8/22/2014 1 KIỂM ĐỊNH NGUỒN GỐC THỰC PHẨM BF5320 KỸ THUẬT ENZYME Th.S HOÀNG QUỐC TUẤN TS. NGUYỄN THỊ THẢO KỸ THUẬT MIỄN DỊCH ENZYME (ENZYME IMMUNOASSAY) ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Direct ELISA (ELISA trực tiếp) ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Sandwich ELISA ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) http://www.vbs.ac.vn/print.php?post=211 peptides, protein, antibodies, hormone,… EIA (Enzyme ImmunoAssay) • Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước: • Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể • Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H 2 O 2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm. 8/22/2014 2 nitrophenol phosphate Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau. Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể được gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên. 8/22/2014 3 Ưu điểm: Đơn giản nhất Nhược điểm: • Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope. • Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng 8/22/2014 4 • Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa. • Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được Direct ELISA (ELISA trực tiếp) ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) 8/22/2014 5 Sandwich ELISA ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA • Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng • Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên • Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên 8/22/2014 6 Ứng dụng phương pháp enzyme immunoassay 8/22/2014 7 Ứng dụng phương pháp enzyme immunoassay Kháng nguyên Giới hạn phát hiện Huyết thanh, albumin (Lợn) 1-10% Dịch chiết cơ xương (Lợn, Gà) 250 ppm (Thịt lợn) 126 ppm (Gia cầm) Desmin (Gà) 10% Huyết thanh (Bò) <10% Protein cơ đã gia nhiệt (Lợn) 0.5% Huyết thanh albumin (Bò, Ngựa, Lợn) 3% Albumin (Bò, Ngựa, Lợn, Gà) 0.6% Dịch chiết Sarcoplasmatic (Lợn) 1% Protein cơ hòa tan (Gà) 1% Glycoprotein (Lợn) 0.06% Protein cơ (Lợn) 1% IgG (Lợn, Gà, Bò) <1% Huyết thanh Protein (Trâu, Dê, Lừa) 0.1-1% Tht và sn phm t tht Sa và sn phm t sa Kháng nguyên Giới hạn phát hiện β-Lactoglobulin 0.5% sữa bò κ-Casein 0.25% sữa bò IgG Bò 0.0008% sữa bò tươi Whey Protein Bò 1% sữa bò Whey Protein Dê 0.5% sữa bò α-S2-casein 0.5% sữa dê β-lactoglobulin Bò 0.0001% sữa bò γ3-Casein 0.2% sữa bò IgG Dê 1% sữa bò 8/22/2014 8 8/22/2014 9 KỸ THUẬT ENZYME Các chất có thể phân tích bằng phương pháp enzyme Đường Axit/Muối Alcohol Chất khác D-fructose Acetate Cholesterol Acetaldehyde D-galactose L-ascorbate Ethanol Ammonia D-glucose Citrate Glycerol Urea Lactose Formate D-sorbitol Maltose D-gluconate Xylitol Tinh bột L-glutamate Sucrose D-3-hydroxybutyrate D-isocitrate D-và L-lactate Ammonia