Nghiên cứu hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza, trong đất và rễ cam tại quỳ hợp, nghệ an

Chính vì vậy, hình thức cộng sinh này đã và đang được nghiên cứu về phân loại, sinh học phân tử, ảnh hưởng của chúng đối với thực vật.... Vì vậy, việc nghiên cứu áp dụng kỹ thuật phát tr

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-* -

LÊ THỊ THỦY

NGHIÊN CỨU HỆ NẤM

CỘNG SINH ARBUSCULAR MYCORRHIZA,

TRONG ĐẤT VÀ RỄ CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2

MỞ ĐẦU

Sự cộng sinh giữa nấm và rễ cây trồng được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1885 do A.B.Fank – nhà bệnh cây lâm nghiệp người Đức Nhưng phải đến năm 80 của thế kỷ 20 mới được tập trung nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất

Nấm rễ cộng sinh là hiện tượng rất phổ biến trong tự nhiên, có khoảng

60 – 80% các loài thực vật trên thế giới có mối quan hệ cộng sinh với nấm nội cộng sinh Đây là mối quan hệ cộng sinh không thể tách rời: Nấm không có rễ thì không thể tồn tại, cây không có nấm cây sinh trưởng yếu vàng và chết [11] Đã có nhiều công trình khoa học chứng minh vai trò của nấm cộng sinh mang lại những lợi ích to lớn, thiết thực đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trong điều kiện bất lợi của môi trường, bởi vậy chỉ trong điều kiện đất đai khô hạn, nghèo dinh dưỡng thì nấm rễ mới phát huy tốt vai trò cộng sinh của mình Chính vì vậy, hình thức cộng sinh này đã và đang được nghiên cứu (về phân loại, sinh học phân tử, ảnh hưởng của chúng đối với thực vật ) và ứng dụng vào thực tiển sản xuất nông – lâm nghiệp ở nhiều nước trên thế giới

Ở Việt Nam, diện tích đất trồng trên cạn là rất lớn (3 317 270 ha), chủ yếu là các loại cây trồng có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, trong phát triển sản xuất thường gặp khó khăn về vấn đề nước tưới, đất chua và dinh dưỡng Vì

vậy, việc nghiên cứu áp dụng kỹ thuật phát triển nấm cộng sinh Mycorrhiza

cho một số cây trồng chính tại các vùng sinh thái phục vụ sản xuất Nông – Lâm nghiệp bền vững ở nước ta nhằm nâng cao năng suất cây trồng, duy trì

và bảo vệ và nâng cao độ phì nhiêu của đất là vấn đề cấp bách cần được quan tâm hiện nay Cho đến nay, một số nhà khoa học của Viện Lâm nghiệp, Viện Công nghệ sinh học, Viện Thổ nhưỡng nông hóa… cũng đã công bố những nghiên cứu cơ bản về nấm rễ cộng sinh Kết quả của những nghiên cứu này

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3

mới chỉ dừng lại ở mức phân lập, lưu giữ bào tử nấm cộng sinh và nghiên cứu xử lý đất ô nhiễm chì có sử dụng nấm Mycorrhiza Tuy nhiên vẫn chưa có

nghiên cứu về khả năng cộng sinh của nấm cộng sinh trên cây cam nhằm tạo

ra chế phẩm làm tăng năng suất và chất lượng

Trong các loại cây ăn quả, Cam Vinh là một loại cây ăn quả đặc sản truyền thống có giá trị dinh dưỡng cao, đồng thời cũng rất có giá trị về kinh

tế Tuy nhiên, diện tích trồng cam ở đây đang dần bị thu hẹp và chất lượng của cam đang ngày càng bị mai một Với mong muốn có thể góp phần nào đó vào việc cải thiện năng suất, chất lượng cam, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU HỆ NẤM CỘNG SINH ARBUSCULAR MYCORRHIZA, TRONG ĐẤT VÀ RỄ CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN‟‟ Với mục tiêu

và nội dung nghiên cứu sau:

Mục tiêu nghiên cứu :

Nghiên cứu hệ nấm nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) trên

đất trồng cam ở Xã Minh Tân - Phủ Qùy – Nghệ An Trên cơ sở đó, góp phần

đề xuất các giải pháp về phân bón, canh tác nhằm làm tăng năng suất, chất lượng chè, ổn định độ phì nhiêu, cải thiện môi trường đất vùng trồng cam

Nội dung nghiên cứu:

Xác định thành phần loài AMF tại vùng nghiên cứu

 Xác định đặc điểm phân bố AMF trong đất trồng cam tại Phủ Qùy – Nghệ An

 Xác định loài AMF trong đất trồng cam bằng kỹ thuật sinh học phân

tử

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

4

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ HÌNH THÀNH TÊN GỌI ARBUSCULAR MYCORRHIZA

FUNGI (AMF)

Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên được Frank – nhà bệnh cây lâm

nghiệp người Đức – đưa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ

cây và nấm ngoại cộng sinh [53] Sự cộng sinh của Mycorrhiza với rễ được

mô tả như (hình 1.1) Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm)

và Rhiza (rễ) Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nấm nội cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và Orchid, từng được gọi là “Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với dạng cộng sinh của nấm bậc cao với các loài trong họ Ericaceae và Orchidaceae Tuy nhiên, tên gọi này tồn tại không lâu vì không có ý nghĩa

[33] Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi của hình thức cộng sinh này Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng

bọng bên trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là

“Vesicules” (gọi là thể V) Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi

(chùm) trong tế bào thường được quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A)

Do vậy, tên gọi “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) được

hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây [19] Bên cạnh đó, một số bài

báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi “Vesicular –A rbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [23] Những

nghiên cứu sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các chi nhưng không phải tất cả nấm nội cộng sinh đều hình thành thể V Do vậy, loại hình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

5

cộng sinh này có thể đƣợc đổi tên là “Arbuscular Mycorrhiza” Nói chung,

tên gọi của nó vẫn chƣa hoàn toàn thống nhất

Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 đƣợc tổ chức tại Lisboa – Bồ Đào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi”

(AMF) để chỉ loại hình cộng sinh này Do vậy, trong các tài liệu mới đƣợc

công bố, thuật ngữ “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt là AMF) đã đƣợc thống nhất sử dụng thay cho thuật ngữ “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza”

vào năm 2008 [28]

