đánh giá hiệu quả của kỹ thuật pcr phát hiện trực tiếp mycobacterium tuberculosis trong mẫu bệnh phẩm

66 425 2
đánh giá hiệu quả của kỹ thuật pcr phát hiện trực tiếp mycobacterium tuberculosis trong mẫu bệnh phẩm

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN DUY HÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TRONG MẪU BỆNH PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – Năm 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN DUY HÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TRONG MẪU BỆNH PHẨM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.46.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN ĐẮC TRUNG Thái Nguyên – Năm 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Đắc Trung – Phòng Xét nghiệm Vi sinh vật và Sinh học phân tử - Bộ môn Vi sinh – Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, kĩ thuật viên và nhân viên của Bộ môn Vi sinh – Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện về máy móc và cơ sở vật chất giúp tôi hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch Tổng hợp, các bác sỹ, kĩ thuật viên của Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Nguyên đã cung cấp mẫu bệnh phẩm, hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành một số thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu. Cùng với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi tới toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Sinh – KTNN, Khoa Sau Đại học – Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu. Cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp, người thân và gia đình đã động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều. Tôi xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, tháng 8 năm 2011 Học Viên Nguyễn Duy Hà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Học Viên Nguyễn Duy Hà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục i Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt iii Danh mục các bảng iv Danh mục các hình vẽ v MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh lao 3 1.2. Tình hình bệnh lao trên thế giới và ở Việt Nam 3 1.3. Đặc điểm của bệnh lao và đặc điểm của vi khuẩn lao 8 1.4. Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao và bệnh lao 16 1.4.1. Kỹ thuật soi kính trực tiếp 16 1.4.2. Kỹ thuật nuôi cấy 17 1.4.3. Kỹ thuật PCR 17 1.4.4. Kỹ thuật RFLP 17 1.4.5. Phương pháp ELISA 1.4.6. Miễn dịch tế bào 17 18 1.4.7. Miễn dịch dịch thể 18 1.5. Phương pháp PCR và các ứng dụng trong y học 19 1.5.1. Nguyên lý của kỹ thuật PCR 19 1.5.2. Thành phần phản ứng 19 1.5.3. Các ứng dụng của kỹ thuật PCR trong y học 20 1.5.4. Sự đa dạng trong quy trình kỹ thuật và trình tự nucleotide đặc hiệu được sử dụng để phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu 23 2.2. Dụng cụ và thiết bị xét nghiệm 23 2.3. Hóa chất xét nghiệm 23 2.4. Quy trình nghiên cứu 24 2.5. Phương pháp và kĩ thuật nghiên cứu 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong các mẫu bệnh phẩm 33 3.1.1. Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong bệnh phẩm đờm 33 3.1.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong bệnh phẩm dịch màng phổi 35 3.2. Hiệu quả của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện nhanh vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis 37 3.2.1. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong đờm 38 3.2.2. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong dịch màng phổi 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ AFB Acid Fast Bacilli AIDS Acquired Immuno Deficiency Syndrome BK Bacille de Kock Bp Base pair CTCLQG Chương trình chống lao quốc gia DRPQ Dịch rửa phế quản EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay GTDBDT Giá trị dự báo dương tính GTDBAT Giá trị dự báo âm tính HIV Human Immunodeficiency Virus IgG Immuno globin G IS6110 Insert Sequence 6110 PCR Polymerase Chain Reaction Se Sensitivity (độ nhạy) Sp Specificity (độ đặc hiệu) TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới WHO World Health Organization Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU Trang Bảng 1.1. Ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực 5 Bảng 1.2. Số liệu ước tính bệnh lao của nước ta hàng năm 7 Bảng 2.1. Phân loại kết quả nhuộm soi 27 Bảng 2.2. Phân loại kết quả nuôi cấy 28 Bảng 2.3. Các thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 3.1. Kết quả nhuộm soi phát hiện vi khuẩn AFB trong đờm 33 Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis trong đờm 33 Bảng 3.3. Kết quả PCR phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis trong đờm 34 Bảng 3.4 Kết quả nhuộm soi phát hiện vi khuẩn AFB trong dịch màng phổi 35 Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis trong dịch màng phổi 35 Bảng 3.6. Kết quả PCR phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis trong dịch màng phổi 36 Bảng 3.7. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis trong đờm bằng nhuộm soi so với nuôi cấy 38 Bảng 3.8. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis trong đờm bằng PCR so với nuôi cấy 39 Bảng 3.9. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis trong dịch màng phổi bằng nhuộm soi so với nuôi cấy 40 Bảng 3.10. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis trong dịch màng phổi bằng PCR so với nuôi cấy 41 Bảng 3.11. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis trong đờm giữa phương pháp nhuộm soi và PCR 42 Bảng 3.12. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis trong dịch màng phổi giữa phương pháp nhuộm soi và PCR 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis soi dưới kính hiển vi 14 Hình 1.2. Khuẩn lạc vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy 15 Hình 1.3. Cấu trúc thành vi khuẩn lao 15 Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu 24 Hình .2.2. Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR 30 Hình 3.1. So sánh kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis trong đờm bằng 3 phương pháp 34 Hình 3.2. So sánh kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis trong dịch màng phổi bằng 3 phương pháp 36 Hình 3.3. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis trong đờm giữa phương pháp nhuộm soi và PCR 42 Hình 3.4. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis trong dịch màng phổi giữa phương pháp nhuộm soi và PCR 43 Hình 3.5. Hình ảnh soi trên kính hiển vi quang học trực khuẩn lao AFB nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen 44 Hình 3.6. Đặc điểm phát triển của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy Ogawa 45 Hình 3.7. Điện di đồ DNA trên gel agarose 1,0% 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Lao là một bệnh nhiễm khuẩn phổ biến ở người, số người mắc lao trong cộng đồng ngày càng tăng. Theo Tổ chức Y tế thế giới, năm 1994 có khoảng 1/3 dân số thế giới bị nhiễm lao. Mỗi năm có 30 triệu người nhiễm lao, mỗi giây có thêm 1 người nhiễm lao. Bệnh lao là bệnh gây tử vong hàng đầu ở người lớn, mỗi năm có 3 triệu người chết vì lao, đến năm 2020 có thêm 1 tỷ người nhiễm lao trong đó có khoảng 70 triệu người chết vì lao mà chủ yếu là lao phổi. Bệnh lao chủ yếu phát triển ở những nước nghèo, các nước đang phát triển, khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở những nước có thu nhập vừa và thấp [8, 9, 10, 43]. Ở các nước đang phát triển, bệnh lao vẫn còn tồn tại trong cộng đồng do rất nhiều yếu tố: sự bùng nổ của đại dịch HIV/AIDS, tăng dân số không kìm hãm được, do sự phân cực, phân hóa giàu nghèo, hoạt động chưa hiệu quả của các chương trình phòng chống lao quốc gia. Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (WHO, 2008). Trong khu vưc Tây-Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao xuất hiện thêm hàng năm. Để làm giảm tỷ lệ mắc bệnh cũng như tỷ lệ tử vong do bệnh lao, một trong những biện pháp mà Tổ chức Y tế thế giới ưu tiên hàng đầu là đẩy mạnh việc phát hiện sớm các trường hợp mắc lao, điều trị kịp thời để loại bỏ nguồn lây, hạn chế tối đa sự lây nhiễm trong cộng đồng. Bệnh lao là bệnh nhiễm khuẩn, tác nhân gây bệnh là trực khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Phát hiện và chẩn đoán lao quan trọng nhất chủ yếu dựa vào việc phát hiện trực khuẩn lao trong cơ thể hoặc trong chất xuất tiết của người bị bệnh lao. Tìm thấy trực khuẩn lao được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong việc chẩn đoán bệnh lao. Hiện nay có một số phương pháp giúp chẩn đoán xác định hoặc hỗ trợ chẩn đoán xác định vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao như: nhuộm soi trực tiếp, nuôi cấy phân lập, tiêm truyền động vật cảm nhiễm, test tuberculin, ELISA,… [13, 23]. [...]