ sư Huỳnh Văn Thành tôi đãthực hiện khóa luận này: “Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm

Trichoderma Reesei”.

1.2 Mục tiêu của đê tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

 Quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trihoderma Reesei

 Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate

1.2.2 Mục tiêu cụ thê

 Thu nhận enzyme cellulasse từ nấm Trichoderma Reesei

 Xác định tỷ lệ tủa tối ưu của các tác nhân tủa: Muối ammonium, cồn, aceton

 Xác định nhiệt độ, pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme cellulase

 Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate

 Tinh sạch enzyme cellulase

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN2.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào

Mặc dù có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase,nhưng chỉ có một số ít vi sinh vật là có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase với sốlượng lớn Sau đây là kết quả nguyên cứu các chủng vi sinh vật sản xuất enzymecellulase

Bảng 2.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào STT Tên chủng Tên phân loại

Hoạt tính celulase (unit/ml)

2.2 Giới thiệu Trichoderma reesei

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu về Trichoderma

Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết là Trichodermaviride Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà

phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa họckhác Tình hình thay đổi trong thế chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiệntượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương

Chương trình điều tra của quan đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma"viride" mã số QM

6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này

Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người

đã khám phá ra loài này là Elwyn T.Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natickvới sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế

phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó.

Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu vàChâu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của

Trichoderma vào cuối thập niên 60 Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma, việc nuôi cấy dể dàng và không tốn kém các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng

nghiên cứu cơ bản hơn là nghiên cứu ứng dụng về phân giải cellulose của chúng Một

phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng

trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh

giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.

Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thếgiới

Hình 2.1 Ảnh nhìn qua kính hiển vi vê những sợi tơ phát triển của dòng nấm

Tricoderma reesei Trong hình, các protein trong các tế bào nấm được đánh dấu màu

đỏ trong khi chất chitin – một thành phần của các thành tế bào – được đáng dấu màu

xanh dương (Ảnh: Mari Valkonen, VTT Finland)

2.2.2 Nuôi cấy Trichoderma reesei trên môi trường bã mía kết hợp cám mi

Trichoderma reesei VTT-D-80133 sinh trưởng trên môi trường bán rắn với cơ

chất bã mía kết hợp với cám mì Tỷ lệ BM:CM (7:3), 8 lần nồng độ dinh dưỡng, độ ẩm

ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy 7 ngày là tối ưu cho Trichoderma reesei

VTT-D-80133 sinh tổng hợp cellulase trên môi trường lên men bán rắn

2.2.3 Hinh thái của nấm Trichoderma reesei

Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ

khuẩn ty Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuốinhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, khôngmàu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy Bào tử hình cầu, hình

elip hoặc hình thuôn Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàngxanh, lục xỉn đến lục đậm.

Hình 2.2 Hình thái Trichoderma Reesei 2.2.4 Đặc điêm

Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một

số môi trường sống khác, chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất Nấm

Trichoderma hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số

giống có khả năng phát triển ngay trên rễ, những giống này có thể được bổ sung vào

trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp Nấm Trichoderma khi chúng tiếp xúc

với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống Vì vậy, khiđược dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt

rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tại và cònhiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng, tuy nhiên không nhiều giống có khả năngnày

Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, và Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công

các loài nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triểncủa cây Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh trưởngcủa cây hiện nay đã được chứng minh rõ ràng Quá trình này được điều khiển bởi nhiềugen và sản phẩm từ gen khác nhau Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm,kháng sinh, cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian, sự chịu đựng các điều kiện bấtlợi bằng việc gia tăng sự phát triển của cây và rễ, làm hòa tan và cô lập chất dinhdưỡng vô cơ, cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh.

Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ

chế sinh sản vô tính Tuy nhiên, có một số giống sinh sản hữu tính đã được ghi nhậnnhưng những giống này không thích hợp để sử dụng trong các phương pháp kiểm soátsinh học Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khác nhau về hình thái chủyếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính, gần đây nhiều phương pháp phân loại dựa

trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng Hiện nay nấm Trichoderma có ít nhất là 33 loài.