Hình 1.1 Sƣ̣ cộng sinh của AMF trong rễ cây trồng

1.2 PHÂN LOẠI MYCORRHIZA

Đặc điểm nhận dạng của một số loài bào tử AMF (dựa theo phân loại của Gerdemann, 1963) [32] bảng 1.1

5

Bảng 1.1 Đặc điểm nhận dạng của một số loại bào tử AMF

Kích thước (µm)

Đặc điểm

Glomus

Aggregatum Hình cầu, hình trứng, có cuống nhỏ Có mầu nâu, mầu nâu đỏ, một số có

mầu vàng nhạt 120-175 Thành bào tử mỏng, có 2 lớp

Ambisporum Hình cầu hoặc hình trứng Mầu nâu, nâu đậm 100-150 Thành bào tử mỏng

Marcaropus Hình cầu hoặc hình trứng Nâu hoặc mầu vàng nhạt 100-125 Thành bào tử mỏng, có quả bào tử

Acaulospora

Appendicul

Delicate có quả bào tử, hình cầu Có mầu nâu, nâu đậm 100-175 Thành bào tử dày

Dilatata Hình cầu, có quả bào tử Có mầu nâu, đen 125-200 Thành bào tử dày,có nhiều lớp

Myriocarpa, Có quả bào tử, hình cầu hoặc gần

hình cầu Có mầu nâu hoặc nâu nhạt 120-175 Thành bào tử dày, có vách ngăn

Bireticulata Hình cầu, dạng quả lê Có mầu nâu nhạt hoặc vàng nhạt 150-200 Thành bào tử dày, có 3-4 lớp

Coccogena Bào tử có dạng hình cầu, gần hình

cầu, elip Có mầu nâu nhạt 100-150 Thành bào tử mỏng có 2 lớp

Coremioides Bào tử có hình cầu, Có mầu nâu, nâu đậm 120-180 Thành bào tử có 3 lớp,chia làm 2

Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2

nhóm

Albida Bào tử có dạng hình cầu, hoặc elip Có mầu vàng nhạt 120-150 Thành bào tử có cấu trúc nối tiếp,

gồm 3 – 5 lớp

6

Căn cứ về mặt hình thái có thể chia nấm rễ thành 3 loại chủ yếu: Nấm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh

* Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza): Đây là một loại nấm

hình thành mạng lưới Hartig trong gian bào tầng vỏ rễ và mô sợi nấm dày đặc trên bề mặt rễ của cây, không có mũ rễ, không có lông hút Nấm r ễ ngoại cộng sinh thường có màu sắc và hình dạng nhất định (có thể nhận thấy bằng mắt thường)

* Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza): Đặc trưng là không có sự

biến đổi màu sắc và hình thái của rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và không có mạng lưới Hartig Nấm rễ nội cộng sinh gồm 2 loại là: nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM) và sợi nấm nội cộng sinh có màng ngăn (SEM) Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ

có các túi bọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular)

* Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh (Ectendomycorrhiza): Mang đặc trưng

của 2 loại nội cộng sinh và ngoại cộng sinh về hình thái cũng như sinh lý Hiện nay, người ta nhận thấy có 7 hình thức cộng sinh:

* Arbuscular Mycorrhiza Fungi (AMF): Cộng sinh kiểu tạo bụi (chùm)

* Ectomycorrhizas (ECM): Nấm rễ ngoại cộng sinh

* Orchid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây họ Lan (Orchidaceae)

* Ericoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây thuộc bộ Đỗ

Quyên (Ericales)

* Ectendo Mycorrhizas: Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh

* Arbutoid Mycorrhizas: Nấm rễ có cả nội cộng sinh và ngoại cộng sinh nhưng chỉ xuất hiện giới hạn trong các chi Arbutus, Arctostaphylos và Arctous của họ Đỗ Quyên (Ericaceae)

* Monotropoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh xuất hiện trong họ

Monotropaceae của bộ Đỗ Quyên (Ericales)

Theo thống kê của Harley (1959), khoảng 3% số cây có hoa ở các loài cây gỗ

và cây bụi có ECM, 90% các loài cây thân cỏ có AMF, ngoài ra một số loài cây gỗ có cả ECM và AMF [32]

7

Hình 1.2 Biểu đồ cây phát sinh chủng loại AMF

(http://www.ffp.csiro.au/research/mycorrhiza [62])

8

1.3 PHÂN LOẠI BÀO TỬ AMF

Thông thường, việc phân loại nấm nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái và cấu trúc (Bảng 1.1) Một trong những cơ sở quan trọng

để phân loại theo hình thái là bảng màu của Morton Phương pháp ADN và giải phẫu sẽ được dùng để đánh giá quan hệ ở mức cao hơn do Smith và Tinker đề xuất 1997 [51]

Nhìn chung, hệ thống phân loại AMF đang áp dụng dựa trên cơ sở hệ thống phân loại của Morton và Benny đưa ra vào năm 1990 và được hoàn chỉnh dần nhờ hàng loạt các nhà nghiên cứu tiếp đó [39]

Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trước hết phải kể đến việc

hình thành chi Endogone năm 1808 Tiếp đó là chi Glomus do anh em

Tulasne mô tả năm 1844 Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ

Endogonaceae, sau đó họ này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc

điểm chung Đây là thời điểm để hoàn thiện sự phân loại và phương pháp nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF

Năm 1959, Moss (nhà Giải phẫu thực vật) và Bowen (nhà Sinh thái học)

đã đưa ra hệ thống mô tả dựa trên cấu trúc vách tế bào, màu sắc và đặc điểm

tế bào chất [40] Tuy nhiên, khi áp dụng phương pháp này thì Gerdermann đã

phát hiện ra rằng Endogone có số lượng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh: Endogone, Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora (trong đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới) [31]

Với hệ thống phân loại của Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học –

Viện Hàn lâm khoa học Ấn Độ đã phân lập từ đất vườn ươm 4 chi AMF: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và 1 chi không cộng sinh (Endogone)

9

Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đưa 5 loài AMF ra khỏi chi

Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [58], đến năm 1987 Walker

cũng đề xuất như trên [60] Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của

Walker vào 3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này được đặt trong bộ mới Glomales [39]

Năm 1998,Trung tâm Nghiên cứu AMF của Đài Loan (Arbuscular mycorrhizal fungal Collection center in Taiwan – ACT) đề nghị công nhận 2 chi mới là Glomites và Jimtrappea Hiện nay, hệ thống phân loại của ACT

thường được sử dụng ở các nước châu Á

Năm 2008, Shipra Singh và đtg tiếp tục công bố thêm 2 họ AMF là:

Archacosporaceae và Paraglomaceae với 2 chi mới là: Archacospora và Paraglomus [49]

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MYCORRHIZA

và tiếp sau đó tác giả Tommerup (1992) đã cải tiến thành phương pháp sàng

ướt (wet sieving) qua rây kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose

(dịch 50%) [25, 56]

Quan sát, đếm số lượng bào tử

Tùy vào kích cỡ, quá trình quan sát bào tử có thể được thực hiện trên kính lúp hoặc kính hiển vi có độ phóng đại nhỏ Số lượng bào tử được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp trên màng lọc có chia ô của hãng Satorrius [24]

C trong vòng 2h, sau đó rửa bằng axít và biến màu bởi Tryphan blue, kết quả là sợi nấm sẽ bắt màu xanh [43] Đối với thực vật có nhiều sắc tố trong rễ, Kormanik và cộng sự đề xuất phương pháp sử dụng fuschin làm mất màu những mẫu rễ cây cần quan sát [35] Năm 1996 tác giả Brundrett đã đưa ra một phương pháp mới với thuốc nhuộm là Chlorazol black E, nhờ đó có thể quan sát một cách rõ ràng những giai đoạn của AMF trong rễ cây chủ [24] Tuy nhiên, tất cả các phương pháp trên đều có chung một nhược điểm là tốn thời gian và gây phá hủy mẫu Mặt khác, quá trình và mức độ biến đổi

màu là khác nhau với từng mẫu rễ Đa số các loài thuộc chi Gigaspora và Scutellospora biến đổi màu rất mạnh với Tryphan blue mà không phụ thuộc

vào loài cây chủ theo Morton (1988) [38] Nhưng có loài chỉ biến màu trung

gian với Tryphan blue như Acaulospora trapei [18] Thậm chí, một số loài của chi Glomus (G.leptoticum, G.maculosum…) hoặc loài Acaulospora myriocarpa lại không biến màu với Tryphan blue [38]

Mức độ chặt chẽ của mối quan hệ giữa thực vật và AMF được thể hiện thông qua số lượng bào tử có trong đất Tuy nhiên, việc xác định số lượng bào

tử đôi khi gặp nhiều khó khăn Để giải quyết vấn đề đó, người ta thường dùng một chỉ số trung gian là “hệ số xâm nhiễm” Phương pháp đơn giản là cắt hệ

thống rễ thành những mẩu nhỏ và xác định tỷ lệ Mycorrhiza Tuy nhiên, phương pháp này không hiệu quả khi tỷ lệ Mycorrhiza lớn Năm 1975, dựa

trên cơ sở phương pháp đường chéo của nhóm tác giả Newman, Sparling và Tinker lần đầu tiên áp dụng với AMF, sau đó được dùng để so sánh với các phương pháp xác định khác Hiện nay, phương pháp này rất thông dụng [52]

tố quan trọng nhất tạo ra sự lây nhiễm tự nhiên của AMF [36] Ngược lại, với những nơi ẩm ướt, động vật lại là nhân tố đóng vai trò chủ yếu [29]

Năm 1983, Hayman cho rằng số lượng bào tử AMF trong đất là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ ưu thế của loài Trong đất canh tác, số lượng loài và số lượng bào tử nhiều hơn trong đất tự nhiên [34] Mặt khác theo tác giả Friese thì AMF không dễ phát tán nên tầng đất canh tác là vị trí tốt nhất để xác định số lượng bào tử [29]

Đồng thời với những nghiên cứu về phân loại, tách bào tử, cấu trúc AMF thì ảnh hưởng của AMF đối với sự sinh trưởng của cây cũng được quan tâm từ rất sớm

Năm 1963, tác giả Gerdemann đã sử dụng đất không khử trùng như một cách lây nhiễm AMF và đã chứng minh được rằng cây trồng sẽ phát triển nhanh khi có mặt AMF [32] Năm 1959, trong một báo cáo khoa học khác đã chỉ ra rằng, việc nhiễm AMF làm tăng sinh trưởng của cây táo con từ chồi [40] Cho đến năm 1968, Gerdemann tiến hành thí nghiệm trên cây ngô và yến mạch cũng cho kết quả tương tự [30]

Như vậy, trong nhiều năm qua, những nghiên cứu về AMF chỉ tập trung vào vấn đề ảnh hưởng của chúng đối với sinh trưởng cây trồng mà không biết rằng giá trị AMF mang lại cho thực vật chủ còn lớn hơn nhiều Năm 1968, bào tử nấm nội cộng sinh có thể sống cùng với thực vật trong chậu và đưa ra phương pháp nhân nuôi thì những nghiên cứu về AMF và ảnh hưởng của chúng đối với thực vật mới được tiến hành sâu rộng trên nhiều lĩnh

12

vực nông lâm nghiệp [30, 41] Các nhà khoa học đã chứng minh rằng: AMF không chỉ làm tăng khả năng sinh trưởng, phát triển của cây trồng mà còn có thể làm tăng khả năng hấp thu khoáng (như phốtpho, đồng, kẽm…) trong đất; làm giảm mức độ “sốc” của cây khi đất bị nhiễm mặn, đất quá ẩm, nhiệt độ đất cao và nhiều nguyên nhân khác

Về khả năng bảo vệ cây chủ chống lại các tác nhân gây bệnh của AMF, Schonbeck và Dehne (1989) đã nghiên cứu trên 11 loại cây trồng phổ biến là đậu, lúa mạch, lúa mì, cà rốt, ngô, hành, thuốc lá, cà chua, dưa chuột, rau diếp, hồ tiêu đã nhận thấy, chúng làm giảm 40% các bệnh ở rễ thường gặp trên các loại cây chủ này [48] Năm 2000, tác giả Ted cũng chỉ ra kết quả tương tự khi nghiên cứu khả năng chống bệnh ở các cây nhiệt đới có AMF (giảm 30 – 45% các tác nhân gây bệnh) [54]

