Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (cymbidium mosaic virus CyMV) (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -  - NGUYỄN XUÂN DŨNG ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi ĐỂ TẠ D NG I U N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HẢ HÁNG NG Cymbidium mosaic virus) Chuyên ngành: Di truyền chọn giống trồng Mã số: 62.62.01.11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP TP Hồ Chí Minh, 2017 Công trình hoàn thành tại: TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP MIỀN NAM Người hướng dẫn khoa học: T DƯƠNG H XÔ PGS.TS CHU HOÀNG HÀ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Thư viện Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Dendrobium giống lan trồng phổ biến Việt Nam Đây giống chiếm ưu họ hoa lan, bao gồm nhiều loài có hoa đẹp, sử dụng cho mục đích sản xuất hoa cắt cành hoa chậu Dendrobium thực trở thành giống lan chủ lực ngành sản xuất hoa lan Việt Nam nhiều năm qua Tại Thành phố Hồ Chí Minh, trung tâm sản xuất hoa lan lớn nước, với lan Mokara, Dendrobium hai giống lan đóng góp vào tổng sản lượng thu hoạch 6,7 triệu chậu 68,9 triệu cành hoa lan (đạt giá trị 613,9 tỷ đồng) ngành sản xuất hoa lan thành phố năm 2015 (UBND Tp Hồ Chí Minh, 2016) Tuy nhiên, việc sản xuất lan Dendrobium nói riêng hoa lan nói chung Thành phố Hồ Chí Minh nước chưa đáp ứng nhu cầu nước Hoa lan nhập từ nước Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc để cung cấp cho thị trường nước Việc nghiên cứu nâng cao suất sản lượng hoa lan vấn đề có ý nghĩa quan trọng ngành sản xuất hoa lan Việt Nam Có nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến suất sản lượng hoa lan, bệnh hại yếu tố gây ảnh hưởng nghiêm trọng Nhiều loại bệnh khác gây hại lan Dendrobium hoa lan nói chung ghi nhận, đáng ý bệnh virus gây Hiện có hai loại virus gây hại phổ biến hoa lan virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV) virus đốm vòng (Odontoglossum ringspot virus - ORSV) (Zettler cs, 1990) Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus CyMV cao so với virus ORSV giống lan Việt Nam (Dũng cs, 2009, Hồng cs, 1999; Quỳnh cs, 2007), đặc biệt lan Dendrobium trồng số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh bị nhiễm virus CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV (Dũng cs, 2009) Như vậy, thấy virus CyMV lây nhiễm nghiêm trọng giống lan Dendrobium Việt Nam Cây lan nhiễm virus thường bị giảm sức sống, giảm số lượng chất lượng hoa, từ ảnh hưởng nghiêm trọng đến suất sản lượng thu hoạch Quan trọng hơn, virus có khả phát triển tiềm ẩn lan truyền nhanh chóng qua dụng cụ làm vườn, nên thiệt hại thường diễn phạm vi lớn với mức độ nghiêm trọng Đến nay, biện pháp để kiểm soát bệnh virus phòng tránh thông qua loại trừ tác nhân lây nhiễm trình sản xuất giống canh tác Việc triển khai quy trình kiểm soát bệnh gây tiêu tốn nhiều thời gian, chi phí lúc mang lại hiệu mong muốn Do vậy, biện pháp hiệu nghiên cứu, mà số tạo tính kháng virus cho kỹ thuật chuyển gen dựa chế can thiệp RNA (RNAi) Cho đến nay, nhiều giống trồng kháng virus tạo kỹ thuật chuyển gen RNAi giới (Gottula Fuchs, 2009) Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo giống trồng kháng bệnh virus triển khai Việt Nam, số loại trồng, để tạo khả kháng với loại virus khác thuốc kháng virus TMV (Vân cs, 2009), virus CMV (Vân cs, 2008) kháng đồng thời hai loại virus TMV CMV (Hà cs, 2009); cà chua kháng virus TYLCV (Yến cs, 2011); đu đủ kháng virus PRSV (Hà cs, 2011), đậu tương kháng virus SMV BYMV (Thu cs, 2014) Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu triển khai lan Dendrobium để tạo khả kháng với virus CyMV, tình trạng nhiễm virus CyMV diễn nghiêm trọng giống lan Đề tài “Đánh giá hiệu kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV)” thực nhằm mục đích đánh giá hiệu việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi lan Dendrobium để tạo khả kháng với virus CyMV, từ tiến đến tạo dòng lan Dendrobium có khả kháng virus, phục vụ cho việc nâng cao suất sản lượng hoa lan Mục tiêu yêu cầu Nghiên cứu áp dụng đánh giá hiệu kỹ thuật chuyển gen RNAi việc tạo khả kháng virus CyMV cho lan Dendrobium điều kiện nuôi cấy in vitro Đối tượng phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu thực lan Dendrobium Sonia virus CyMV gây bệnh lan Các dòng lan chuyển gen tạo qua việc chuyển cấu trúc RNAi gen CP ORF2-4+CP từ virus CyMV vào mô lan (PLBs) kỹ thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens) Các thí nghiệm khảo sát, đánh giá nghiên cứu giới hạn điều kiện in vitro Ý nghĩa khoa