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của nấm Trichoderma reesei

2.2.5 Ứng dụng

2.2.5.1 Lương thực và ngành dệt

Trichoderma là những vi sinh vật sản xuất nhiều enzyme ngoại bào có hiệu quả

cao Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất enzyme cellulase và các enzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp Nhờ vậy chúng thường được sử dụng

trong công nghiệp chế biến thực phẩm và ngành công nghiệp dệt cho các mục đích tương tự

2.2.5.2 Chất kiểm soát sinh học

Hiện nay loài nấm này đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như được đăng

ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản

xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả Hình thức sửdụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón chocây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây

2.2.5.3 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng

Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều nămqua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kíchthích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường.Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong

thời gian gần đây Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng

có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) Những rễ sâunày giúp các loài cây như: bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán

Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm

Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây

không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ

2.2.5.4 Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen

Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hoácác sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học Nhiều gen có

nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong

chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh Chưa có gen nào đượcthương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển

2.2.5.5 Biện pháp canh tác hữu cơ

Hiện nay, việc bón phân hữu cơ cho cây cao su hầu như chưa được bà con nôngdân chú trọng dẫn đến mất cân bằng sinh thái môi trường đất Hệ vi sinh vật suy giảm

đã làm cho nấm bệnh, đặc biệt là nấm Corynespora cassiicola có điều kiện phát triển

và phát tán rất nhanh trong mùa mưa

Vì vậy, việc bón phân hữu cơ là một trong những giải pháp quan trọng cần đượcquan tâm thúc đẩy Trong khi bệnh vàng lá, rụng lá đang có chiều hướng lây lan nhanh

việc bón phân hữu cơ có chứa nấm đối kháng Trichoderma là một giải pháp rất hữu

hiệu Ngoài việc giúp cho bộ rễ cây phát triển, đất giữ ẩm tốt, đồng thời nấm đối kháng

Trichoderma sẽ tấn công các mầm bệnh corynespora và các loai nấm bệnh khác có

trong đất

Việc phun các chế phẩm sinh học có chứa Trichoderma lên tán cây cũng là một

giải pháp rất tốt nhằm đưa các bào tử nấm đối kháng phát tán rộng rãi trong môi trườngcủa vườn cao su tạo nên một hệ thống phòng thủ hữu hiệu lâu dài

Qua nhiều kết quả thực tiễn cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium, do vậy nấm Trichoderma đã

được khuyến cáo sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp công nghệ cao ở tỉnhLâm Đồng những năm qua

Hình 2.4 Ủ phân hữu cơ có sử dụng nấm đối kháng Trichoderma

2.3 Giới thiệu sơ lược vê enzyme

Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzyme cótrong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóahọc nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tếbào (invitro) Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúctác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác

Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ratrong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh haykiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịpnhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng(370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…)

Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu Tính đặc hiệu là khả năngxúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểuphản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất.

Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học Do đó muốn thu nhậnenzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật Tất cả các tế bàođộng vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toànkhác nhau

 Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:

 Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau:

• Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn

• Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú

 Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khảnăng tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàngtrong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là rấtcao

• Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh

• Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên cóthể tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và cóthể điều khiển dễ dàng các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thểthu được hiệu xuất cao trong sản xuất

• Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy môcông nghiệp.

Hình 2.5 Enzyme cắt mối liên kết peptit (-CO-NH-) 2.4 Giới thiệu sơ lược vê protease

Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase): Xúc tác quá trình thủy phân liên kếtpeptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng la acidamin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyểnacid amin

Protease được phân loại dựa trên các đặc điểm riêng của chúng cũng như cấu tạotrung tâm hoạt động enzyme, hiện tại được chia làm 6 nhóm chính:

- Glutamic acid proteases.

Hiện nay, chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhậnprotease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tếbào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinhvật (vi khuẩn, nấm và vi rut) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê)

So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt,protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhauvề cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thểđồng nhất, do đó protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm cótính thủy phân triệt để và đa dạng

Hình 2.6 Cấu trúc không gian của protease

2.4.1 Ứng dụng của protease

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sảnxuất như:

Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt

tính làm đông tụ sữa của chúng Protease từ một số vi sinh vật như A candidus, P roquerti, B mesentericus được dùng trong sản xuất pho mát.

Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy… Protease làm giảm thời giantrộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn.

Trong công nghiệp chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủyphân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và cóvị tốt hơn Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt (ngâm thịt vàodinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định - phương pháp này phổ biến và thuậnlợi nhất)

Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thườngthời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rấtnhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá Nên hiện nay quy trình sảnxuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thựcvật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vịcủa nước mắm

Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm

tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của A oryzae được dùng để

thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn

Trong công ngiệp thuộc da: Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủyphân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bịcứng Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định,tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da Trước đây, để làm mềm da người tadùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật Hiện nay, việc đưa các

protease tách từ vi khuẩn (B mesentericus, B subtilis), nấm mốc (A oryzae, A flavus) và xạ khuẩn (S fradiae, S griseus, S rimosus ) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại

nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng

Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khácnhư:

- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trongthực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng.

- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợpenzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chănnuôi gia súc và gia cầm

- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,

kháng sinh…

- Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sảnxuất mỹ phẩm

2.5 Sơ lược vê enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma reesei

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β -1, glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1, 4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1, 4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside

4-O-glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ

có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàntoàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất

Hình 2.7 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase

2.5.1 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase

Một phức hệ enzyme cellulase gồm: endo-β-1,4-glucanase, exo-β-1,4-glucanase,β-glucosidase Trong đó: Endo- β-1, 4-glucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân cácliên kết ở bên trong phân tử cellulose

Exo- β-1, 4-glucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tửcellulose

β -Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose

Hình 2.8 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase

Cơ Chế Hoạt Động Của Enzyme Cellulase

Hình 2.9 Cơ cấu chi tiết của các hoạt động beta-glucosidase của cellulase

2.5.2 Tính chất lý hóa của enzyme cellulase

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnhnhất ở nhiệt độ, pH nhất định

 Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khităng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúcenzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độthích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-500C Ở nhiệt độ cao, enzyme bịbiến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới

00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt

độ thích hợp Hoạt tính của enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở

550C

 Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môitrường phản ứng Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp đểenzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid Theo nghiên cứu trước đây

cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ Trichoderma reesei là

4,0-5,0

 Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sựhoạt động của các enzyme Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thểgây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme

 Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đếnhoạt tính của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bảnchất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzymelà khác nhau Các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetoneđều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạttính cellulase chỉ còn 33-63% Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS vàtriton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đóSDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%

2.5.3 Ứng dụng của enzyme cellulase

Enzym cellulase được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất cồn, trong

xử lý môi trường Enzym cellulase được ứng dụng rất ít trong thực phẩm (khoảng 1%)nhưng hầu như quá trình chế biến nào liên quan đến nguồn nguyên liệu là thực vật nếu

có enzym cellulase đều cho hiệu suất cao hơn Hơn nữa cellulase được sử dụng rộng rãitrong ngành công nghiệp dệt, bột giặt, ngành công nghiệp giấy, cellulase còn được sửdụng cho các ứng dụng dược phẩm

2.5.4 Các nguồn thu nhận enzyme

Hiện nay trên thế giới có 3 nguồn để thu nhận enzyme là từ thực vật, động vật và vi sinh vật Do những ưu điểm nổi bật về tốc độ sinh trưởng, sinh sản và phát triển mà nguồn vi sinh vật được quan tâm nhiều hơn Mặt khác, do kích thước vi sinh vật nhỏ nên ta có thể cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy vi sinh vật có thể kiểm soát được mà không phụ thuộc vào yếu tố bên ngoài như thu enzym từ nguồn thực vật và động vật

Có 2 phương pháp để nuôi cấy vi sinh vật tạo enzyme là nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng, tuy nhiên ngày nay phương pháp nuôi cấy bề sâu ngày càng được ứng dụng rộng rãi do khả năng cơ giới hóa và tự động hóa

2.6 Kỹ thuật cơ bản chuẩn bị dịch protein thô

Sau khi lựa chọn được nguồn cung cấp protein việc tiếp theo là phải đưa proteinvề dạng dịch Có nhiều phương pháp: phá tế bào bằng áp suất thẩm thấu, nghiền bằngthiết bị trung tính, nghiền tay, phá tế bào bằng phương pháp siêu âm Các phương phápkể trên thích hợp để xử lý các mô mềm, mô động vật, thực vật Đối với vi khuẩn có vỏbảo vệ chắc chắn thì tốt nhất nghiền bằng cối thủy tinh có thêm vật liệu chà xát như cáthay bột nhôm, hoặc xử lý với lysozine (enzyme phá vách tế bào) Đối với những tế bào

có vách bảo vệ rất chắc như nấm men trong một số trường hợp phải sử dụng máy éptạo áp suất cao để phá vở tế bào Một số trường hợp có thể sử dụng máy nghiền để phámẫu

Sau khi nhận được sinh khối tế bào bị nghiền, công việc tiếp theo là phải táchvách và các mảnh vỡ tế bào ra khỏi dịch chứa protein được giải phóng trong quá trìnhnghiền Thường người ta sử dụng phương pháp: ly tâm, lọc, tách dịch 2 lớp, táchnucleic acid và lipid Tốt nhất là dịch thô được bảo quản ở nhiệt độ thấp.

