Hướng dẫn sử dụng Bio-Ge lP

PHỤ LỤC

C.3. Hướng dẫn sử dụng Bio-Ge lP

C.3.1. Chọn cột

Kích thước cột lý tưởng là những kích thước cho phép phân giải vạch ranh giới các chất phân tích mà không cần pha loãng mẫu nhiều. Điển hình, chiều dài cột so với tỷ lệ đường kính ở khoảng pH 5-10, và thể tích lớp nền (bed volumn) gấp 4-20 lần thể tích của mẫu. Hệ số pha loãng tối thiểu có thể thu được đối với một chất đã được tách (excluded substance) khoảng 1,25. Nhìn chung, đối với quá trình phân tách khó thì cần chiều dài lớp nền so với tỷ lệ đường kính là 25-100 hoặc lớn hơn, và thể tích lớp nền gấp 25-100 lần thể tích mẫu.

 Chọn chất tách

Chất tách (chất giải hấp) là chất lỏng dùng để chiết một chất khỏi chất khác trong sắc ký.

Chất tách chọn cần tạo tính ổn định tối đa cho các chất tan không ổn định trong mẫu. Nồng độ ion ít nhất là 20mM để loại trừ ảnh hưởng của số lượng nhỏ các nhóm mang điện âm trên gel.

Việc sử dụng các dung dịch muối ở nồng độ cao có thể gây ra những thay đổi nhỏ trong thể tích lớp nền gel và giới hạn phân tách (exclusion limits).

Bio-Gel P tương thích với các trạng thái hòa tan và làm biến tính (solubilizing and denaturing condition) được sử dụng trong việc xác định trọng lượng phân tử như guanidine-HCl 6M, các tác nhân chaotropic, các tác nhân khử như dithiothreitol và mercaptoethanol, và các thuốc tẩy như SDS, CHAPS, và Triton X-100.

Có thể sử dụng các muối đệm dễ bay hơi như pyridine, acetic acid, ammonium formate hoặc ammonium bicarbonate nếu sản phẩm cuối cùng cần phải ở trạng thái không có muối đệm. Có thể loại các chất này ra khỏi phân đoạn dòng chảy (effluent fractions) dễ dàng bằng đông khô.

Nên loại các khí hòa tan như CO2 để ngăn chặn sự tạo bọt trong hệ thống. Thực hiện điều này bằng cách hút dung dịch đệm trong một lọ chân không bằng một vòi nước tạo chân không hoặc bằng máy tạo chân không.

Nên tránh sử dụng các chất tách có pH trên 10 hoặc nhỏ hơn 2 để ngăn sự thủy phân gel.

Tránh dùng các tác nhân 0xy hóa mạnh vì các chất này sẽ phản ứng với gel và làm gia tăng hàm lượng các nhóm tích điện trên chất lớp.

 Chuẩn bi gel

Cho từ từ môi trường Bio-Gel P vào dung dịch đệm đã được đựng trong cốc mỏ (beaker). Có thể ước tính lượng gel Bio-Gel P cần cho vào cột có thể tích đã biết bằng cách sử dụng bảng 2, bảng này cho biết thể tích lớp neenfkhi được hydrat hóa. Lưu ý sự mất gel trong suốt quá trình tiến hành công việc. Dùng dung dịch đệm nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền cần cho trong cột.

Đối với các gel từ Bio-Gel P-2 đến Bio-Gel P-10 cần hydrat hóa trong vòng 4 giờ ở nhiệt độ phòng (1 giờ nếu dung dịch đệm đã được làm nóng đến 1000 C và rồi làm lạnh sau khi đã cho gel vào dung dịch đệm). Đối với các gel từ Bio-Gel P-30 đến Bio-Gel P-100 cần 12 giờ ở 200 C để hydrat hóa hoặc 4 giờ nếu bắt đầu ở 1000 C . Sauk

hi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định trong suốt quá trình hydrat hóa.

Sau khi quá trình hydrat xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình lọc và gắn với nguồn chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình. Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư hại gel.

Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ bình. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định. Gạn hoăc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại > 99% hạt mịn.

Cho một cái phễu trên đỉnh cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột.

Rót đều chất pha trộn loãng (slurry) vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn (tung tóe) chất pha trộn loãng để đảm bảo việc nhồi cột đều và để tránh việc bẫy các bọt khí.

Khi 2-5 cm lớp nền đã hình thàh, cho cột chảy cho đến khi cột được nạp đầy (packed).

Khi cột đã được nạp đầy, đóng đầu ra (outlet) của cột và gắn flow adaptor. Mở đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp 2 lần thể tích trên lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy.

Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị.

Nếu không dùng flow adaptor thì lấy lớp gel thừa cho đến khi đạt chiều cao lớp nền mong muốn khi mà cột đã được nạp xong và gắn cột vào một reservoir. Cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ

dòng chảy. Rút dung dịch đệm xuống bằng lớp nền gel và mẫu nằm trên lớp nền gel, sau đó cho thêm dung dịch đệm để lấy mẫu vào lớp nền. Thay lớp dung dịch đệm nổi trên bề mặt và gắn cột vào reservoir.