Năm 2002, bằng thực nghiệm, Bali và đtg, đã chứng minh hiệu quả của

AMF đối với bệnh héo cây bông do nấm Fusarium gây ra Đối với bệnh ở rễ

gây ra bởi tuyến trùng, AMF có thể cải thiện sức sống của cây chủ, từ đó hạn chế những thiệt hại về sản lượng, đặc biệt với những vùng đất có hàm lượng

P2O5 thấp và cây được nhiễm AMF trước khi bị nhiễm tuyến trùng Như vậy, AMF có thể làm giảm nguồn bệnh hoặc giảm ảnh hưởng của bệnh ở rễ có nguyên nhân do nấm và tuyến trùng gây ra Tuy nhiên, tác dụng của AMF không thể hiện rõ đối với bệnh ở lá và bệnh do virus [20]

Khi nghiên cứu số lượng AMF trong đất, Schuybert và đtg đã nhận thấy rằng: Ở các loại đất khác nhau, số lượng bào tử AMF là khác nhau [50] Năm 1989 tác giả Schonbeck đã phân lập được 15 loài thuộc 3 chi khác

nhau là: Glomus, Sclerocystis, Acaulospora trong đất vùng rễ của cây nho và 7 loài thuộc chi Glomus trong đất vùng rễ của cây táo [48] Trong đất trồng trọt

thường xuyên (đất trồng lúa nước, đậu, lúa mỳ và nhiều loại cây trồng khác) luôn có số lượng bào tử AMF cao hơn nhưng thành phần loài của AMF lại thấp hơn so với trong đất tự nhiên Năm 1989 Schonbeck và Dehne nghiên cứu về

13

mối quan hệ giữa AMF với các vi sinh vật vùng rễ, cho thấy sự có mặt AMF đã

làm tăng đáng kể lượng vi khuẩn tổng số (đặc biệt là nhóm Pseudomonas) [48] Khi nhiễm 3 loài Gigaspora margarita, Glomus macrocarpum và Glomus caledonium cho cây dâu tây, đã làm tăng đáng kể sinh khối và hàm lượng phốtpho trong cây, trong đó, Gigaspora margarita có hiệu quả kích

thích mạnh hơn 2 loài còn lại Năm 1982, Dehne cũng phát hiện tác dụng kích thích sinh trưởng của AMF trên cây hành và cây ngô [26] Đến năm 1989, nghiên cứu khác còn phát hiện thêm bên cạnh khả năng tăng sinh khối, tăng tỷ

lệ thân/rễ thì việc nhiễm AMF còn làm tăng hoạt động của enzyme nitrogenase và tăng mức độ đồng hoá phốtpho của các cây họ đậu [59] Ngoài

ra, Sung và đtg còn chứng minh được rằng: Thông qua hoạt động trao đổi chất của mình, AMF có ảnh hưởng đến Pyrophotphat (PPi) trong cây chủ, điều này cho thấy tác dụng rất lớn của AMF đối với toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của cây chủ [48]

Năm 2004, Trần Văn Mão đã nghiên cứu hiệu quả của nấm VA –

Mycorrhiza chủ yếu là nấm Glomus, về khả năng hấp thu dinh dưỡng P Hàm lượng P trong tế bào rễ cây bắp có sự cộng sinh của nấm VA-Mycorrhiza tăng 35% đối với các loài nấm Glomus mosseae và 98% đối với loài nấm Glomus fasciculatum Hàm lượng P được tích luỹ trong rễ bắp ở dạng hỗn hợp phân tử

P hữu cơ và acid hoà tan Hàng ngày P được di chuyển đến các bộ phận của cây bắp theo phương pháp động lực học, và phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh trưởng của cây [7]

Như vậy, các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của AMF đối với sự sinh trưởng và phát triển của các loại cây trồng khác nhau cho thấy chúng đều có tác dụng tăng sinh khối, tăng quá trình trao đổi chất và thu nhận chất dinh dưỡng, tăng hoạt động của các enzyme

Tóm lại vai trò cộng sinh của Mycorrhiza đối với sự sinh trưởng, phát

triển của cây trồng được khái quát như sau [52]:

14

* Khả năng huy động nước và các chất dinh dưỡng: Hệ sợi nấm cộng sinh xung quanh vùng rễ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, tăng khả năng hút nước và các chất dinh dưỡng Đối với các chất dinh dưỡng kém di động (như ion phốtphat, đồng, kẽm…), cây trồng hút các ion này nhanh hơn khả năng khuếch tán của chúng trong dung dịch đất nên thường hình thành vùng hẹp cạn kiệt xung quanh rễ Khi đó, hệ sợi nấm nhanh chóng dài ra, vượt qua vùng cạn kiệt để đến với nơi có đủ phốtpho dễ tiêu Do có đường kính nhỏ hơn so với lông hút của rễ, sợi nấm có thể len lỏi khắp nơi trong đất, kể cả các

lỗ hổng rất nhỏ mà rễ không qua được để hút dinh dưỡng cung cấp cho cây Đối với phốtpho bị cố định chặt, sợi nấm cộng sinh sẽ tiếp cận và tiết ra các axít hữu cơ qua phản ứng của anion hữu cơ phân tử nhỏ (như oxalate…) để sau đó có thể đổi chỗ cho phốtpho (bị hút chặt bề mặt bởi hydroxide kim loại) bằng phản ứng trao đổi, hoà tan oxide kim loại, tạo phức kim loại trong dung dịch, do vậy ngăn chặn được sự kết tủa của phốtphát kim loại Nấm cộng sinh

Mycorrhiza còn giải phóng phốtpho vô cơ thông qua khoáng hoá chất hữu cơ

(thuỷ phân hợp chất ester phốtphát hữu cơ) Các hình thức cộng sinh Ericoid

Mycorrizha và Ectomycorrizha còn có vai trò quan trọng trong việc khoáng

hoá nitơ Chỉ cần một lượng nhỏ AMF có thể huy động dinh dưỡng từ khối lượng lớn xác thực vật có tỷ lệ C/N cao (hàm lượng lignin và tannin cao)