học thực tiễn * Ý nghĩa khoa học - Góp phần làm sáng tỏ vấn đề mức độ bảo thủ trình tự gen CP phân lập từ virus CyMV Việt Nam - Góp phần hoàn thiện kỹ thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn A tumefaciens đối tượng lan Dendrobium - Tạo tiền đề quan trọng cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo khả kháng virus cho lan Dendrobium hoa lan nói chung * Ý nghĩa thực tiễn Tạo dòng lan Dendrobium chuyển gen có khả kháng virus CyMV điều kiện in vitro, nguồn vật liệu cho nghiên cứu tạo giống lan kháng virus thông qua lai tạo Đóng góp luận án - Chứng minh tính bảo thủ trình tự gen CP phân lập từ virus CyMV Việt Nam - Khẳng định tính khả thi kỹ thuật chuyển gen RNAi việc tạo khả kháng virus cho lan Dendrobium - Góp phần hoàn thiện phương pháp đánh giá khả kháng virus lan chuyển gen điều kiện nuôi cấy in vitro - Tạo dòng lan Dendrobium Sonia có khả kháng virus điều kiện in vitro, nguồn vật liệu quan trọng cho nghiên cứu tạo giống lan kháng virus Cấu trúc luận án Luận án bao gồm có 107 trang chia thành phần: Mở đầu (04 trang); Tổng quan tài liệu (31 trang); Nội dung Phương pháp nghiên cứu (18 trang); Kết Thảo luận (41 trang); Kết luận Đề nghị (2 trang); Danh mục công trình công bố (01 trang Luận án gồm có 18 bảng số liệu; 40 hình ảnh minh họa; 88 tài liệu tham khảo bao gồm 13 tài liệu tiếng Việt 75 tài liệu tiếng Anh Ngoài luận án bao gồm phụ lục đính kèm Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Dendrobium Sonia dòng lan lai tạo từ tổ hợp lai Dendrobium Caesar x Dendrobium Tomie Drake tác giả Chittraphong, giới thiệu lần vào năm 1984 (Yang cs, 2003) Đây loại hoa phù hợp cho mục đích sản xuất hoa cắt cành hoa chậu So với nhiều loại lan khác, nhu cầu thị trường hoa lan Dendrobium Sonia không ngừng gia tăng nhiều năm qua Hiện có hai loại virus gây hại phổ biến hoa lan virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV) virus đốm vòng (Odontoglossum ringspot virus - ORSV) (Zetter cs, 1990) Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus CyMV cao so với virus ORSV giống lan Việt Nam (Dũng cs, 2009; Hồng cs, 1999; Quỳnh cs, 2007) đặc biệt lan Dendrobium trồng số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh bị nhiễm virus CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV (Dũng cs, 2009) Như vậy, thấy virus CyMV lây nhiễm nghiêm trọng giống lan Dendrobium Việt Nam Sự can thiệp RNA (RNA interference - RNAi) tượng im lặng gen sau phiên mã phân tử RNA mạch kép cảm ứng, công bố ban đầu giun tròn (Ceanorhabditis elegans) (Yamada cs, 2007) Việc khám phá RNAi cách mạng hóa lĩnh vực nghiên cứu chọn giống trồng RNAi diện công cụ đầy tiềm cho việc chọn giống trồng qua việc áp dụng đoạn trình tự RNA không mã hóa nhỏ, có khả kiểm soát biểu gen cách chuyên biệt trình tự (Abhary Rez, 2015) RNAi xem chế quan trọng để tạo khả kháng virus cho trồng (Baulcombe, 2004) Hiệu RNAi việc tạo khả kháng virus lần thông báo với kết kháng virus PVY (Potato virus Y) khoai tây Nhiều nghiên cứu ứng dụng RNAi để tạo khả kháng loại virus thực vật khác công bố (Abhary Rez, 2015) Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng RNAi để tạo khả kháng virus cho lan Dendrobium hạn chế Đối với nghiên cứu nước ngoài, công trình vấn đề Chuphrom cộng (2009) công bố lan Dendrobium Sonia Trong đó, nhóm tác giả chuyển cấu trúc RNAi gen CP từ virus CyMV vào PLBs phương pháp bắn gen Tuy nhiên, kết nghiên cứu dừng mức thu dòng lan có mang gen CP Còn nhiều vấn đề chưa làm rõ khả kháng virus tính ổn định gen chuyển nào, hiệu tạo tính kháng virus áp dụng RNAi sao,… Ngoài ra, việc sử dụng phương pháp bắn gen để đưa gen mục tiêu vào tế bào vấn đề cần xem xét, chuyển gen tạo phương pháp bắn gen thường khả sinh sản di truyền gen chuyển theo luật Menden (Alimohammadi Bagherieh-Najjar, 2009) Đối với nghiên cứu nước, chưa có công trình công bố vấn đề ứng dụng RNAi để tạo khả kháng virus cho lan Dendrobium hoa lan Do đó, cần có nghiên cứu với nội dung, phương pháp hoàn thiện phù hợp để tạo giống lan Dendrobium có khả kháng virus phục vụ cho sản xuất Chương NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu - Giả hành (thân) lan Dendrobium Sonia trưởng thành; mẫu lan Dendrobium nghi nhiễm virus thu thập từ vườn trồng lan - Các chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105, LBA4404, C58 mang vector pCambia 1301 - Các loại vector: pJET1.2, pENTRTM/D-TOPO®, pK7GWIWG2(II) - Đoạn gen ghép nối ORF2-4+CP dài 496 bp, tổng hợp nhân tạo gắn vào vector pBSK/ORF2-4+CP - Các trình tự mồi dùng cho khuếch đại gen: Mục đích Tên mồi Khuếch đại gen F-CCP