Các Protein khi phản ứng xanh với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue- CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
Hóa chất, thiết bị:
- Dung dịch mẫu enzyme cellulase cần xác định.
- Dung dịch albumine 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumin pha trong 100ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200 C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumine có nồng độ 0.01mg/ml.
- Dung dịch thuốc thử Bradford:
• Coomassie Brilliant Blue: 0.001g. • Ethanl tuyệt đối: 4,7g • Acid phosphoric 85%: 8.5g
Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.
- Thiết bị: Máy quang phổ Lập đồ thị chuẩn
Để dung dich albumin chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau:
Bảng 3.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn
Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50
Dung dich albuine(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2
Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại 2, 3, 4, 5, 6 các ống cách nhau 1 phút.
Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành 1 cách tương tự như trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn. Đo ở bước sóng 595nm.
Tính kết quả
Trị số mật độ quang (OD) của những ống chứng (ống 2 đến ống 6) sau khi trừ đi trị số của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml). Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml).
Tổng hàm lượng protein trong M (g) chế phẩm thô được tính theo công thức:
mg protein = b x 10-3 x m x M
Với:
b: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (µg/ml) m: hệ số pha loãng
M: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g)