Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV)

1. Tính cấp thiết Dendrobium là giống lan được trồng phổ biến ở Việt Nam. Đây là một giống chiếm ưu thế trong họ hoa lan, bao gồm nhiều loài có hoa đẹp, có thể sử dụng cho mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu. Dendrobium đã thực sự trở thành một giống lan chủ lực đối với ngành sản xuất hoa lan ở Việt Nam trong nhiều năm qua. Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một trong những trung tâm sản xuất hoa lan lớn nhất cả nước, cùng với lan Mokara, Dendrobium là một trong hai giống lan đóng góp chính vào tổng sản lượng thu hoạch 6,7 triệu chậu và 68,9 triệu cành hoa lan (đạt giá trị 613,9 tỷ đồng) của ngành sản xuất hoa lan thành phố trong năm 2015 [10]. Tuy nhiên, hiện tại việc sản xuất lan Dendrobium nói riêng và hoa lan nói chung tại Thành phố Hồ Chí Minh cũng như cả nước vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước. Hoa lan vẫn được nhập khẩu từ các nước như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc để cung cấp cho thị trường trong nước. Nghiên cứu nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan là một trong những vấn đề có ý nghĩa quan trọng đối với ngành sản xuất hoa lan Việt Nam. Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng hoa lan, trong đó bệnh hại là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất. Nhiều loại bệnh khác nhau gây hại trên lan Dendrobium cũng như hoa lan nói chung đã được ghi nhận, nhưng đáng chú ý nhất là bệnh do virus gây ra. Hiện có hai loại virus gây hại phổ biến trên hoa lan đó là virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV) và virus đốm vòng (Odontoglossum ringspot virus - ORSV) [88]. Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus CyMV cao hơn so với virus ORSV trên các giống lan ở Việt Nam [2], [5], [7], và đặc biệt là lan Dendrobium được trồng ở một số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV [2]. Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang lây nhiễm rất nghiêm trọng trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam. 2 Cây lan nhiễm virus thường bị giảm sức sống, giảm số lượng và chất lượng hoa, từ đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng thu hoạch. Quan trọng hơn, do virus có khả năng phát triển tiềm ẩn và lan truyền nhanh chóng qua các dụng cụ làm vườn, nên thiệt hại thường diễn ra trên phạm vi lớn với mức độ rất nghiêm trọng. Đến nay, biện pháp duy nhất để kiểm soát bệnh virus vẫn là phòng tránh thông qua loại trừ các tác nhân lây nhiễm trong quá trình sản xuất giống và canh tác. Việc triển khai các quy trình kiểm soát bệnh gây tiêu tốn nhiều thời gian, chi phí và không phải lúc nào cũng mang lại hiệu quả như mong muốn. Do vậy, các biện pháp hiệu quả hơn vẫn đang được nghiên cứu, mà một trong số đó là tạo ra khả năng kháng virus cho cây bằng kỹ thuật chuyển gen dựa trên cơ chế can thiệp RNA (RNAi). Cho đến nay, nhiều giống cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên thế giới [34]. Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo giống cây trồng kháng bệnh virus cũng đã được triển khai ở Việt Nam, trên một số loại cây trồng, để tạo ra khả năng kháng với các loại virus khác nhau như thuốc lá kháng virus TMV [12], virus CMV [11] và kháng đồng thời cả hai loại virus TMV và CMV [3]; cà chua kháng virus TYLCV [13]; đu đủ kháng virus PRSV [4], đậu tương kháng virus SMV và BYMV [9]. Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có nghiên cứu nào được triển khai trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng kháng với virus CyMV, trong khi tình trạng nhiễm virus CyMV vẫn đang diễn ra rất nghiêm trọng trên giống lan này. Đề tài “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV)” được thực hiện nhằm mục đích đánh giá hiệu quả của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng kháng với virus CyMV, từ đó tiến đến tạo ra các dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus, phục vụ cho việc nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN XUÂN DŨNG ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi ĐỂ TẠO D NG VI U HẢ N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HÁNG VÀNG Cymbidium mosaic virus) LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH- 2017 i MỤC LỤC Trang LỜI C ĐO N i LỜI CẢ ƠN ii MỤC LỤC iv DANH SÁCH BẢNG xi DANH SÁCH HÌNH xiii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết Mục tiêu yêu cầu 3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Đóng góp luận án CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược hoa lan 1.1.1 Giới thiệu họ hoa lan 1.1.2 Giống lan Dendrobium 1.1.3 Sơ lược PLBs (Protocorm like bodies) 1.2 Sơ lược Cymbidium mosaic virus 1.2.1 Phân loại, hình dạng phân tử cấu trúc gen 1.2.2 Sự lây nhiễm di chuyển virus CyMV 1.2.3 Triệu chứng bệnh virus CyMV gây 1.2.4 Tình hình bệnh virus CyMV gây giống lan Việt Nam 10 1.3 Phương pháp chọn giống hoa lan 11 1.3.1 Chọn giống phương pháp cổ điển 11 1.3.2 Chọn giống phương pháp chuyển gen 11 1.3.3 Phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 11 1.3.3.1 Sơ lược phương pháp 11 1.3.3.2 Các dạng Agrobacterium tumefaciens dùng cho chuyển gen 13 iv 1.3.3.3 Cơ chế chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 13 1.3.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens hoa lan 14 1.4 Sự can thiệp RNA (RNAi) vai trò chọn giống trồng 19 1.4.1 Lịch sử phát RNAi 20 1.4.2 Cơ chế RNAi 23 1.4.3 Sự khởi đầu khuếch đại tín hiệu RNAi 25 1.4.4 Sự di chuyển tín hiệu RNAi .27 1.4.5 Mối liên hệ virus gây bệnh trồng RNAi 29 1.4.6 Vai trò RNAi chọn giống trồng kháng virus 30 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36 2.1 Nội dung nghiên cứu 36 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 36 2.1.2 Nội dung nghiên cứu .39 2.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia 40 2.2.1.1 Xác định điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen 40 2.2.1.2 Xác định nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), thời gian đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs 41 2.2.1.3 Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn sàng lọc PLBs chuyển gen 42 2.2.2 Phân lập xác định trình tự gen CP virus CyMV 43 2.2.2.1 Thu thập mẫu lan nhiễm virus 43 2.2.2.2 Phân lập gen CP 44 2.2.2.3 Nhân dòng gen CP .44 2.2.2.4 Giải trình tự gen CP phân tích tương đồng trình tự .46 2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi biến nạp vào A tumefaciens 46 2.2.3.1 Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP ORF2-4+CP 46 2.2.3.2 Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP ORF2-4+CP hệ thống Gateway 47 v 2.2.3.3 Tạo chủng A tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi pK7GWIWG2(II)/CP pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP 48 2.2.4 Tạo lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen CP ORF2-4+CP .48 2.2.4.1 Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 48 2.2.4.2 Chuyển cấu trúc RNAi đoạn gen CP ORF2-4+CP vào PLBs qua trung gian vi khuẩn A tumefaciens .49 2.2.4.3 Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển 49 2.2.4.4 Kiểm tra diện gen chuyển PLBs giả định chuyển gen 50 2.2.4.5 Thu nhận lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển kiểm tra diện gen mục tiêu 50 2.2.5 Đánh giá khả kháng virus CyMV lan chuyển gen lây nhiễm virus nhân tạo điều kiện in vitro 51 2.2.5.1 Lây nhiễm virus CyMV vào lan chuyển gen điều kiện in vitro 51 2.2.5.2 Đánh giá khả kháng virus CyMV lan chuyển gen 52 2.2.6 