Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5,0 và 400 C. Lượng đường khử sinh ra được
cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540 nm.
Dụng cụ, thiết bị - Máy ly tâm.
- Bộ ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy Vortex, pH kế, cân phân tích. - Bếp điện.
- Chậu nước lạnh. - Que khuấy thủy tinh. Hóa chất
- Cồn 960 .
- Sodium acetate. - NaOH 1N.
Bảng 3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase
Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 Ml dd DNS-Lactose 2 2 2 2 2 2 2 Ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm.
Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) - Ống nghiệm 1: Chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0.
• Hút 1ml dung dịch đệm Na-acetac 50Mm, pH 5.0 cho vào ống nghiệm. • Thêm 2ml dung dịch DNS-Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. • Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chưa enzyme và lắc đều.
• Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm bằng 0.
- Ống nghiệm 2: Phản ứng enzyme
• Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 400 C/5 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400 C/5 phút. • Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. • Để phản ứng ở 400 C chính xác 10 phút.
• Thêm 2ml dung dịch DND-Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme.
• Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
- Ống nghiệm 3: Không có phản ứng enzyme
• Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi từ 5 đến 10 phút để bất hoạt enzyme.
• Thêm 2ml dung dịch DNS-Lactose và lắc đều.
• Thêm 1ml dung dịch CMC 1% chứa dung dịch enzyme và lắc đều.
• Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
Định lượng đơn vị hoạt tính
Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng đường khử như glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng.
3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường, độ ẩm, thời gian, nhiệt độ tối ưu, độpH tối ưu pH tối ưu