2.7 Cố định enzyme

2.7.1 Định nghĩa về enzyme cố định

Enzyme cố định là enzyme được giới hạn hay khác biệt về mặt vật lý ở mộtvùng không gian nhất định, nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác và có thể tái sử dụngnhiều lần sau một quá trình xúc tác

2.7.2 Ưu nhược điêm của quá trinh cố định enzyme

 Ưu điểm:

Có thể tái sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần 1 lượng enzyme xác định trong 1 thờigian dài, do đó làm giảm giá thành sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao tiết kiệm enzyme,đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền, thuận lợi trong các quá trình tựđộng hóa và liên tục

- Tăng độ tinh sạch của sản phẩm vì enzyme được cố định ở những pha riêng rẽ do

đó dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm Tránh được ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm.Điều này đặc biệt là có ý nghĩa khi sử dụng enzyme cố định trong sản xuất thực phẩm,trong công nghiệp sản xuất hóa chất tinh khiết và trong phân tích

- Có thể dừng quá trình phản ứng ở bất cứ giai đoạn nào khi cần thiết, chỉ cần táchenzyme cố định ra khỏi cơ chất

- Kéo dài thời gian bảo quản và bền vững với chất kiềm hãm cũng như với các tácnhân gây biến tính so với enzyme hòa tan

- Hoạt tính ổn định so với enzyme tự do khi có những thay đổi của môi trường như:

pH, nhiệt độ… Nhờ vào các liên kết của enzyme với chất mang như liên kết cộng hóatrị, liên kết hydro, liên kết ion và các liên kết khác

 Nhược điểm:

Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme cho nên hoạt tính riêng củaenzyme cố định thường thấp hơn so với enzyme tự do.

- Một lượng enzyme đáng kể bị mất hoạt tính khi cố định bằng phương pháp cộnghóa trị là do chất hoạt hóa và do phản ứng gắn kết không đặc hiệu của các liên kết trênvật liệu cố định vào trung tâm hoạt động của enzyme

2.7.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định

Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hoà tan) Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme không hoà tan là:

 Bản chất và tính chất hóa học của chất mang

 Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ học, độ trương điện tích, tính háo nước và kị nước,… đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme

cố định Bản chất hóa học của các chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tới khả năng hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng

 Dẫn xuất enzyme không hòa tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan

do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydro và liên kết kỵ nước

 Sự khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác

 Tốc độ khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất phụ khác

2.7.4 Phương pháp cố định enzyme

 Cố định enzyme thông qua liên kết hóa trị

Tạo liên kết hóa trị với vật liệu mang được hoạt hóa thông qua các gốc tự do –

NH2, OH và SH ở mạch bên của các amino acid Theo nguyên tắc, liên kết hình thành

trong quá trình tương tác giữa nhóm ưa nhân (nucleophilic) của enzyme với các nhómchất được hoạt hóa trước đó trên bề mặt chất mang.

 Cố định enzyme bằng cách nhốt trong gel

Tiến hành nhốt enzyme vào nền chất tạo gel tự nhiên, hay tổng hợp, có bản chấtlà polymer, là khá đơn giản Các polymer như Na-alginate, carrageenan,carboxymethyl-cellulose (CMC) hoặc polymer cationic như chitosan, thường được sửdụng để tạo liên kết với các ion trái dấu như Ca+2 hoặc polyphosphate Tuy nhiênphương pháp này có một số hạn chế Ion Ca+2 đóng vai trò làm chất kết nối gel thường

dễ bị hòa tan khi bổ sung thêm muối Gel dạng hình cầu lại mềm và xốp, độ bền cơ họcthấp, khó có thể nhồi vào cột phản ứng, nên ít được sử dụng Tuy nhiên hướng côngnghệ này vẫn được tiếp tục nghiên cứu, theo hướng làm cứng nền gel bằng cách tạophức gel với hạt epoxide

2.7.5 Ứng dụng của enzyme cố định

2.7.5.1 Trong công nghiệp

Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như:công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất… Rượu bia: Các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở quy

mô lớn

Chế biến sữa: Enzyme lactase cố định để thủy phân lactose trong sữa

- Năm 1969 Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoseamylase cố định

- Năm 1971 đã dùng Chimotrypsin liên kết cộng hóa trị với carboximethylcellulose làm đông tụ sữa thay cho rennin đắt tiền

2.7.5.2 Trong y học

Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học, để chữa các bệnh di truyền

do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu Năm 1954, Chung đã tạo được vi tiểu cầubán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme

bị biệt lập với môi trường xung quanh Do đó cơ thể tạo được nồng độ cao của enzymethiếu mà không bị ảnh hưởng của các phản ứng phụ.