Phân tích xử lý số liệu 52 2.2.7 Điều kiện nuôi cấy 53 2.2.8 Thời gian địa điểm nghiên cứu 53 CHƯƠNG ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs 54 3.1.1 Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen 54 3.1.1.1 Nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo mẫu cấy in vitro 54 3.1.1.2 Môi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy in vitro 55 3.1.1.3 Môi trường thích hợp cho tăng sinh phát triển PLBs 57 3.1.2 Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs .58 3.1.2.1 Trường hợp chủng C58 58 3.1.2.2 Trường hợp chủng EHA105 .59 3.1.2.3 Trường hợp chủng LBA4404 .60 3.1.2.4 Về mức độ biểu gen GUS 61 vi 3.1.3 Các điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn sàng lọc PLBs chuyển gen 62 3.1.3.1 Nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs 62 3.1.3.2 Nồng độ hygromycin kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen 63 3.2 Phân lập xác định trình tự gen CP virus CyMV 66 3.2.1 Phân lập gen CP 66 3.2.2 Tạo dòng gen CP .67 3.2.3 Giải trình tự gen CP phân tích tương đồng trình tự 69 3.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP CP + ORF2-4 71 3.3.1 Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP ORF2-4+CP .72 3.3.1.1 Khuếch đại gen CP từ vector nhân dòng gen ORF2-4+CP từ vector pBSK/ORF2-4+CP .72 3.3.1.2 Gắn đoạn gen CP ORF2-4+CP vào vector pENTR 72 3.3.1.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi kỹ thuật Gatewway .76 3.3.1.4 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi 78 3.4 Tạo lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen CP ORF2-4+CP 79 3.4.1 Chuyển cấu trúc RNAi đoạn gen CP ORF2-4+CP vào PLBs qua trung gian vi khuẩn A tumefaciens 79 3.4.1.1 Giai đoạn đồng nuôi cấy 79 3.4.1.2 Giai đoạn khử khuẩn 81 3.4.2 Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển 82 3.4.3 Kiểm tra diện gen chuyển PLBs giả định chuyển gen 83 3.4.4 Thu nhận lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển .85 3.5 Khả kháng CyMV lan chuyển gen điều kiện in vitro 90 3.5.1 Về biểu triệu chứng nhiễm virus CyMV 90 3.5.2 Về diện virus lan 92 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .95 Kết luận 95 Đề nghị 96 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 97 vii TÀI LIỆU THAM KHẢO 98 Tài liệu tiếng Việt 98 Tài liệu tiếng Anh 99 PHỤ LỤC Phụ lục Môi trường nuôi cấy thực vật vi khuẩn Phụ lục Một số triệu chứng nghi nhiễm virus mẫu lan thu thập Phụ lục Quy trình chuyển gen vào PLBs lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phụ lục Kết so sánh trình tự gen CP gen ORF2-4 CyMV Phụ lục Kết xử lý thống kê viii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BA Benzyladenine BGMV Bean golden mosaic virus BYMV Bean yellow mosaic virus CBP Cap binding protein CGMMV Cucumber green mottle mosaic virus CMV Cucumber mosaic virus CP Coat protein gene CPMR Coat protein-mediated resistance CyMV Cymbidium mosaic virus 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid DCL Dicer like protein DNA Deoxyribo nucleic acid dsRBD Double-stranded RNA binding domain GFP Green fluorescent protein HCPro Helper component-proteinase hpRNA Hairpin RNA ihpRNA Intron hairpin RNA LB Lysogeny broth MCS Multi cloning site miRNA MicroRNA mRNA Messenger RNA MS Murashige and Skoog LS Linsmaier and Skoog NAA Naphthaleneacetic acid NCR Noncoding region NMV Narcissus mosaic virus ORF Open reading frame ix ORSV Odontoglossum ringspot virus PAMV Potato aucuba mosaic virus RdRp RNA-dependent RNA polymerase RISC RNA-induced silencing complex RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference siRNA Small interfering RNA SMYEaV Strawberry mild yellow edge-associated virus SMV Soybean mosaic virus sRNA Small RNA TGB Triple-gene-block TMV Tobacco mosaic