* Dòng chảy cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza: Dòng cacbon có

thể chỉ theo một chiều cưỡng bức từ cây xuống AMF hoặc cũng có thể theo chiều thoả thuận do AMF tự phân giải hợp chất giàu cacbon ở đất Dòng chảy cacbon từ cây xuống đất không làm cây trồng thiếu hụt cacbon vì khi AMF xâm nhiễm vào rễ cây sẽ kích thích quá trình quang hợp mạnh hơn gấp bội (trừ trường hợp ánh sáng quá yếu) Trong hệ sinh thái, dòng chảy cacbon xuống nấm và đất có một số vai trò quan trọng sau:

- Sợi AMF sản sinh ra các enzyme thủy phân (như protease, phosphatase…) có vai trò quan trọng trong quá trình khoáng hoá chất hữu cơ

và huy động chất dinh dưỡng cho cây trồng

độ truyền nước trong cây Năm 1982, Berea và đtg lại cho rằng tác dụng của nấm rễ là cải thiện kết cấu đất và nâng cao lượng nước trong đất từ đó làm tăng khả năng hấp thu nước cho cây [21]

* Giúp cây chống chịu với bệnh hại: nấm cộng sinh ở rễ cây có tác

dụng bảo vệ cây chống lại một số vi sinh vật gây bệnh như Phytophthora infestans (một loài tảo tương tự nấm) Do Phytophthora infestans không thể

xâm nhập qua hệ sợi nấm để lọt vào rễ [10]

- Ngăn chặn cơ học sự xâm nhập của nguồn bệnh bằng cấu trúc sợi nấm đan xen trong rễ cây

- Sản sinh các hợp chất kháng sinh (antibiotic)

- Cạnh tranh dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh, góp phần làm tăng sức

đề kháng cho cây chủ

1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AMF TRÊN THẾ GIỚI BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nấm Mycohriza ở mức độ phân

tử như RFLP, RAPD khuyếch đại trên nhiều vùng khác nhau của nấm được thống kê theo bảng 1.2 Tuy nhiên việc phân loại bào tử bằng sinh học phân

tử vẫn còn nhiều hạn chế do khả năng thu nhận DNA tổng số từ bào còn thấp

Glomales Glomusversiforme

Gl mosseae Gl Caledoniu Acaulosporalaevis Gigasporamargarita Scutellospora gregaria

Rễ và bảo tử của AM,

Scutellospora và Glomus Gigasporaceae

30

ITS1 and

ITS PCR ITS1 và ITS4 G.mosseae và Gigaspora

Dưới nhóm của Glomales

Dưới nhóm của Glomales

Glomus sp

Glomus-specific ITS primer 110

ITS Nested-PCR ITS 5 và ITS4 Glomeromycota (except

Archaeosporaceae) 44

Glom 1 ITS5 và ITS4

SSU-Glom/LSU-Các nhóm chính với

Glomeromycota 44

1.7 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM

Ở Việt Nam, Mycorrhiza được nghiên cứu từ những năm 60 của thế kỷ

XX nhưng đến nay mới đạt được một số kết quả nghiên cứu về nấm ngoại cộng sinh, hầu như chưa có thành tựu trên nấm nội cộng sinh, đặc biệt là với cây cam

Nghiên cứu đầu tiên về nấm cộng sinh trong lâm nghiệp là việc sử dụng lớp đất tầng mặt của rừng thông để gieo ươm cây con - đây có thể được coi như một hình thức nhiễm nấm tự nhiên của Lâm Công Định và đã được sử dụng như một biệp pháp lâm sinh trong một thời gian khá dài [2]

Sau đó là các kết quả nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Giao (1976) về sự có mặt của nấm ngoại cộng sinh ở rễ cây thông Nghiên cứu sử dụng nấm cộng sinh thuần chủng để tạo rễ nấm cho cây thông con, kết quả cho thấy sự vượt trội về chiều cao và đường kính của những cây được nhiễm nấm so với công thức đối chứng là 20 – 30% [1] Bên cạnh đó, Nguyễn Sỹ Giao và Nguyễn Thị Nhâm (1980) còn nghiên cứu sử dụng nấm nội cộng sinh để phòng bệnh vàng còi ở thông con và cũng đã đạt được những kết quả nhất định [3]

Từ năm 1970 – 1980, Viện Nghiên cứu lâm nghiệp (nay là Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) đã tiến hành phân lập và nuôi cấy thuần chủng

18

nấm cộng sinh [3] Một vài thí nghiệm đã được tiến hành trên đất cằn với cây chủ là một số loài thông nhập nội Tuy nhiên, những thí nghiệm này sau đó phải dừng lại vì nhiều lý do Những nghiên cứu ứng dụng nấm cộng sinh trong lĩnh vực lâm nghiệp trong giai đoạn tiếp theo bị ngưng trệ [15,16]

Năm 1998, Phạm Quang Thu và đtg tiếp tục nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, kết quả là xác định được 37 loài nấm (thuộc 9 họ và 7 bộ)

cộng sinh với 3 loài thực vật (thông nhựa Pinus merkussi, thông đuôi ngựa Pinus massoniana và thông caribe Pinus caribaea) Công trình này được coi

như sự khởi đầu lại cho những nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, đặc biệt trên đối tượng cây lâm nghiệp Kết quả không chỉ dừng lại ở việc xác định thành phần loài nấm mà còn đi sâu hơn trong việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm nấm cộng sinh, ứng dụng rộng rãi trong gieo ươm cây con ở keo và bạch đàn Đây là một mốc quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng nấm cộng sinh vì đã chủ động được nguồn nấm lây nhiễm thông qua các chế phẩm sinh học Giá trị của nghiên cứu này còn được thể hiện trong thực tiễn sản xuất tại tỉnh Vĩnh Phúc, sử dụng chế phẩm nấm cộng sinh đã cải thiện đáng

kể tình hình sinh trưởng của cây trồng ở nhiều vùng đất đồi [14] Đối với AMF với cây dược liệu, nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam được cũng chỉ dừng lại ở thu thập mẫu bào tử nấm cộng sinh [5]

Một điều đáng mừng cho khoa học Việt Nam về nấm cộng sinh nói chung và AMF nói riêng tại Hội thảo về nấm cộng sinh đầu tiên của Việt Nam