Thu các phân đoạn để phân tích hoặc theo dõi bằng một thiết bị dòng liên tục (continuous flow equipment) như UV/Vis, các máy đo độ dẫn (conductivity) và chỉ số khúc xạ (refractive index).

 Mẫu

Lọc gel phần lớn độc lập với nồng độ mẫu nhưng thể tích mẫu tương ứng với thể tích lớp nền lại khá quan trọng.

Với mục đích phân tích, mẫu không nên lớn hơn 1-5% thể tích lớp nền. Với mục đích khử muối, mẫu có thể là 30-35% so với thể tích lớp nền.

Độ nhớt của mẫu có thể giới hạn nồng độ mẫu mà có thể sử dụng. Mẫu có độ nhớt cao có thể pha loãng để là giảm độ nhớt. Có thể đạt được kết quả tốt hơn bằng cách áp dụng mẫu có độ nhớt cao ở tốc độ chảy thấp.

Mẫu cần sạch và hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm chạy mà không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn. Lọc mẫu sẽ làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột. Nếu vì tính chất của mẫu mà không thể đem lọc được thì nên ly tâm mẫu cho đến khi nó sạch. Trình bày ảnh hưởng theo giả thuyết về các điều kiện sắc kí khác nhau.

 Xác đinh thể tích trống (void volumn) và hiệu chuẩn (calibration)

Thể tích trống (Void volumn) = Vo của lớp nền bằng với thể tích phân tách (elution volumn = Ve) của các nguyên liệu đã phân tách.

Nên xác đinh thể tích chân không của lớp nền và nên kiểm tra tính đồng nhất của chất phân tách của lớp nền trước khi áp dụng mẫu thí nghiệm.

Các protein có màu như hemoglobin, ferritin phù hợp với phương pháp xác định thể tích chân không này. Dextran xanh không được đề nghị xác đinh thể tích chân

không vì nó không đồng nhất (heterogeneous) và có thể cho ra những kết quả khác nhau. Nó cũng có thể liên kết không dặc hiệu với gel.

Sử dụng các protein chuẩn cho phép kiểm tra viecj nạp cột (colum packing) và sự phân tách protein (protein elution). Nó cũng cho phép so sánh các loại cột với nhau và các nguyên liệu để nạp cột khác nhau mà không làm lãng phí mẫu.

Chuẩn lọc gel của hãng Bio-Rad là một hỗn hợp 5 protein có trọng lượng phân tử đã biết: thyroglobulin (Mr 670.000), gamma globulin bò (Mr 158.000), ovalbumin của gà (Mr 44.000), myoglobin của ngựa (Mr 17.000), và vitamin B12 (Mr 1350).

Vitamin B12 và myoglobin có thể nhìn thấy được khi chúng di chuyển qua cột  Vệ sinh và khử trùng

Gel Bio-Gel P có thể được khử trùng bên trong cột bằng cách sử dụng 3% hydrogen peroxide trong nước, dung dịch ethanol, diethyl pyrocarbonat hoặc thimerosal 1: 10.000.

Gel Bio-Gel P đã hydrat hóa có thể được khử trùng bằng autoclave ở pH 5.5-6.5 ở 1200 C trong 30 phút. Khi khử trung bằng autoclave, gel có thể bị phồng lên từ 4-20 lần thể tích ban đầu. Sự phồng lên càng nhiều thì làm cho kích thước lỗ càng lớn.

• Bảo quản

Các cột đã được nạp gel Bio-Gel P có thể bảo quản không giới hạn nếu được duy trì ở pH trung tính khi có mặt chất kháng khuẩn như 0.02% sodium azide. Nên bảo quản các cột đó ở 40 C.

• Xác đinh tốc độ dòng

Lọc gel là một quá trình có kiểm soát chất khyếch tán : hiệu quả phân tách tùy thuộc vào tốc độ và độ đồng nhất của kích thước hạt gel. Độ phân tách cao nhất nhạn đươc khi tốc độ dòng được duy trì trong phạm vi 2-10 cm/hr. Đối với tốc độ dòng tuyến tính 5cm/hr (nghĩa là tốc đọ dòng theo chiều dài của cột), để xác định tốc độ dòng của cột ta lấy tốc độ dòng tuyến tính nhân với diện tích thiết diện (cross sectional area) của cột.

Bảng 3.3 Xác định tốc độ dòng Tốc độ dòng tuyến

tính (cm/hr)

Đường kính cột (cm)

Diện tích thiết diện (cm2) Tốc độ dòng qua cột ml/hr 5 0.7 0.385 1.9 5 1.0 0.785 3.9 5 1.5 1.77 8.9 5 2.5 4.91 25 5 5.0 19.6 98

- Đối với cột có kích thước 1.5 x 70 cm. Tốc độ dòng sẽ giảm nếu chiều dài cột tăng.

Nghiên cứu thành phần môi trường

Giới thiệu về gel Polycrylamide