CP virus R-CCP CyMV Trình tự mồi SP(bp) 5’- GGGATCCATGGGAGAGTCCACTCCAAC-3’ 5’-GGAATTCTTATTCAGTAGGGGGTCCAGGC-3’ 672 Kiểm tra gen F-pJET1.2 5’- CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC- 3’ vector R-pJET1.2 - AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG- 3’ pJET1.2 807 Khuếch đại Fi-ORF2-4 5’- CACCGCGGCCAATATAAAGA- 3’ đoạn gen từ vector pBSK Ri-CCP 5’- AGTCGACGGCATCGAAGAAG-3’ 500 Khuếch đại F-CCP1 đoạn gen CP R-CCP1 5’- CACCTGTCCGCCGCGCCTCTCTT- 3’ Kiểm tra gen F-M13 vector pENTR R-M13 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ Phát virus F-C CyMV R-C 5’-GTCTCTGGAACATCTGCAAAGC-3’ Kiểm chứng PCR Primer #1 phát gen Primer #2 5’- AGTTCGAGCCTGATTATCCC-3’ 5’- TCCGGCTAAGCATATTATGC-3’ 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ 5’-CCGCATCTTACGGAGGTAGC-3’ 5’- GCATGCCGCCAGCGTTCATC-3’ 450 780/820 257 297 2.1.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu thực lan Dendrobium Sonia trưởng thành virus CyMV gây bệnh hoa lan Nội dung 1: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn A tumefaciens Nội dung 2: Nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen CP virus CyMV Việt Nam Nội dung 3: Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen RNAi mang phân đoạn gen CP gen ORF2-4 virus CyMV Nội dung 4: Nghiên cứu tạo lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi gen CP gen ORF2-4+CP Nội dung 5: Nghiên cứu đánh giá khả kháng virus CyMV lan chuyển gen phương pháp lây nhiễm virus nhân tạo điều kiện in vitro 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia * Xác định điều kiện thích hợp để tạo PLBs Thực thí nghiệm nuôi cấy để xác định yếu tố: nồng độ Ca(OCl)2 (15-30%) để khử trùng đoạn thân mang chồi ngủ; nồng độ BA (0,1-0,5 mg/l), NAA (0,5-5 mg/l) bổ sung vào môi trường MS để tạo PLBs từ lát cắt thân lan in vitro tăng sinh PLBs * Xác định nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nuôi cấy chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen Thực thí nghiệm chuyển gen vào PLBs với yếu tố thay đổi: chủng vi khuẩn (C58, EHA105, LBA4404), nồng độ AS (0-300 µM), thời gian nuôi cấy Đánh giá hiệu chuyển gen nhuộm GUS * Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn sàng lọc PLBs Thực thí nghiệm nuôi cấy PLBs môi trường MS bổ sung nồng độ khác cefotaxime (0-700 mg/l) hay kanamycin (0-700 mg/l), hygromycin (0-15 mg/l) để loại vi khuẩn từ PLBs hay sàng lọc PLBs chuyển gen 2.2.2 Phân lập xác định trình tự gen CP CyMV * Phân lập gen CP CyMV tỉnh Việt Nam Tiến hành ly trích RNA virus từ mẫu (Berendzen cs, 2005) thực phản ứng RT-PCR với cặp mồi thiết kế để khuếch đại toàn gen CP * Dòng hóa gen CP phân lập vào vi khuẩn Gen CP gắn vào vector pJET1.2 biến nạp vào tế bào E.coli Sàng lọc tế bào mang vector tái tổ hợp môi trường LB + 100 mg/l ampicilin Kiển tra gen PCR khuẩn lạc với mồi pJET1.2 enzyme cắt hạn chế BamHI EcoRI (nằm đầu vị trí gắn gen) * Giải trình tự gen CP phân tích tương đồng Vector mang gen giải trình tự phân tích chương trình BLAST 2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi * Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen mục tiêu Thực phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen CP (450 bp) gen ghép nối ORF2-4+CP (500 bp), gắn vào vector biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli Sàng lọc tế bào mang vector tái tổ hợp môi trường LB + 50mg/l kanamycin Kiểm tra gen PCR khuẩn lạc với mồi M13 enzyme cắt hạn chế SalI (trên gen) NotI (trên vector) * Thiết kế vector RNAi biến nạp vào A tumefaciens Thực phản ứng tái tổ hợp vector pENTR pK7GWIWG2(II) để đưa gen mục tiêu vào vector pK7GWIWG2(II) kỹ thuật Gateway Sản phẩm phản ứng biến nạp vào tế bào E.coli sàng lọc môi trường LB + 100 mg/l spectinomycin Kiểm tra gen PCR khuẩn lạc với mồi M13 enzyme cắt hạn chế XbaI HindIII (nằm vector) Biến nạp vector tái tổ hợp vào A tumefaciens C58 sàng lọc môi trường LB + 50 mg/l ampicilin, 100 mg/l spectinomycin 50 mg/l rifamycin 2.2.4 Tạo lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi * Chuyển cấu trúc RNAi vào PLBs A tumefaciens Lây nhiễm PLBs với A tumefaciens C58 mang vector RNAi, nuôi cấy môi trường MS + 0,3 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA 100 M AS ngày, loại vi khuẩn với 300 mg/l cefotaxime Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển với 500 mg/l kanamycin kiểm tra diện gen chuyển PCR * Thu nhận lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển PLBs mang cấu trúc gen chuyển nuôi cấy môi trường ½ MS để thu nhận lan hoàn chỉnh 2.2.5 Đánh giá khả kháng CyMV lan chuyển gen Ly trích dịch virus từ mẫu lan nhiễm virus, lọc vô trùng tiêm vào lan điều kiện in vitro để lây nhiễm Đánh giá khả kháng virus lan quan sát hình thái phản ứng RT-PCR 2.2.6 Phân tích xử lý số liệu Các thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Số liệu nghiên cứu được phân tích ANOVA, so sánh khác biệt mức p< 0,05 phân hạng (nếu có) theo Duncan phần mềm SPSS 2.2.7 Điều kiện nuôi cấy Mẫu thực vật nuôi cấy điều kiện: ánh sáng 2.500  500 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ 25  2oC, ẩm độ 55  5% Vi khuẩn nuôi cấy tối, nhiệt độ 28oC (A tumefaciens) hay 37oC (E coli), lắc 200 vòng/phút 2.2.8 Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực thời gian từ 01/2011-12/2015 Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN 3.1.1 Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs * Nồng độ chất khử trùng để tạo mẫu cấy in vitro Sau 14 ngày, tỉ lệ mẫu sống vô trùng đạt cao nồng độ 25% Việc tiếp tục tăng nồng độ Ca(OCl)2 lên mức cao 25% không làm tăng mà làm giảm tỷ lệ mẫu sống vô trùng (Bảng 3.1) Như vậy, Ca(OCl)2 25% thích hợp cho khử trùng mẫu Chồi ngủ từ mẫu cấy tăng trưởng thành chồi sau tuần (Hình 3.1) 3.1.2 Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs * Trường hợp chủng C58 Tỷ lệ mẫu dương tính GUS đạt cao (71,67%) thời điểm ngày với hai trường hợp có (100 µM) AS (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Tỷ lệ mẫu dương tính sau nhuộm GUS nồng độ AS theo thời gian nuôi cấy với chủng A tumefaciens C58 Nồng độ AS (µM) 50 100 200 300 ANOVA Số mẫu chuyển gen 10 10 10 10 10 Tỉ lệ mẫu dương tính GU (%) 46,67 46,67 40,00 53,33 33,33 NS 76,67 60,00 56,67 61,67 41,67 NS ngày gày ngày a 55,42 41,67 26,67 43,89 50,00 NS 57,92a 41,67b 51,67ab 45,00b 48,33ab * 78,33 58,33b 71,67a 60,00b 63,33b * *: Khác biệt có ý nghĩa mức p < 0,05; NS: khác biệt * Trường hợp chủng EHA105 Tỷ lệ mẫu dương tính GUS đạt cao (75,00%) thời điểm ngày với 100 µM AS (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Tỷ lệ mẫu dương tính sau nhuộm GUS nồng độ AS theo thời gian nuôi cấy với chủng A tumefaciens EHA105 Nồng độ AC (µM) 50 100 200 300 ANOVA Số mẫu chuyển gen 10 10 10 10 10 Tỉ lệ mẫu dương tính GU ngày 53,33 36,67 60,00 53,33 26,67 NS ngày 60,00 58,33 68,33 56,67 68,33 NS ngày 51,67b 50,00b 75,00a 46,67b 44,44b * %) ngày 51,67 70,00 60,00 54,17 54,44 NS ngày 46,67ab 31,67bc 36,67abc 53,33a 20,00c * *Khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05; NS: khác biệt * Trường hợp chủng LBA4404 Tỷ lệ mẫu dương tính GUS đạt cao 100 µM AS (73,33%) sau ngày đồng nuôi cấy (Bảng 3.6) 11 Bảng 3.6 Tỷ lệ mẫu dương tính sau nhuộm GUS nồng độ AS theo thời gian nuôi cấy với chủng A tumefaciens LBA4404 Nồng độ AS (µM) Số mẫu chuyển gen 10 10 10 10 10 Tỉ lệ mẫu dương tính GU %) ngày b c 20,00 43,33 33,33 20,00d 00,00b a ab b 50 40,00 50,00 58,67 61,11 13,33b a a b a 100 56,67 67,78 69,33 73,33 23,33ab a c b 200 36,67 63,33 35,57 49,30 46,67a bc c b a 300 40,00 55,00 46,67 36,67 0,00b b ANOVA * NS * * * *: Khác biệt có ý nghĩa mức p < 0,05; NS: khác biệt Như vậy, với chủng vi khuẩn, hiệu chuyển gen đạt cao 100 µM AS sau hay ngày đồng nuôi cấy * Về mức độ biểu gen GUS Các mẫu chuyển gen trường hợp có xuất màu (xanh chàm) khác biệt so với đối chứng không chuyển gen (không màu), với mức độ khác nhau: biểu dạng khảm, biểu thành mảng hay biểu toàn mẫu (Hình 3.4) A B C D 0,5 mm Hình 3.4 Các mức độ biểu gen GUS PLBs chuyển gen (A) Đối chứng không chuyển gen, (B) Biểu dạng khảm, (C) Biểu thành mảng, (D) Biểu toàn mẫu Tóm lại, việc chuyển gen vào PLBs lan Dendrobium Sonia thực thành công với chủng vi khuẩn C58, EHA105 LBA4404 Sự chuyển gen xảy ổn định sau ngày (C58 EHA105) hay ngày (LBA4404) đồng nuôi cấy Nồng độ chất cảm ứng AS thích hợp cho chuyển gen 100 µM Kết phù hợp với nghiên cứu Men cộng (2003) Tuy nhiên, có khác biệt mức độ phụ thuộc vào chất cảm ứng AS chủng vi khuẩn sử dụng Trong đó, chủng C58 có khả chuyển gen vào PLBs với phụ thuộc vào chất cảm ứng so với hai chủng vi khuẩn lại 12 3.1.3 Các điều kiện thích hợp để loại khuẩn sàng lọc PLBs * Nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn Khả diệt khuẩn tỉ lệ PLBs sống cao đạt với 300 mg/l cefotaxime sau 14 ngày (Bảng 3.7) Bảng 3.7 Khả diệt khuẩn cefotaxime PLBs Nồng độ cefotaxime (mg/l) Thời gian nuôi cấy (ngày) 14 Tình trạng Tình trạng Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu nhiễm nhiễm sống (%) sống (%) khuẩn khuẩn 300 500 700 100,00 93,30 86,70 80,00 +++ ++ + - 100,00aa 80,00 40,00b 0,00c +++ - ANOVA NS * *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05; NS: khác biệt, (+) Mức độ nhiễm khuẩn PLBs, (-) Không nhiễm khuẩn Như vậy, cefotaxime 300 mg/l thích hợp cho việc diệt khuẩn Phù hợp với kết này, cefotaxime 300 mg/l sử dụng để diệt vi khuẩn sau giai đoạn đồng nuôi cấy lan Phalaenopsis (Belarmino Mii, 2000) * Nồng độ hygromycin kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs - Trường hợp hygromycin Tỷ lệ PLBs chết cao (100%) với hygromycin nồng độ 7, 10 15 mg/l sau 28 ngày nuôi cấy (Bảng 3.8) Như vậy, hygromycin 7-15 mg/l thích hợp cho sàng lọc PLBs chuyển gen, phù hợp với mức 10 mg/l mà Shretha cộng (2010) sử dụng lan Vanda Bảng 3.8 Tỷ lệ PLBs chết tác động hygromycin nồng độ khác theo thời gian nuôi cấy Tỷ lệ PLBs chết theo thời gian (%) Nồng độ hygromycin (mg/l) 14 ngày 28 ngày 10 15 0,00c 13,33b 86,67a 88,89a 90,00a 0,00c 26,67b 100,00a 100,00a 100,00a ANOVA * * *: Khác biệt có ý nghĩa mức p < 0,05 13 - Trường hợp kanamycin Sau 40 ngày, tỷ lệ PLBs chết chia thành mức: thấp (100 - 300 mg/l), trung bình (400 - 500 mg/l) cao (700 mg/l) (Bảng 3.9) Nồng độ thấp không phù hợp cho chọn lọc, nồng độ trung bình dùng cho sàng lọc sơ trước chuyển sang nồng độ cao Bảng 3.9 Tỷ lệ PLBs chết tác động kanamycin nồng độ khác nhau, theo thời gian nuôi cấy Nồng độ Tỷ lệ mẫu chết theo thời gian kanamycin (mg/l) (%) 20 ngày 40 ngày 0,00b 0,00c b 100 0,00 0,00c b 200 0,00 3,33c b 300 0,00 3,33c ab 400 10,00 23,33b a 500 13,33 43,33b a 700 36,67 93,33a ANOVA * * *: Khác biệt có ý nghĩa mức p < 0,05 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN CP CỦA CyMV 3.2 PHÂN LẬP 3.2.1 Phân lập gen CP Kết PCR thu sản phẩm có kích thước gần 700 bp (Hình 3.5), phù hợp với kích thước gen cần phân lập (672 bp) Như vậy, gen CP khuếch đại thành công L 4 L 700bp 700bp 500bp 500bp Hình 3.6 Kết kiểm tra gen CP Hình 3.5 Kết điện di kiểm tra sản dòng vi khuẩn với cặp mồi phẩm khuếch đại gen CP (L) Thang F-CCP R-CCP (L) Thang DNA, DNA, (1-3) Mẫu, (4) Chứng âm 3.2.2 Tạo dòng gen CP (2-9) Mẫu, (1) Chứng âm Sau biến nạp thu dòng khuẩn lạc phát triển môi trường có 100 mg/l ampicilin Khuẩn lạc tiếp tục kiểm tra PCR với cặp mồi 14 F-CCP/R-CCP định vị gen Kết khuếch đại phân đoạn DNA vị trí khoảng 700 bp, phù hợp với sản phẩm dự kiến 672 bp (Hình 3.6) Khuẩn lạc tiếp tục kiểm tra với mồi F-pJET1.2/R-pJET1.2 định vị vector thu phân đoạn DNA gần 800 bp, phù hợp với dự kiến (807 bp) (Hình 3.7) Plasmid từ vi khuẩn kiểm tra với enzyme BamHI EcoRI thu phân đoạn DNA gần 700 bp, phù hợp với dự kiến (672 bp) (Hình 3.8) Như vậy, gen CP tạo dòng thành công L L 3000bp 1000bp 700bp 700bp Hình 3.8 Kết kiểm tra gen CP Hình 3.7 Kết kiểm tra gen dòng vi khuẩn enzyme CP dòng vi khuẩn BamHI EcoRI (L) Thang DNA, với cặp mồi pJET1.2 (L) (1) Mẫu, (2) Chứng âm Thang DNA, (1-2) Mẫu, (3) Chứng 3.2.3 Giảiâm trình tự gen CP phân tích tương đồng trình tự Các trình tự gen phân lập tương đồng với trình tự gen CP CyMV công bố ngân hàng gen NCBI mức từ 95% trở lên (Hình 3.9) Kết chứng tỏ trình tự gen trình tự gen CP CyMV Hình 3.9 Kết so sánh trình tự gen CP với trình tự công bố ngân hàng gen NCBI Các trình tự phân lập khu vực khác Việt Nam có tương đồng cao Tỷ lệ tương đồng trình tự thay đổi tùy thuộc vào 15 khoảng cách địa lý khu vực phân lập dao động khoảng từ 9599% (Bảng 3.10) Bảng 3.10 Tỷ lệ tương đồng trình tự gen CP virus CyMV phân lập khu vực khác Việt Nam Tỷ lệ tương đồng (%) Trình tự HCM1 HCM2 DaLat HaNoi BacGiang ThaiNguyen HCM1 HCM2 DaLat HaNoi Bac Giang Thai Nguyen 100 99 96 95 96 100 99 96 95 96 99 99 96 95 96 96 96 96 97 97 95 95 95 97 99 96 96 96 97 99 - Các trình tự phân lập Việt Nam có tương đồng cao với trình tự nước Tỷ lệ tương đồng dao động từ 95-99% (Bảng 4.11) Như vậy, trình tự gen CP virus CyMV có tính bảo thủ cao vùng Điều đảm bảo cho kháng virus hiệu chuyển gen tạo RNAi Bảng 3.11 Tỷ lệ tương đồng trình tự gen CP virus CyMV Việt Nam số khu vực giới Tỷ lệ tương đồng (%) Trình tự HCM1 HCM2 DaLat HaNoi BacGiang ThaiNguyen 3.3 THIẾT KF85326 AY429021 AB693982 AF405728 AB541560 EF125180 China Taiwan Indonesia Singapore Korea Hawai 97 97 97 97 96 96 Ế ECT 96 96 96 99 97 97 97 97 97 97 96 97 95 95 95 97 95 95 97 97 97 98 97 97 96 96 96 97 96 96 CHUYỂN GEN RNAi Vector RNAi thiết kế với đoạn gen CP (450 bp) thu nhận từ vector nhân dòng mang gen CP; đoạn gen ghép nối ORF2-4+CP (496 bp), tổng hợp nhân tạo từ phân đoạn 302 bp (nt 819-1120) gen ORF2-4 phân đoạn 194 bp (nt 279-472) gen CP gắn vào vector pBSK 16 3.3.1 Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP/ORF2-4+CP * Khuếch đại đoạn gen CP gen ORF2-4+CP từ vector Theo tính toán, đoạn