virus TRV Tobacco rattle virus TRSV Tobacco ringspot virus TYLCV Tomato yellow leaf curl virus WCMV White clover mosaic virus x DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1.1 Kết ứng dụng RNAi nhiều loại virus thực vật khác 31 Bả 3.1 Tỷ lệ đoạn thân mang chồi ngủ lan Dendrobium Sonia sống vô trùng sau 14 ngày nuôi cấy .54 Bả 3.2 Tỷ lệ mẫu lát cắt mỏng mô thân lan Dendrobium Sonia in vitro cảm ứng với môi trường sau tuần nuôi cấy .55 Bả 3.3 Sự thay đổi trọng lượng PLBs môi trường 57 Bả 3.4 Tỷ lệ mẫu dương tính sau nhuộm GUS nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A tumefaciens C58 59 Bả 3.5 Tỷ lệ mẫu dương tính sau nhuộm GUS nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 60 Bả 3.6 Tỷ lệ mẫu dương tính sau nhuộm GUS nồng độ AS theo thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A tumefaciens LBA4404 61 Bả 3.7 Khả diệt khuẩn cefotaxime nồng độ khác PLBs 63 Bả 3.8 Tỷ lệ PLBs chết tác động hygromycin nồng độ khác theo thời gian nuôi cấy 64 Bả 3.9 Tỷ lệ PLBs chết tác động kanamycin nồng độ khác nhau, theo thời gian nuôi cấy 65 Bả 3.10 Tỷ lệ tương đồng trình tự gen CP virus CyMV phân lập khu vực khác Việt Nam 70 Bả 3.11 Tỷ lệ tương đồng trình tự gen CP virus CyMV phân lập khu vực Việt Nam số khu vực giới 71 Bả 3.12 Kích thước phân đoạn thu cắt vector tái tổ hợp pK7GWIWG2(II)/CP; pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP XbaI HindIII 77 xi Bả 3.13 Tỷ lệ PLBs giả định chuyển gen thu sau giai đoạn sàng lọc với kanamycin 82 Bả 3.14 Kết kiểm tra diện gen mục tiêu PLBs chuyển gen 85 Bả 3.15 Tần suất xuất dạng kiểu hình lan Dendrobium Sonia thu từ cụm PLBs chuyển gen 87 Bả 3.16 Kết kiểm tra diện gen mục tiêu lan phát triển từ PLBs chuyển gen 89 Bả 3.17 Kết đánh giá khả kháng virus lan phát triển từ PLBs chuyển gen sau tuần lây nhiễm virus .93 xii Tỷ lệ mẫ dươ í sa k 4.1 Trường hợp chủng C58 4.1.1 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.1.2 Sau ngày đồng nuôi cấy ộm GUS 4.1.3 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.1.4 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.1.5 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.2 Trường hợp chủng EHA105 4.2.1 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.2.2 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.2.3 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.2.4 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.2.5 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.3 Trường hợp chủng LBA4404 4.3.1 Sau ngày đồng nuôi cấy * Sau ngày đồng nuôi cấy 4.3.2 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.3.3 Sau ngày đồng nuôi cấy 4.3.4 Sau ngày đồng nuôi cấy Tỷ lệ mẫu s ê mô ường cefotaxime Số liệu chuyển đổi theo phương thức (X+0,5)1/2, với X số liệu thực 5.1 Sau ngày nuôi cấy 5.2 Sau 14 ngày nuôi cấy Tỷ lệ mẫu chết ê mô ường hygromycin Số liệu chuyển đổi theo phương thức (X+0,5)1/2, với X số liệu thực 6.1 Sau 14 ngày nuôi cấy 6.2 Sau 28 ngày nuôi cấy Tỷ lệ mẫu chế ê mô ường kanamycin Số liệu chuyển đổi theo phương thức (X+0,5)1/2, với X số liệu thực 7.1 Sau 20 ngày nuôi cấy 7.2 Sau 40 ngày nuôi cấy ... virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV) thực nhằm mục đích đánh giá hiệu việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi lan Dendrobium để tạo khả kháng với virus CyMV, từ tiến đến tạo dòng lan. .. khai lan Dendrobium để tạo khả kháng với virus CyMV, tình trạng nhiễm virus CyMV diễn nghiêm trọng giống lan Đề tài Đánh giá hiệu kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả kháng. .. việc tạo khả kháng virus cho lan Dendrobium - Góp phần hoàn thiện phương pháp đánh giá khả kháng virus lan chuyển gen điều kiện nuôi cấy in vitro - Tạo dòng lan Dendrobium Sonia có khả kháng virus