- Phân loại dựa vào khả năng gây bệnh cho người và các động vật: Vi khuẩn lao người, vi khuẩn lao bò, vi khuẩn lao chim, vi khuẩn lao chuột.
1.5.2.Thành phần phản ứng Enzyme
deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg2+. Phản ứng chuỗi PCR được thực hiện trên thiết bị nhân DNA máy PCR [18, 29].
1.5.2. Thành phần phản ứng Enzyme Enzyme
Enzyme Taq polymerase là enzyme chịu nhiệt, được tách từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Hoạt tính của enzyme Taq giảm 50% sau 150 phút ở nhiệt 92,50C; sau 40 phút ở nhiệt độ 950
C và sau 5-6 phút ở nhiệt độ 970C. Nếu nhiệt độ tăng lên tới 950C trong 20 giây để biến tính DNA kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzyme Taq còn lại 65% sau 50 chu kì phản ứng.
DNA khuôn (template)
DNA khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đòi hỏi có độ tinh sạch cao. DNA khuôn có thể là sợi đơn hoặc sợi đôi của chuỗi DNA được biết trước trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi. Thông thường, nồng độ của DNA khuôn được đưa vào phản ứng PCR khoảng 10-500ng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đoạn mồi (primer)
Các đoạn mồi thực chất là các oligonucleotide dài khoảng 4-10 bazơ (đối với mồi ngẫu nhiên) hoặc khoảng 12-24 bazơ (đối với mồi đặc trưng). Nồng độ mồi thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1-0,5μM. Lượng mồi đưa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp (thường 106 phân tử DNA cần 108 phân tử mồi).
Các nucleotide (dNTPs)
dNTPs là hỗn hợp của bốn loại deoxyribonucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các nhà khoa học còn có thể sử dụng một số nucleotide đã được thay đổi như gắn thêm biotin hoặc digoxygenein,... Nồng độ phản ứng của các dNTP thường dùng vào khoảng 200mM mỗi loại, tuy nhiên ở nồng độ dNTP thấp (10- 100mM) Taq DNA polymerase hoạt động chính xác hơn.
Mỗi một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau:
(1). Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn ờ nhiệt độ 94-950C trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1-1,5 phút).
(2). Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp xuống 40- 650
C cho phép hai đoạn mồi gắn vào DNA mẫu ở vị trí tương đồng theo nguyên tắc bổ sung (A - T, G - C) ở hai đầu DNA cần nhân.
(3). Giai đoạn kéo dài: ở nhiệt độ 720C, DNA Taq polymerase hoạt động kéo dài đoạn DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu [18, 29, 40].