... gây bệnh lao sẽ giải quyết được yêu cầu cấp bách trong công tác phát hiện và điều trị bệnh lao, góp phần khống chế và đẩy lùi dần bệnh lao trong cộng đồng Từ yêu cầu thực tế đó chúng tôi tiến hành đề tài: Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật PCR phát hiện trực tiếp Mycobacterium tuberculosis trong mẫu bệnh phẩm Mục tiêu nghiên cứu: 1 Phát hiện nhanh vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong các mẫu bệnh. .. bệnh phẩm thu nhận từ những bệnh nhân nghi mắc lao phổi và tràn dịch màng phổi do lao bằng kỹ thuật PCR 2 Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện nhanh vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh lao Lao là một trong những bệnh được ghi nhận sớm nhất trong. .. kĩ thuật nghiên cứu: 2.5.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm đờm và dịch màng phổi: Kỹ thuật lấy bệnh phẩm đờm - Số mẫu đờm cần lấy: Cần lấy ít nhất 3 mẫu đờm cho một bệnh nhân nghi mắc lao phổi Mẫu đờm 1: Lấy tại chỗ khi bệnh nhân đến khám Mẫu đờm 2: Sau khi lấy đờm tại chỗ để có xét nghiệm đờm lần thứ nhất Mẫu 3: Lấy tại chỗ khi bệnh nhân mang mẫu đờm thứ hai tới Kỹ thuật chọc dò dịch màng phổi: - Tư thế bệnh. .. đòi hỏi thời gian, giá thành của phương pháp khá cao không phù hợp với khả năng kinh tế của đa số bệnh nhân nghi lao [13, 22, 25] 1.4.3 Kỹ thuật PCR Đây là một trong những kỹ thuật có độ nhậy và độ đặc hiệu cao nhất Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc nhân các đoạn axit nucleic đặc biệt của vi khuẩn lao M tuberculosis có trong bệnh phẩm bằng cách sử dụng các đoạn mồi oligonucleotide đặc hiệu PCR là phương pháp... nghiên cứu Thu nhận mẫu bệnh phẩm Nhuộm soi trực tiếp Khử tạp Thuần nhất & xử lý mẫu Đếm số lượng AFB Nuôi cấy trên môi trường Ogawa Tách chiết & tinh sạch DNA Xác định đặc điểm khuẩn lạc M tuberculosis Nhân đoạn gene IS6110 bằng kỹ thuật PCR Điện di, kiểm tra, phát hiện trình tự IS6110 Đánh giá hiệu quả phương pháp chẩn đoán (Xác định: độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự báo dương tính, giá trị dự báo âm... [20] Trong những năm gần đây nhiều nhóm nghiên cứu đã sử dụng các kỹ thuật miễn dịch khác như: kỹ thuật huỳnh quang (IFT), kỹ thuật miễn dịch phóng xạ, kỹ thuật ngưng kết hạt latex,… để xác định nguyên nhân gây bệnh lao Song các nhóm nghiên cứu với mục đích phát hiện kháng nguyên M tuberculosis trực tiếp trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 19 bệnh phẩm. .. vẫn gặp khó khăn trong khâu xử lý mẫu Do vậy kỹ thuật còn có độ nhạy khá thấp Kỹ thuật phóng xạ cho độ nhạy và độ đặc hiệu khá cao song nó cũng đòi hỏi phương tiện tốn kém tạo giá thành cao và nguy hiểm do sử dụng chất phóng xạ, khó có thể áp dụng như ở nước ta [13, 20] 1.5 Phƣơng pháp PCR và các ứng dụng trong y học 1.5.1 Nguyên lý của kỹ thuật PCR Phản ứng chuỗi polymerase là một kỹ thuật đơn giản,... bản đồ gene, phát hiện gene, dòng hoá gene, giải mã trình tự DNA,… PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học: trong chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gene APC trong ung thư đại tràng, gene BRCA 1 - BRCA 2 trong ung thư vú, gene TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gene IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin, gene Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gene NF-1,2 trong u xơ... bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG) Clostridium difficile cũng được định loại thông qua xác định các loại độc tố riêng biệt của chúng bằng PCR PCR còn được dùng để nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn Ví dụ, khảo sát gene pbp1a và 2a của Streptococcus pneumoniae bằng kỹ thuật PCRSSCP, kỹ thuật PCR phát hiện đột biến kháng Rifamicin ở gene rpoB, phát hiện. .. thường dùng hiện nay PCR là phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm, cho phép khuếch đại một đoạn DNA đích lên hàng triệu bản sao trong thời gian ngắn PCR đã được ứng dụng rộng rãi trong y sinh học, đặc biệt trong chẩn đoán nguyên nhân một số bệnh nhiễm trùng truyền nhiễm, nhiều nghiên cứu cho thấy đây là kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong chẩn đoán Ứng dụng và phát triển kỹ thuật PCR giúp chẩn . lao Mycobacterium tuberculosis trong bệnh phẩm đờm 33 3.1.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong bệnh phẩm dịch màng phổi 35 3.2. Hiệu quả của kỹ thuật PCR trong. ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN DUY HÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TRONG MẪU BỆNH PHẨM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã. HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN DUY HÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TRONG MẪU BỆNH PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngày đăng: 13/11/2014, 19:39

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan