Kỹ thuật DNAPCR kiểm định nguồn gốc thực phẩm

Nguyên tắc của PCRFormation of a DNA chain from individual nucleotides Picture: Andy Vierstraete, 1999 Structure of DNA in a cell Picture: Andy Vierstraete, 1999 Nucleus: Nhân Chromosome

KI Ể M ĐỊ NH NGU Ồ N G Ố C TH Ự C PH Ẩ M

BF5320

KỸ THUẬT DNA – PCR: Kiểm định nguồn gốc

TS NGUY Ễ N TH Ị TH Ả O

K Ỹ THU Ậ T DNA – PCR: Ki ể m đị nh ngu ồ n g ố c

Nguyên tắc của PCR

Nguyên tắc của PCR

Formation of a DNA chain from individual nucleotides (Picture: Andy

Vierstraete, 1999

Structure of DNA in a cell (Picture: Andy Vierstraete, 1999)

Nucleus: Nhân

Chromosomes: Nhiễm sắc thể

Nguyên tắc của PCR

Nguyên tắc của PCR

Bước 1: Biến tính

1 phút, 94 o C Bước 2: Gắn mồi

45 giây, 54 o C Bước 3: Kéo dài phân tử

2 phút, 72 o C

http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR

Nguyên tắc của PCR

Các chu kỳ của kỹ thuật PCR

QUI TRÌNH PHÂN TÍCH PCR

Các vi sinh vật,

động vật

Thu nhận mẫu

K ỹ thu ậ t PCR l ầ n đầ u tiên đượ c Mullis và c ộ ng s ự mô t ả vào

n ă m 1986 và c ũ ng do chính phát minh này Mullis đ ã đượ c trao gi ả i nobel vào n ă m 1993

CÁC THÀNH PH Ầ N C Ủ A PCR

• DNA khuôn

• Polymerase

• Nucleotide tự do

• Dung dịch đệm

• Mồi

Bioinformatics 10

DNA khuôn

• Là các trình t ự DNA dùng để t ổ ng h ợ p trình t ự m ụ c tiêu

• DNA khuôn có th ể là toàn b ộ genome ho ặ c đượ c gi ớ i

h ạ n b ở i các enzyme c ắ t gi ớ i h ạ n

• C ả hai m ạ ch đề u đượ c s ử d ụ ng trong ph ả n ứ ng PCR

Các lo ạ i polymerase dùng trong PCR

• Tag Polymerase

• Pfu Polymerase

• Polymerase thế hệ mới

Tag polymerase

• Nhiệt độ tối ưu: 75 – 80oC

• Có thể tồn tại 2 giờ ở 92.5oC, 40’ ở 95oC, 7’ ở 97.5oC

• Tốc độ: 1,000bp/10s

• Sai sót: 1/9,000

Pfu polymerase

• Chịu nhiệt tốt hơn Tag polymerase

• Có thể tồn tại 6-7h ở 97.5oC

• Tốc độ: 1,000bp/1-2’

• Sai sót: 1/1,300,000

• Có hoạt tính sửa sai

Polymerase thế hệ mới

• Chịu nhiệt tốt

• Tốc độ cao

• Sai sót ít

• Có thể tái sử dụng nhiều lần

Nucleotide tự do

• Nucleotide tự do là nguồn nguyên liệu để tổng hợp mạch mới

• Trong một số trường hợp, người ta bổ sung một số nucleotide

“lạ”

Dung d ị ch đệ m

• Ả nh h ưở ng đế n hi ệ u su ấ t, tính chính xác c ủ a ph ả n

ứ ng PCR

• Ứ ng v ớ i t ừ ng lo ạ i polymerase, nhà s ả n xu ấ t khuy ế n

cáo s ử d ụ ng dung d ị ch đệ m t ươ ng ứ ng

• N ồ ng độ Mg2+là y ế u t ố quan tr ọ ng:

– Thi ế u: ho ạ t độ ng c ủ a polymerase kém d ẫ n đế n

hi ệ u su ấ t PCR kém

– Th ừ a: thu nh ậ n m ộ t s ố s ả n ph ẩ m không đặ c hi ệ u,

tính chính xác th ấ p

M ồ i-primer

• Mồi trong phản ứng sao chép DNA là những trình tự RNA

ngắn được tổng hợp bởi enzyme Primase

• Mồi trong sinh học phân tử là những đoạn oligonucleotide

ngắn được tổng hợp hóa học

• Ứng dụng: phản ứng PCR, lai phân tử,…

Thiết kế trình tự mồi Bioinformatics

• Tính duy nhất: đảm bảo vị trí bắt cặp là DUY NHẤT trên toàn

trình tự

• Chiều dài mồi: tối thiểu 15 base, thông thường khoảng 17-28

base

• Thành phần base: thường là tổng (G+C) khoảng 50-60%, tránh

trình tự mồi với (A+T) dài

• Kẹp G/C: tính ổn định ở đầu 3’ ảnh hưởng lớn tới hiệu quả

phản ứng, thường 3’ của mồi là G hay C

Đặ c đ i ể m c ủ a m ồ i (ti ế p theo)

• Độ ổn định đầu 3’: năng lượng cần để phá hủy sự bắt cặp của

5nu cuối cùng ở đầu 3’, tuy nhiên để tránh bắt cặp nhầm trên

các vùng giàu GC, 5nu cuối cùng không nên chứa quá 3G/C

• Nhiệt độ nóng chảy (Tm): trong giới hạn 52oC – 65oC, không

nên cách biệt quá lớn giữa 2 mồi

Các tiêu chu ẩ n thi ế t k ế m ồ i

• Tính duy nhất

• Chiều dài: 17-28 base

• Thành phần base: G+C (50-60%), tránh A+T dài

• Tối ưu hóa sự bắt cặp và kéo dài: đầu 3’ của mồi có độ bền cao và

bắt cặp cao

• Nhiệt độ nóng chảy trong giới hạn 48-65˚C

• Sự khác biệt nhiệt độ nóng chảy mồi xuôi và mồi ngược < 5˚C

• Giảm thiểu sự tự tạo thành cấu trúc bậc hai của mồi

Ả nh h ưở ng c ủ a c ấ u trúc b ậ c 2

• C ấ u trúc b ậ c 2 gi ữ a hai m ồ i là s ự b ắ t c ặ p b ổ sung

toàn b ộ hay m ộ t ph ầ n gi ữ a hai m ồ i

• C ấ u trúc b ậ c 2 làm m ồ i m ấ t kh ả n ă ng g ắ n vào DNA

m ụ c tiêu

• Gi ả m s ố l ượ ng m ồ i t ự do trong môi tr ườ ng

• Gi ả m hi ệ u qu ả c ủ a ph ả n ứ ng PCR

Hairpins Là cấu trúc thứ cấp hình thành

trong nội bộ mồi Giá trịΔG của các hairpin

đầu 3’ không nên <-2 kcal/mol và của các

hairpin ở giữa không nên <-3 kcal/mol

Self-Dimer

T ự m ồ i (Self Dimer) Là cấu trúc hình

thành giưã các phân tử của cùng loại mồi

Giá trịΔG của các hairpin đầu 3’ không nên

<-5 kcal/mol và của các hairpin ở giữa

không nên <-6 kcal/mol

Dimer

Là cấu trúc hình thành giữa các phân tử

của 2 mồi khác nhau (cặp mồi trong phản

ứng PCR) Giá trịΔG của các hairpin đầu

3’ không nên <-5 kcal/mol và của các

hairpin ở giữa không nên <-6 kcal/mol

5’ 3’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

Mồi hợp lệ?

Slide 26

Tóm tắt về mồi

Tính đ c hi u

Đặc hiệu cho trình tự

đích (tránh các liên kết

không đặc hiệu)

Tính b n

Hình thành thể lai bền

với đoạn mẫu trong p/ứ

PCR

Tính t ng thích

Các đoạn mồi phải chịu

cùng một điều kiện trong

p/ứ PCR

Tính duy nhất Chiều dài

Nhiệt độ hồi tính

Sự bắt cặp giữa 2 mồi

Cấu trúc mồi

Thành phần base Tính bền

Đặ c tính: Các y ế u t ố c ầ n quan tâm:

Nhiệt độ nóng chảy

KỸ THUẬT DNA-PCR

KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM

Ứ ng d ụ ng PCR trong ki ể m đị nh m ộ t s ố lo ạ i th ự c ph ẩ m

Cases in Indonesia

Tổ Chức Liên Hiệp Hồi Giáo

(Organization of Islamic Countries -OIC)

HALAL LOGO’s

Halal Standard and Guidelines Worlwide

Ứ ng d ụ ng PCR trong ki ể m đị nh m ộ t s ố lo ạ i th ự c ph ẩ m

PCR amplification of chicken mitochondrial D-loop gene with raw,

cooked and autoclaved meat and meat emulsion Lane M: 100 bp

meat; Lane 4: raw meat emulsion; Lane 5: cooked meat emulsion;

Lane 6: autoclaved meat emulsion; Lane 7: negative control

The result of PCR specificity and sensitivity test

for the specifichorse primers M: marker, 1:

100 ng horse, 2: 10 ng horse, 3: 1 ng horse, 4:

porcine, 8: beef, 9: lamb, 10: negative control and

11: positive control

The result of PCR specificity and sensitivity test for the specificdonkey primers M: marker, 1:

100 ng donkey, 2: 10 ng donkey, 3: 1 ng donkey, 4: 0.1 ng donkey, 5: 0.01 ng donkey, 6:

control and 11: positive control

Electrophoretic gel of the sausage samples

prepared from donkey–beef binary mixtures

M: marker, 1: donkey 5% + beef 95%, 2:

99.5%, 4: donkey 0.1% + beef 99.9%, 5: beef

100%, 6: positive control and 7: negative

control

Electrophoretic gel of the sausage samples marker, 1: porcine 5% + beef 95%, 2: porcine 1% + beef 99%, 3: porcine 0.5% + beef 99.5%, positive control and 7: negative control

The specificity of beef-specific primer

pair with DNA by PCR assay for different The efficiency of beef specific PCR assay

The sensitivity assay of beef

specific PCR under different

manufacturing conditions at 1%

level of adulteration in meat and

100 bp Ladder; Lane 1: Fresh

3: Autoclaved meat; Lane 4: Raw

meat emulsion; Lane 5: Cooked

meat emulsion; Lane 6:

Autoclaved meat emulsion; Lane

7: Negative Control.

The sensitivity assay of beef specific products at 5% and 1% level of adulteration Legends: Lane M:

100 bp Ladder; Lane 1 & 4: Meat

& 6: Meat block; Lane 7: Negative

Control (Note: Lane-1, 2 and 3

contains 1% and 4, 5 and 6 contains 5% level of beef in meat products)

Electrophoretic analysis of the12S

rRNAPCR products obtained from

cows’ (lane 1), sheep's (lane 2), and

primers12S-FW and 12S-REV NC =

negative control; M = molecular

weight marker, 1 kb plus DNA ladder

(GibcoBRL)

Electrophoretic analysis of the cow-milk samples using primers12SM-FW

and 12SBT-REV.Samples are: cow (lane 1), sheep (lane 2), and goat (lane 3) NC weight marker, 1 kb plus DNA ladder (GibcoBRL)

Electrophoretic analysis of the 12S rRNA

PCR products obtained from raw milk

primers 12SM-FW and 12SBT-REV.

Samples are cow 100% (lane 1), cow 10%

(lane 2), cow 5% (lane 3), cow 1% (lane 4),

sheep 100% (lane 7) NC = negative

control; M = molecular weight marker,

1 kb plus DNA ladder (GibcoBRL)

Electrophoretic analysis of the 12S rRNA PCR products obtained from heat-treated milk binary mixtures of cow in sheep using primers

12SM-FW and 12SBT-REV A) Pasteurized

samples (65°C; 30 min); B) sterilized samples

(120°C; 20 min) Lines are cow 100% (lane 1), cow 10% (lane 2), cow 5% (lane 3), cow 1%

(lane 4), cow 0.5% (lane 5), cow 0.1% (lane 6), and sheep 100% (lane 7) NC = negative control; M = molecular weight marker, 1 kb plus DNA ladder (GibcoBRL)

Electrophoretic analysis of the 12S rRNA PCR products obtained

from heat-treated milk binary mixtures of cow in goat using primers

12SM-FW and 12SBT-REV A) Pasteurized samples (65°C; 30 min); B)

sterilized samples (120°C; 20 min) Lines are cow 100% (lane 1),

5), cow 0.1% (lane 6), and goat 100% (lane 7) NC = negative

(GibcoBRL)