3.8.3.1. Đổ gel
Chuẩn bị đổ một gel có kích thước 100 x 100 x 0.75mm có nồng độ acrylamide là 10%.
Gel phân tách (separating gel)
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50ml sạch:
• 40% Acrylamide/Bis (29:1) 2.5ml • Tris-HCl 1.5M pH 8.8-0.4% SDS 2.5ml • Nước cất 4.445ml • TEMED 5µl • Ammonium persulfate 10% 50µl • Tổng thể tích 10ml
Sau khi cho Ammonium persulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipette Pasteur hoặc pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó, nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20-30 phút).
Gel gom (Stacking gel)
Cho các thành phần sau vào một Becher 50ml khác:
• 40% Acrylamide/0.85 bisacrylamide 0.5ml • Tris-HCl 0.5M pH 6.8-0.4% SDS 1ml • Nước cất 2.476ml • TEMED 4µl • Ammonium persulfate 10% 20µl • Tổng thể tích 4ml
Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đổ hết nước bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipette Pasteur hoặc pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sauk hi gel trùng ngưng tháo lược lắp đĩa gel vào bộ phận điện di cho dung dịch điện di vào buồn điện di.
3.8.3.2. Chuẩn bi mẫu và chạy điện di
Xử lý mẫu
Hút 30µl dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30µl dung dịch mẫu protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5-10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1-5 giây.
Đối với những thang chuẩn protein (Biorad0 hút 2µl vào eppendorf 1ml chứa 8 µl nước cất và 10µl dung dịch nạp mẫu.
• Dùng pipetteman 10µl nạp mẫu vào các giếng (20µl/giếng). • Tiến hành chạy điện di ổn định dòng: 100V
• Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trước (2-4 giờ) 1 giờ. Sau đó, tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đén khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sauk hi nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.
3.8.3.3. Xác đinh trọng lượng phân tử của protein
- Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách đến các band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng. - Tính giá trị Rf:
Khoảng cách di chuyển của protein
Rf =
Khoảng cách di chuyển của vạch màu Brommophenol Blue
- Vẽ biểu đồ log10 của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng.
- Trọng lượng phân tử của các vạch protein chưa biết trọng lượng phân tử có thể xác định thông số giá trị Rf của chúng thông qua phương pháp ngoại suy tử đồ thị.