gen CP ORF2-4+CP có kích thước tương ứng 450 bp 500 bp Kết thu phân đoạn DNA gần vị trí 450 bp (CP) 500 bp (ORF2-4+CP) Điều cho thấy, đoạn gen mục tiêu khuếch đại thành công (Hình 3.10) L L L 10 1000bp 500bp A 250bp 500bp B 750bp 250bp Hình 3.10 Kết kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen CP (A) ORF2-4+CP (B) (1) Mẫu, (L) Thang DNA.Chứng âm Hình 3.11 Kết kiểm tra phân đoạn gen CP dòng vi khuẩn biến nạp vector pENTR/CP với cặp mồi M13 * Gắn đoạn gen CP ORF2-4+CP vào vector pENTR TOPO (L) Thang DNA, (1-10) Mẫu Kết kiểm tra dòng tế bào biến nạp vector (đã gắn gen) PCR với mồi M13 cho thấy có diện phân đoạn DNA vị trí gần 750 bp (CP) 750-1000 bp (ORF2-4+CP) (Hình 3.11 3.12), phù hợp với kích thước dự kiến (780 bp 820 bp Điều cho thấy gen mục tiêu gắn vào vector 1 L L 3000bp 1000bp 250bp 3000bp L 500bp 750bp A Hình 3.12 Kết kiểm tra diện phân đoạn gen CP (A) ORF2-4+CP (B) vi khuẩn enzyme SalI NotI B Hình 3.13 Kết kiểm tra diện phân đoạn gen CP (A) ORF2-4+CP (B) vi khuẩn enzyme SalI NotI Kết cắt plasmid pENTR tái tổ hợp với enzyme SalI NotI thu phân đoạn DNA vị trí 3000 bp 250 bp (CP), 2500 bp 500 bp (ORF24+CP) (Hình 3.13), phù hợp với kích thước tính toán: 2839 bp 201 bp (CP), 2574 bp 502 bp (ORF2-4+CP) Điều lần khẳng định phân đoạn gen CP ORF2-4+CP gắn thành công vào vector pENTR 17 L 2 L Bảng 3.12 Kích thước phân L đoạn thu cắt vector pK7GWIWG2(II) /CP/ ORF2- 500bp 400bp 500bp A 4+CP Xba I Hind III B Hình 3.14 Kết kiểm tra gen CP (A) gen ORF2-4+CP (B) dòng khuẩn lạc với cặp mồi đoạn gen (L) Thang DNA, (1-5-A) (1-3-B) Mẫu, (6-A) (4-B) Chứng dương pK7CP pK7ORF24+CP Phân đoạn 8116 8116 Phân đoạn 3310 2850 Phân đoạn 1463 1003 8116 2886 1039 Mẫu pK7 * Thiết kế vector RNAi kỹ thuật Gatewway Sau thực phản ứng tái tổ hợp biến nạp vào vi khuẩn, khuẩn lạc phát triển môi trường kháng sinh kiểm tra PCR với cặp mồi đoạn gen Kết thu phân đoạn DNA vị trí 500 bp (ORF2-4+CP) 450 bp (CP), phù hợp với kích thước tính toán (Hình 3.14) Điều cho thấy có gen mục tiêu diện dòng vi khuẩn chọn lọc Pasmid tái tổ hợp kiểm tra cách cắt với enzyme XbaI HindIII Nếu gen chèn vào vector, phản ứng cắt cho ba phân đoạn DNA (Bảng 3.12) Kết thu phân đoạn DNA 8116 bp, 2850 bp, 1003 bp (pK7GWIWG2(II)/CP) 8116 bp, 2886 bp, 1039 bp (pK7GWIWG2(II)/ORF24+CP), cho thấy gen mục tiêu chèn vào cấu trúc (Hình 3.15) L 10000bp 3000bp 1500bp 1000bp 500bp cm Hình 3.15 Kết kiểm tra sản phẩm cắt vector pK7GWIWG2(II)/CP pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP enzyme XbaI HindIII Hình 3.16 Khuẩn lạc A tumefaciens C58 phát triển môi trường LB + 50 mg/l ampicilin, 100 mg/l spectinomycin 50 mg/l rifamycin * Tạo chủng A tumefaciens mang vector RNAi (L) Thang DNA, (1) Sau biến nạp vector vào vi khuẩn thu khuẩn lạc phát triển pK7GWIWG2(II), (2, 3) môi trường có 50 mg/l ampicilin, 100 mg/l spectinomycin (sàng lọc K7GWIWG2(II)/CP, 18 (4, 5) pK7GWIWG2(II)/ORF24+CP vector) 50 mg/l rifamycin (sàng lọc vi khuẩn) (Hình 3.16) Như vậy, trình biến nạp thành công dòng khuẩn lạc thu mang vector mục tiêu 3.4 TẠO CÂY LAN MANG CẤU TRÚC RNAi 3.4.1 Chuyển cấu trúc RNAi vào PLBs A tumefaciens * Giai đoạn đồng nuôi cấy Sau ngày nuôi cấy, PLBs lây nhiễm không lây nhiễm tăng trưởng bình thường Ở PLBs lây nhiễm, có xuất vòng khuẩn trắng bao quanh (Hình 3.17) Điều cho thấy vi khuẩn xâm nhiễm vào PLBs Sự phát triển đồng thời vi khuẩn PLBs cho thấy quy trình lây nhiễm thiết lập thành công * Giai đoạn khử khuẩn Sau ngày nuôi cấy, hầu hết PLBs sống không vòng khuẩn bao quanh Đến ngày thứ 14, bên cạnh PLBs tiếp tục phát triển thành cụm PLBs, bắt đầu xuất PLBs chết Các cụm PLBs sống trì môi trường khử khuẩn đến ngày thứ 21 để loại bỏ toàn vi khuẩn (Hình 3.18) Kết thu cho thấy cefotaxime 300 mg/l vừa có khả loại khuẩn vừa trì khả sống PLBs 3.4.2 Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển Sau 60 ngày nuôi cấy, hầu hết cụm PLBs không chuyển gen chết Một số cụm PLBs chuyển gen sống bên cạnh cụm PLBs chết (Hình 3.19) Các cụm PLBs sống xem mẫu giả định chuyển gen tạm thời, sử dụng cho kiểm tra gen mục tiêu cm Hình 3.17 PLBs tăng trưởng môi trường MS + 0,3 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA 100 M AS sau ngày lây nhiễm A tumefaciens (A) Đối chứng, (B) Lây nhiễm vi khuẩn cm Hình 3.18 PLBs tăng trưởng môi trường khử khuẩn sau ngày (A) 14 ngày (B) nuôi cấy cm Hình 3.19 PLBs nuôi cấy môi trường sàng lọc chứa 500 mg/l kanamycin sau 60 ngày (A) Không chuyển gen, (B) Chuyển gen 19 Kết chuyển gen cho thấy có 1233 cụm PLBs (705 RNAi-CP 528 RNAi-ORF2-4+CP) sống qua giai đoạn sàng lọc tổng số 8814 PLBs (4889 RNAi-CP 3925 RNAi-ORF2-4+CP) xử lý chuyển gen, chiếm tỷ lệ 13,99% (Bảng 3.13) Bảng 3.13 Tỷ lệ PLBs giả định chuyển gen sau giai đoạn sàng lọc kanamycin Tổng số P Bs xử lý ố P Bs thu ần Tỷ lệ %) chuyển gen sau sàng lọc chuyển gen CP Tổng 301 959 2529 1100 4889 ORF24+CP 300 922 1762 941 3925 Tổng CP 601 1881 4291 2041 8814 52 112 455 86 705 ORF24+CP 41 77 293 117 528 Tổng CP 93 189 748 203 1233 17,28 11,68 17,99 7,82 14,42 ORF24+CP 13,67 8,35 16,63 12,43 13,45 Tổng 15,47 10,05 17,43 9,95 13,99 3.4.3 Kiểm tra diện gen chuyển PLBs Kết thu phân đoạn DNA vị trí 400-500 bp (CP) 500 bp (ORF2-4+CP), phù hợp với dự kiến Các cụm PLBs tương ứng với phân đoạn DNA chắn có mang gen mục tiêu (Hình 20, 3.21) L 10 11 12 L 500bp 500bp 400bp 400bp Hình 3.20 Kết kiểm tra gen CP cụm PLBs giả định chuyển gen (1-6) Chuyển gen, (7) Không chuyển gen, (8) Chứng âm, (9) Chứng dương, (L) Thang DNA Hình 3.21 Kết kiểm tra gen ORF2-4+CP cụm PLBs giả định chuyển gen (1-9) Chuyển gen, (10) Không chuyển gen, (11) Chứng âm, (12) Chứng dương, (L) Thang DNA Kết kiểm tra tổng số 38 cụm PLBs (17 PLBs-RNAi-CP 21 PLBsRNAi-ORF2-4+CP) chọn ngẫu nhiên cho thấy có 20 PLBs mang gen mục tiêu (8 PLBs-RNAi-CP 12 PLBs-RNAi-ORF2-4+CP), chiếm tỷ lệ 52,63% (Bảng 3.14) Kết cho thấy cấu trúc gen mục tiêu chuyển vào PLBs Hiệu chuyển gen ước đạt khoảng 7,36% (= 52,63*13,99/100) 3.4.4 Thu nhận lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển Sự tăng trưởng chồi từ PLBs chuyển gen xảy chậm, bắt đầu sau khoảng tháng nuôi cấy, PLBs phát triển kín bề mặt bình nuôi (Hình 3.22) Sự tăng trưởng chậm PLBs sau chuyển gen ghi nhận Chang cộng (2005) nghiên cứu chuyển gen CP vào lan Dendrobium 20 Bảng 3.14 Kết kiểm tra diện gen mục tiêu PLBs chuyển gen Tổng số P Bs ố P Bs Tỷ lệ Gen kiểm tra c gen (%) CP 17 47,06 ORF2-4+CP 21 12 57,14 Tổng 38 20 52,63 A B Hình 3.22 Sự tăng trưởng PLBs chuyển gen môi trường ½ MS (A) Tăng sinh PLBs, (B) Tạo chồi Sau tháng, lan chuyển gen tạo thành Có dạng kiểu hình chuyển gen (CP) khác biệt so với bình thường, bao gồm: (1) kiểu hình thuôn dài, xoắn; (2) kiểu hình ngắn, dày; (3) kiểu hình ngắn, mỏng, mép cưa (Hình 3.23) Trong đó, hai dạng kiểu hình ngắn tăng trưởng kém, thường bị hoại tử, chết sau thời gian nuôi cấy (Hình 3.23-C, D) A B C D Bảng 3.15 Tần suất xuất dạng kiểu hình lan Dendrobium Sonia thu từ PLBs chuyển gen 1cm Hình 3.23 Kiểu hình lan Dendrobium Sonia từ PLBs chuyển gen (A) Bình thường, (B) Lá thuôn dài, xoắn, (C) Lá ngắn, dày, (D) Lá ngắn, mỏng Dạng kiểu hình Chỉ tiêu Bình Lá thuôn Lá ngắn Lá ngắn theo dõi thường dài, xoắn dày mỏng Số lần 57 xuất Tần suất 41,60 (%) 2,92 61 15 44,52 10,95 Trong đó, kiểu hình (2) có tần suất xuất cao nhất, kiểu hình: bình thường; (3); (1) (Bảng 3.15) Sự xuất kiểu hình khác thường lan phát triển từ PLBs chuyển gen việc chèn gen mục tiêu vào tạo thay đổi kiểu hình Sự diện gen mục tiêu lan chuyển gen khẳng định PCR với diện sản phẩm khuếch đại vị trí 400bp (CP) 500 bp (ORF2-4+CP) (Hình 3.24, 3.25) 10 11 12 L 10 11 12 L 500 bp 500 bp Hình 3.24 Kết kiểm tra gen CP Hình 3.25 Kết kiểm tra gen ORF2- lan chuyển gen (1-8) Chuyển gen, 4+CP lan chuyển gen (1-8) (9) Không chuyển gen, (10) Đối chứng Chuyển gen (9) Không chuyển gen, PCR (phát gen lục lạp), (11) Chứng (10) Đối chứng PCR, (11) Chứng âm, âm, (12) Chứng dương (L) Thang DNA (12) Chứng dương (L) Thang DNA 21 Kết kiểm tra tổng số 34 chọn ngẫu nhiên cho thấy có 14 mang gen mục tiêu, chiếm tỷ lệ 41,17% (Bảng 3.16) Kết cho thấy trình tạo lan mang cấu trúc RNAi thực thành công Bảng 3.16 Kết kiểm tra diện gen mục tiêu lan phát triển từ PLBs chuyển gen A Cấu trúc Số Số Tỷ lệ gen chuyển kiểm tra có gen (%) RNAi-CP 25 28,00 RNAi9 77,77 ORF2-4+CP Tổng số 34 14 41,17 3.5 KHẢ N NG B C D cm Hình 3.26 Triệu chứng nhiễm virus lan in vitro sau tuần lây nhiễm CyMV (A) Khảm vàng lá, (B, C) Vết hoại tử lá, (D) Hoại tử biến dạng HÁNG CyMV CỦA CÂY LAN CHUYỂN GEN 3.5.1 Về triệu chứng biểu Sau tuần lây nhiễm nhân tạo, đối chứng không chuyển gen bắt đầu có biểu triệu chứng nhiễm virus; giả định chuyển gen chia thành hai nhóm có biểu triệu chứng Các triệu chứng nhiễm virus quan sát bao gồm khảm vàng lá, tạo vết (đốm) hoại tử hoại tử kèm với biến dạng (Hình 3.26) Sau tuần lây nhiễm, triệu chứng phát triển trầm trọng (khảm vàng hoại tử lan rộng gây chết hoàn số cây) có biểu nhiễm virus (Hình 3.27) A B cm 10 11 12 L 300 bp C Hình 3.27 Cây lan in vitro sau tuần lây nhiễm virus nhân tạo (A, B) Giả định chuyển gen (C) Đối chứng không chuyển gen 200 bp Hình 3.28 Kết kiểm tra virus CyMV lan chuyển gen lây nhiễm virus sau tuần (1-6) Chuyển gen, (7-10) Đối chứng (11) Chứng âm, (12) Chứng dương, (L) Thang DNA 3.5.2 Về diện virus lan Kết kiểm tra virus RT-PCR thu phân đoạn DNA vị trí 200-300 bp, phù hợp với kích thước tính toán (257 bp), có triệu chứng Phân đoạn DNA tương tự không xuất với không 22 có triệu chứng (Hình 3.28) Như vậy, lan triệu chứng đồng thời virus Bảng 3.17 Kết đánh giá khả kháng virus lan giả định chuyển gen sau tuần lây nhiễm virus nhân tạo Cấu trúc Tổng số Số Tỷ lệ gen kháng kháng chuyển đánh giá virus %) RNAi-CP 68 20 29,4 RNAi4 75,0 ORF2-4+CP Tổng số 72 23 31,94 cm cm Hình 3.29 Cây lan Dendrobium Sonia chuyển gen (dòng 36176) tăng trưởng điều kiện nhà kính Kết đánh giá khả kháng virus tổng số 72 giả định chuyển gen chọn ngẫu nhiên cho thấy tỷ lệ kháng virus trung bình đạt 31,94% (Bảng 3.17) Đến kết luận cấu trúc gen chuyển vào lan hoạt động tạo khả kháng virus cho dự kiến Trong số dòng kháng virus có từ nghiên cứu, chọn lọc 01 dòng (36-176) có khả phát triển tốt Các cá thể dòng lan chuyển trồng điều kiện nhà kính (Hình 3.29) Những kết cho thấy việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả kháng virus điều khả thi Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng cấu trúc gen chuyển lên phát triển mô lan chuyển gen để nâng cao hiệu chuyển gen KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ Kết luận - Quá chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia thực thành công cho PLBs (được tái sinh từ lát cắt mô thân lan in vitro) lây nhiễm với vi khuẩn A tumefaciens chủng C58 (hay EHA105 LBA4404) nuôi cấy môi trường MS bổ sung 100µM AS, thời gian ngày (với chủng C58 EHA105) hay ngày (với chủng LBA4404), sau loại bỏ vi 23 khuẩn với 300 mg/l cefotaxime sàng lọc PLBs chuyển gen với 500 mg/l kanamycin - Trình tự gen CP virus CyMV phân lập khu vực khác Việt Nam có độ tương đồng từ 95-99% Tỷ lệ tương đồng thay đổi tùy thuộc vào khoảng cách địa lý khu vực phân lập Các trình tự phân lập khu vực địa lý gần có tỷ lệ tương đồng cao so với trình tự phân lập khu vực địa lý xa - Vector chuyển gen RNAi thiết kế từ trình tự gen CP đơn lẻ (RNAi-CP) hay kết hợp với trình tự gen ORF2-4 (RNAi- ORF2-4+CP) virus CyMV kỹ thuật Gateway Cả hai loại vector chuyển thành công vào PLBs lan lan Dendrobium Sonia vi khuẩn A tumefaciens - PLBs mang cấu trúc gen mục tiêu (RNAi-CP/ORF2-4+CP) chọn lọc môi trường có bổ sung kanamycin (500 mg/l) kiểm tra gen mục tiêu phản ứng PCR Cây lan chuyển gen hoàn chỉnh thu nhận từ PLBs chuyển gen sau khoảng tháng nuôi cấy môi trường ½ MS Có dạng kiểu hình khác biệt so với kiểu hình bình thường ghi nhận chuyển gen - Khả kháng virus CyMV lan chuyển gen đánh giá giai đoạn in vitro thông qua lây nhiễm nhân tạo Cây lan chuyển gen thu hai trường hợp chuyển gen (CP ORF2-4 + CP) có khả kháng virus so với đối chứng không chuyển gen Đề nghị - Phân tích đánh giá tính ổn định cấu trúc gen chuyển dòng lan chuyển gen hệ để chọn dòng lan kháng virus CyMV - Sử dụng dòng lan kháng virus làm nguồn vật liệu ban đầu phục vụ cho lai tạo giống hoa lan có khả kháng virus CyMV - Nghiên cứu ảnh hưởng cấu trúc gen RNAi lên phát triển mô lan Dendrobium sonia chuyển gen 24 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ Nguyễn Xuân Dũng, Dương Hoa Xô, Chu Hoàng Hà (2014), “Tối ưu hóa chuyển nạp gen lan Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí sinh học, 36 (1se), tr 257-265 Nguyễn Xuân Dũng, Phạm Văn Hiểu, Dương Hoa Xô (2014), “Tạo dòng biểu gen mã hóa protein vỏ (CP) virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV) gây bệnh hoa lan”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 7(53), tr 124-132 Nguyễn Xuân Dũng, Dương Hoa Xô, Nguyễn Thị Thanh Thảo, Chu Hoàng Hà (2015), “Nghiên cứu chuyển gen RNAi qua trung gian Agrobacterium tumefaciens vào Dendrobium Sonia để tạo giống kháng virus khảm vàng”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 13(2), tr 264-271 25 ... giá hiệu kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan Dendrobium có khả kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV) thực nhằm mục đích đánh giá hiệu việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi. .. nhận chuyển gen - Khả kháng virus CyMV lan chuyển gen đánh giá giai đoạn in vitro thông qua lây nhiễm nhân tạo Cây lan chuyển gen thu hai trường hợp chuyển gen (CP ORF2-4 + CP) có khả kháng virus. .. tự gen CP phân lập từ virus CyMV Việt Nam - Khẳng định tính khả thi kỹ thuật chuyển gen RNAi việc tạo khả kháng virus cho lan Dendrobium - Góp phần hoàn thiện phương pháp đánh giá khả kháng virus