Enzyme được cố định còn được dùng trong chuẩn đoán bệnh Ngoài các ứngdụng điện cực enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như lượng:glucose, urea, cholesterol…Enzyme Horseradish peroxidase cố định trên polystyrencùng với kháng thể , giúp chuẩn đoán nhanh và chính xác (kĩ thuật ELISA)

Enzyme L-asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của u ác tính, nếu đưatrực tiếp enzyme này vào cơ thể sẽ bị đưa ra ngoài nhanh chóng và gây nên hiện tượngdị ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả caohơn

2.7.5.3 Trong nghiên cứu khoa học

Năm 1967, điện cực enzyme đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờglucoxydase cố định Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt gel polyacryamide.Nhúng điện cực vào dung dịch glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuếch tán vào gel chứaenzyme Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độphản ứng và nồng độ glucose

Kaetsu dùng điện cực urease trong máu, dùng cholesterol oxydase đo nồng độcholesterol

Clark dùng điện cực alcohol oxyreductase để xác định nồng độ cồn

Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhaunhư: hoạt hóa enzyme zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng trongphương pháp sắc kí ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt vớienzyme Ngày nay có nhiều quy trình sử dụng tế bào cố định để xử lí nước thải đạthiệu quả cao

2.7.5.4 Trong bảo vệ môi trường

Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường…chất thải,phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu chất hữu cơ Do

đó có thể sử dụng enzyme cố định để xử lí nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểuhàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra ngoài môi trường bên ngoài.

2.7.6 Tinh hinh nghiên cứu trong và ngoài nước

2.7.6.1 Tình hình nguyên cứu trong nước

Nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam trong vài năm gần đây,kết quả thu được cũng còn nhiều hạn chế

Năm 1994 -1995, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh nghiêncứu enzyme glucoisomerase trên các hạt Silochrom B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde

Lê Văn Hiệp (1995), cố định vi khuẩn tả (Vibrio cholerea) lên giá thể PHEMAbằng kĩ thuật bức xạ, Nguyễn Quốc Hiến (1996) đã nghiên cứu chế tạo chế phẩmhormone progesterone thải chậm bằng kĩ thuật bức xạ

Lê Quang Luân (1997) đã cố định vi khuẩn Pseudomonas mastophlla để xử líchất hữu cơ nước

Nguyễn Quang Tâm (2002) đã nghiên cứu cố định pectinase thu thập từ cácchủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) đã nghiên cứu cố định α – amylase thu nhận từ

vi khuẩn Bacillus subtilis…

2.7.6.2 Tình hình nguyên cứu ngoài nước

Cho đến năm 1979, người ta còn rất hy vọng có thể áp dụng công nghệ này chotất cả các loại enzyme Tuy nhiên đánh giá thực sự cho thấy hiện mới chỉ có 2 côngnghệ sử dụng glucose isomerase và penicillin amidase cố định là có hiệu quả Hiện tạienzyme amino acid acyclase, aspartase, fumarase cũng đã bắt đầu được ứng dụng thực tiễn (chủ yếu là ở Nhật)