đã được tổ chức tại Viện Thổ nhưỡng nông hoá vào năm 2004 với sự góp mặt của các nhà nghiên cứu cơ bản thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội và các ngành nông nghiệp, lâm nghiệp, dược học Tuy các tham luận tại Hội thảo này còn mang tính lý luận, ít đề cập đến các kết quả nghiên cứu nhưng nấm nội cộng sinh đã được chú ý như một nội dung chính của Hội thảo, một số nhà khoa học còn đề xuất định hướng nghiên cứu AMF trong những năm tiếp theo

19

Năm 2005, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Sức và đtg [12], khi tiến

hành nghiên cứu “Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) và

quần thể vi sinh vật trong đất trồng bưởi đặc sản Đoan Hùng, Phú Thọ” đã phát hiện sự có mặt của AMF trong tất cả các mẫu thu thập được nhưng tỷ lệ xâm nhiễm thấp chỉ đạt mức 3/5 [33], khả năng nảy mầm của các bào tử nấm

rễ bưởi thấp (chỉ đạt 16%) Trong một nghiên cứu khác, các tác giả đã sử dụng 3 loại cây ký chủ (ngô, cao lương, lúa mạch) và 3 chủng AMF để nhân bào tử rồi đưa ra kết luận: Khi nhân bào tử nhờ cây ký chủ, mỗi loài cây ký chủ thích hợp cho một chủng nấm, riêng cao lương không thích hợp dùng làm cây ký chủ để nhân nhanh bào tử AMF, thời gian thu bào tử tốt nhất là 25 –

40 ngày sau khi cây ký chủ mọc [13]

Các kết quả nghiên cứu gần đây của Nguyễn Thị Minh (2005, 2007) trên cây họ đậu cũng cho một số kết quả khả quan ban đầu [8, 9] Cùng năm

2007, Nguyễn Hoàng Yến công bố công trình nghiên cứu đầu tiên về phân bố của AMF trong cây họ Sao dầu ở Đồng Nai [17]

Tuy có nhiều tài liệu đề cập đến vai trò của nấm cộng sinh AMF nhưng chưa có nghiên cứu về vai trò của nấm cộng sinh đối với cây cam cũng như ảnh hưởng của các biện pháp kỹ thuật canh tác, dinh dưỡng đất đến nấm cộng sinh trên cây cam.Các nghiên cứu sâu rộng về AMF ở mức độ sinh học phân

tử, bằng các phương pháp như RFLP, RAPD chưa được tiến hành hoặc chưa được công bố

Tóm lại, mối quan hệ cộng sinh nấm rễ – thực vật ít được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam, đặc biệt chưa có công trình khoa học

nào nghiên cứu về AMF ở cây cam Bởi vậy đề tài: “Nghiên cứu hệ nấm cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza) trong đất trồng cam ở Quỳ Hợp – Nghệ An”

được thực hiện nhằm góp phần thiết thực vào hướng nghiên cứu mới: Ứng dụng AMF để nâng cao năng suất cây cam nói riêng và cây trồng nông – lâm nghiệp nói chung trên cơ sở bảo vệ môi trường sinh thái theo hướng phát triển bền vững trong thế kỉ XXI

20

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Mẫu

Sử dụng 60 mẫu đất và rễ đƣợc lấy ở các tầng đất khác nhau (0 – 20 cm, 20

– 40 cm, 40 – 60 cm) tại đất trồng cam ở Xã Minh Tân - Quỳ Hợp – Nghệ An

Thời gian lấy mẫu vào thán 8 và tháng 10 năm 2011

Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Hóa chất:

Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR (buffer, dNTP, enzyme taq

polymerase…) do hãng Fermentas PureXtreme (Mỹ) cung cấp và bộ Kit tách chiết DNA, tinh sạch DNA nhập từ hãng QIAGEN (Canada) Ngoài ra, một

số hóa chất khác còn đƣợc chúng tôi sử dụng nhƣ: EtBr, gel agarose, dung dịch đệm TAE 1X…

Thiết bị chủ yếu:

- Bộ rây với các kích cỡ: 10.000 m; 70.000 m; 5.000 m; 2.500 m; 1.000 m; 750 m; 500 m; 250 m; 90 m và 40 m

- Kính hiển vi quang học Olympus BH với hệ thống chụp ảnh chống rung

- Bộ vi gắp và bộ hút chân không áp suất thấp

- Phễu hút kèm giấy lọc Whatman số 1 – 4

21

- Tủ lạnh -200C Vestfrost (Đan Mạch), Máy li tâm BioFuge fresco (Đức), Lò vi sóng Sharp (Nhật Bản), Cân điện tử Precisa (Thụy Sỹ), Máy chu trình nhiệt GenAmp PCR System 9700 (Mỹ), Máy chụp gel BioRad (Đức), Tủ lạnh Toshiba (Nhật Bản), Máy điện di Mupid – 2plus (Nhật Bản), Máy li tâm nhanh Picofuge (Mỹ), Máy giải trình tự ABI 3100 Bio System (Mỹ), Pipette Gilson (Pháp), Bể ổn nhiệt Memmert (Hàn Quốc), Bộ dụng cụ điện di (Đài Loan), Máy đo quang phổ (Đức)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp tách bào tử

- Lấy mẫu, bảo quản mẫu: Theo phương pháp của Hayman 1983, mẫu lấy ở ba tầng phẫu diện khác nhau: Tầng 0 - 20 cm, tầng 20 – 40 cm và tầng

40 – 60 cm Mẫu sau khi lấy được bảo quản ở 4oC cho đến khi phân tích [34]

- Tách bào tử từ đất: Sử dụng kỹ thuật sàng ướt (wet siewing) qua rây

kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) theo Daniel& Skipper (1982) [26], Tommerup (1992) [56]

Bước 1:

+ Cân mẫu đất 50 g

+ Loại bỏ các mảnh rác thô và đá trong mẫu đất

+ Sau đó cho lượng đất đã cân vào trong nước để ít nhất 30 phút trước khi sàng, các khối đất to phải được đập vỡ

Bước 2:

+ Đất được trộn đều trong ca dung tích 1lít nước, sau đó để trong 10 phút cho các mẫu đất lớn lắng xuống rồi gạn dịch sang một loạt sàng có kích thước khác nhau

22

+ Quá trình rửa và gạn lọc được lặp lại nhiều lần cho tới khi nước trong

rễ và các mẫu rác thô được giữ lại trên sàng có kích thước lớn nhất, còn bào

tử được giữ lại trên sàng có kích thước bé nhất

Bước 3:

+ Thu lại các vật chất bám trên sàng có kích thước bé nhất sau đó chuyển qua các ống ly tâm, tiến hành ly tâm lần 1 ở 5000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút + Sau bước này các cặn lơ lửng và rác được loại bỏ

Bước 4:

+ Cho 50 µl dung dịch sucrose 50% vào ống ly tâm rồi lắc mạnh các ống (Hình 2.5)

+ Tiếp tục ly tâm ở tốc độ 11000 vòng/ phút trong 2 phút để tách bào tử

từ thành phần đất Sau khi ly tâm, bào tử nằm trong dung dịch huyền phù sucrose

Bước 5:

+ Hút dịch huyền phù sucrose được cho lên giấy lọc và đặt trên phễu Buchner trước khi lọc hút chân không (dùng giấy lọc Whatman GF/A số 1-4) + Đặt giấy lọc chứa bào tử vào đĩa petri rồi đem quan sát bào tử dưới kính hiển vi điển tử

Bước 6:

Bào tử sau khi được phát hiện dưới kính hiển vi được chụp ảnh Số lượng bào tử được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp trên màng lọc có chia ô của hãng Satorri

- Xác định hình dạng và kích thước của bào tử: Bảng so sánh của Morton [38]

- Xác định các dạng xâm nhiễm AMF: Nhuộm Tryphan blue có cải tiến của Brundrett Mark và cộng sự [25]

- Xác định tên chi và loài: Theo Schenck và cộng sự [47]

24

Hình 2.1 Bảng mầu so sánh để phân loại nấm Mycorrhiza

25

2.2.2 Tách chiết DNA tổng số

Quá trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu rễ được cải tiến theo phương pháp tách DNA tổng số của White và cộng sự (1990) [61]

Phương pháp này bao gồm những bước chính sau:

Bước 1: Rễ được cắt nhỏ cho vào ống effendorf 1,5 ml

Bước 2: Dùng pipette hút 300 µl dung dịch đệm, cho vào ống effendorf có chứa mẫu

Bước 3: Dung dịch được chạy qua 3 chu kỳ nóng lạnh:

 Làm nóng ở 65 °C/ 15 phút

 Làm đông lạnh ở bể đá/ 15 phút (Hai chu kỳ này xen kẽ nhau và được lặp lại 3 lần) Bước 4: Sau đó dùng chày giã nhỏ và đem đi ủ ở nhiệt độ 65 o

C/30 phút

Bước 5: Bổ sung 400 µl Clorofom vào dung dịch sau đó vortex Bước 6: Dung dịch được ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 30 phút Bước 7: Sau khi ly tâm dịch chia làm 2 pha, thu pha trên chuyển sang ống effendorf mới và tủa bằng dung dịch Isopropanol lạnh

Bước 8: Ly tâm lạnh 12000 vòng/phút trong 30 phút

Bước 9: Loại bỏ dich, thu cặn và rửa cặn bằng ethanol 70% lạnh Bước 10: Sau khi rửa sạch, làm khô và bổ sung 20 µl đệm TE, rồi bảo quản ở tủ lạnh -20 o

C

Sau đó, sản phẩm DNA tổng số được tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 0,8%

2.2.3 Điện di DNA trên gel agarose

Điện di là kỹ thuật tách các phân tử dựa trên điện tích, kích thước và hình dạng của chúng trên gel Trong phương pháp điện di trên gel, các phân tử

26

DNA có điện tích âm, được kéo qua một lớp gel bán lỏng nhờ một dòng điện

về phía cực dương trong buồng điện di

Thông thường, gel có chứa một phần đường của thạch tinh khiết gọi là agarose, chất này ngoài việc làm gel đồng nhất hơn so với thạch mà nó còn hoạt động như một rây phân tử, làm tách biệt các đoạn dựa trên kích thước của chúng khi trong điện trường

Các đoạn DNA càng nhỏ sẽ chuyển động càng nhanh và càng xa so với các đoạn lớn Để xác định kích thước của một đoạn DNA, người ta so sánh khoảng cách nó so với khoảng cách mà các đoạn DNA tiêu chuẩn (là một tập hợp nhiều đoạn DNA đã biết rõ kích thước - marker) đi qua

Nồng độ agarose được sử dụng khác nhau tùy thuộc vào thí nghiệm cần nghiên cứu, thường nằm trong vùng từ khoảng 0,8 - 1,5%

Để hiện hình các băng DNA trên bản gel, người ta thường sử dụng thuốc nhuộm ethydium bromide (EtBr) Chất này liên kết với DNA bằng cách xen vào giữa và kề sát với các cặp bazơ (liên kết nhuộm) Khi chiếu ánh sáng (tia UV) vào bản gel, các liên kết nhuộm sẽ hấp thụ và phát huỳnh quang, kết quả có thể nhận biết được bằng mắt thường và chụp ảnh được

Quy trình:

* Chuẩn bị gel agarose: cân 0,8 g agarose cho vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn Để nguội xuống khoảng 50 oC rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn lược Sau khoảng 30 phút, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di Đổ đệm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel 1 – 2 mm

* Tra mẫu DNA: Lấy mẫu khoảng 5 – 10 µl mẫu DNA trộn với 3 µl đệm loading dye (chất này vừa có tác dụng tạo màu để quan sát, vừa có tác dụng giúp cho mẫu DNA lắng xuống đáy giếng trước khi chạy điện di) và tra vào các giếng nhỏ trong gel Sử dụng marker 1kb để làm chỉ thị phân tử

27

* Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào dừng điện di

* Nhuộm bằng EtBr: bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 µl/ml trong thời gian khoảng 10 phút Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel (Bio – Rad)

2.2.4 Kỹ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của Polymerase Chain Reaction, được dịch là phản ứng chuỗi trùng hợp hay “phản ứng khuếch đại gen Máy chu trình nhiệt (máy PCR), các chuỗi DNA mong muốn được nhân lên hàng triệu lần trong thời gian ngắn nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide tương tự hai đầu 3’ ở hai của