Bảng 2.2 Một số enzyme cố định đang được sử dụng trong sản xuất

Enzyme cố định Sản lượng

Aminoacid acylase 1000 t DEAE sepharose

Reactor màngEupergit

TanabeDegussaRohmAminoglucosidase 5000 t sirô glucose Than hoạt tính Tate % Lyle

Glucose Isomerase 6-7 triệu tấn

Lactase < 1000 t sirô lactose Hạt ceramic, trao

đổi ion, sợi nylon

Corning Sumomoto

Lipatse Chuyển ester, thủy

phân

Trao đổi ion celite Novo Unillever

Nitrilase 6000 t acrylamide Nhốt tế bào trong

polyacrylamide

Nitto

hoạt hóa, Eugergit

VR China, JapanRohm

amidase

4500 t penicillanic

BeechamPenicillin

V amidase

nylon

Toyo JozoBoehringerNovoTế bào nấm men Sản xuất cồn Na-alginate KyowaHakko

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY3.1 Thiết bị và hóa chất

3.1.1 Thiết bị

− Bể ổn nhiệt

− Cân phân tích

− Máy ly tâm

− Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-rad, Mỹ

− Các dụng cụ chạy điện di

− Tủ lạnh

Hình 3.1 Máy đo pH Hình 3.2 Cân phân tích

Sodium carboxymethyl cellulose

− Coomassie Brilliant Blue

− Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 960, muối ammonium sulphate, acetone

− Dung dịch đệm phosphate: NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4

− Hóa chất xác định hàm lượng protein: Thuốc thử Bradfosd

↓

↓

Chế phẩmDịch

Khuấy

Lọc

↓

↓

↓

↓

↓

↓

3.2.1 Thuyết minh quy trinh

Chủng nấm Trichoderma Reesei được nuôi cấy trên môi trường BM:CM (bã

mía:cám mì), sau quá trình nuôi cấy ta thu được chế phẩm enzyme thô từ môi trường

Cân 5 g chế phẩm enzyme thô cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 20 ml nước cất.Khuấy đều dịch enzyme trong khoảng thời gian 30 phút (có thể khuấy trongkhoảng thời gian 40, 50 phút, nhưng khoảng thời gian khuấy 30 phút là phù hợp nhất)

Lọc lấy dịch chiết được thể tích khoảng 17,5 ml

Đem dịch lọc được đi ly tâm

Thu dịch ly tâm

Tủa dịch ly tâm (bằng cồn, acetone, hoặc muối amoni sulphate), trong trườnghợp này ta tủa dịch ly tâm bằng cồn 960, với tỷ lệ 1:3, tức là: 17,5 ml dịch chiết enzymethô với 52,5 ml cồn 960

Tách lấy phần tủa ở dưới đem đi ly tâm

Thu Dịch

Ly tâm (8000 vòng/p)

DịchTủa (bằng : cồn, aceton, muối amoni sunfat)

Ly tâmEnzyme thôTinh sạch

Thu dịch ly tâm đem cân phân tích thu được khoảng 20,1g enzyme thô Ở trạngthái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kếttủa enzyme cellulase ở 400 C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W (thiết bị sấythường dùng là máy sấy phun sương).

Sau đó ta đem enzyme thô đi tinh sạch bằng quá trình lọc gel hay sử dụngphương pháp cố định enzyme để thu được enzyme cellulase thành phẩm

Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm

3.3 Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase

3.3.1 Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Bradford

 Các Protein khi phản ứng xanh với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch Phương pháp

Blue-có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiếtkiệm thời gian

 Hóa chất, thiết bị:

- Dung dịch mẫu enzyme cellulase cần xác định

- Dung dịch albumine 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumin pha trong 100mlnước cất Lắc đều cho tan Giữ ở 200 C Khi dùng pha loãng 100 lần, được dungdịch albumine có nồng độ 0.01mg/ml

- Dung dịch thuốc thử Bradford:

• Coomassie Brilliant Blue: 0.001g

• Ethanl tuyệt đối: 4,7g

• Acid phosphoric 85%: 8.5g

Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng

có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất

- Thiết bị: Máy quang phổ

 Lập đồ thị chuẩn

Để dung dich albumin chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau:

Bảng 3.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn

Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50

Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút Thực hiện phản ứng lần lượt

ở các ống còn lại 2, 3, 4, 5, 6 các ống cách nhau 1 phút

Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành 1 cách tương tự như trên Mẫu được pha loãngsao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn Đo ở bước sóng595nm

 Tính kết quả

Trị số mật độ quang (OD) của những ống chứng (ống 2 đến ống 6) sau khi trừ đitrị số của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên củamật độ quang (OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml) Tương tự như vậy, trị số mật

độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồichiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm(µg/ml)

Tổng hàm lượng protein trong M (g) chế phẩm thô được tính theo công thức:

mg protein = b x 10 -3 x m x M

Với:

b: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (µg/ml)

m: hệ số pha loãng

M: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g)

3.3.2 Xác định hoạt tính enzyme cellulose bằng phương pháp đường chuẩn glucose

Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởienzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5,0 và 400 C Lượng đường khử sinh ra được