đoạn DNA đích với sự tham gia của Taq DNA polymerase

Quá trình PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước (biến tính, gắn mồi, kéo dài) lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) DNA mà

không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men PCR cũng là

một phương pháp thông dụng hiện nay để phát hiện các bệnh di truyền

Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thường chỉ được nhân lên trong quá trình phân bào nguyên nhiễm Để thực hiện được quá trình này, đòi hỏi phải có mặt một enzyme DNA polymerase, cũng như sự tham gia của các đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn với sợi DNA khuôn có đầu 3’OH tự

do và các dNTP làm nguồn cung cấp các nucleotide Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép được mở xoắn và tách thành DNA sợi đơn Dưới tác dụng của DNA polymerase, quá trình tổng hợp DNA được xảy

ra theo cách gắn lần lượt các nucleotide vào đoạn mồi tại vị trí 3’OH để kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn

28

Nguyên tắc của PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp trong ống nghiệm các DNA mới, từ mạch khuôn trong môi trường dư thừa dNTP và các cặp mồi đặc hiệu Các đoạn DNA mới hình thành lại được

sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n

Kỹ thuật PCR yêu cầu các thành phần sau:

+ DNA khuôn mẫu

+ Mồi đặc hiệu chiều dài 15 - 30 nucleotide

+ Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (viết chung là dNTP)

+ Taq DNA polymerase chịu nhiệt

Nhân đoạn gen SSU bằng PCR

2.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sau khi tiến hành điện di các mẫu PCR lượng lớn, phần gel chứa đoạn gen mong muốn được thu lại vào ống effendorf 1,5 ml Quá trình tinh sạch bao gồm những bước sau:

Bước 1: Cân ống effendorf chứa gel đã thu

30

Bước 2: Bổ sung Binding buffer II vào ống, chú ý cứ 100ng gel cần bổ sung thêm 400 µl buffer (Ví dụ: 125ng gel thì cần thêm 500 µl buffer), sau đó đem ủ ống trong bể ổn nhiệt ở 65oC đến khi gel tan hoàn toàn

Bước 3: Cho toàn bộ dịch trong ống effendorf vào cột li tâm lồng trong ống EZ 10 (loại ống chuyên dùng cho li tâm) và để im trong 2 phút ở nhiệt độ phòng Sau 2 phút, đem ống đi li tâm 12000 vòng/phút trong 3 phút Kết thúc

li tâm, loại bỏ hết phần dịch ở đáy ống, thu cột

Bước 4: Chuyển cột sau li tâm trước đó vào ống EZ 10 mới, bổ sung Wash Solution với lượng tối đa 800 µl và đem đi li tâm lạnh 12000 vòng/phút trong 2 phút Cũng giống như bước 3, bỏ phần dịch ở đáy ống, thu cột

Bước 5: Bổ sung 500 µl Binding buffer nếu như mẫu muốn tiến hành đọc trình tự luôn

Bước 6: Bổ sung 700 µl wash buffer tiếp tục li tâm lạnh 12000 vòng/ 1 phút

Bước 7: ly tâm lại một lần nữa để loại bỏ hết dịch

Bước 8: chuyển cột từ bước 7 sang ống 1,5 ml đã khử trùng Bổ sung 50

µl Elution Buffer tiếp tục li tâm lạnh 12000 vòng/ 1 phút

Bước 9: DNA sau khi được tinh sạch cần phải được bảo quản ở -20 o

C, dùng 3 - 5 µl mẫu đi điện di kiểm tra, chạy điện di bằng gel agarose 0,8% trong 30 phút, sau đó nhuộm bằng EtBr trước khi chụp ảnh dưới tia UV trên máy Bio Ra

31

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN LOẠI AMF TRONG CÁC MẪU NGHIÊN CỨU

3.1.1 Hình thái và cấu tạo bào tử AMF trong đất trồng cam ở Quỳ Hợp - Nghệ An

Trong tổng số 60 mẫu được khảo sát tại đất trồng cam ở Quỳ Hợp – Nghệ An năm 2011 có tổng số 16 kiểu hình bào tử AMF thuộc 6 chi được tìm thấy như bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả phân loại bào tử AMF Tên chi Tên chủng Kích

thước µm

Acaulospora

Bào tử hình cầu hoặc gần hình cầu Đa

số bào tử màu trắng, một số ít bào tử màu nâu hoặc nâu nhạt, đôi khi xuất hiện các bào tử màu nâu đỏ (mã màu 20/60/30/10)

Bào tử hình cầu hoặc elip, màu nâu nhạt hoặc nâu vàng (mã màu từ 40/80/70/10) không bắt màu khi nhuộm Melzer

32

Phần lớn bào tử có dạng hình cầu hoặc gần hình cầu, đôi khi có dạng tròn Bào tử có màu đỏ đậm, (mã màu từ 60/80/20/00 đến 40/60/100/00),

Lacunose

120-175

Bào tử có dạng hình cầu hoặc gần hình cầu, đôi khi có dạng elip, màu đỏ vàng (mã màu từ 20/60/60/00 đến

20/60/100/10) Thành bào tử có cấu trúc 5 lớp, chia thành 3 nhóm

Bào tử có dạng hình trứng hoặc hình tròn, bề mặt có vết lõm,màu nâu hoặc

có màu nâu nhạt (40/80/60/00) Thành bào tử có 1 – 3 lớp, bắt màu vàng khi nhuộm Melzer

Bào tử có dạng hình cầu hoặc elip, đặc biệt trên thành tế bào có quả bào tử

Mã màu bào tử từ 40/60/40/00 đến 40/60/80/00 Thành bào tử có 2 lớp, có phản ứng khi nhuộm Melzer

Bào tử hình cầu, gần hình cầu hoặc hình trứng, đa số màu nâu hoặc có màu nâu đỏ, (mã màu từ 20/60/40/00), thành bào tử rất dày, có khoảng 5 – 6 lớp

Bào tử có hình cầu hoặc gần hình cầu, hình elip Đa số bào tử có màu vàng hoặc vàng nhạt, (mã màu từ

20/40/100/10) Thành bào tử dày, nhiều lớp, bắt màu vàng nhạt trong phản ứng nhuộm Melzer