Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi sử dụng dịch tách chiết làm khuôn dùng trong phản ứng PCR. Phản ứng PCR đƣợc sử dụng 2 mồi
47
VANS1_5 và NS21 với nồng độ mồi thích hợp là 10 nmol.
Đối với phản ứng PCR, việc xây dựng một chu trình nhiệt phù hợp là yếu tố quan trọng nhất, bởi vì yếu tố nhiệt độ đảm bảo cho sự giãn xoắn của phân tử DNA, cũng nhƣ việc gắn mồi và kéo dài chuỗi. Chu trình nhiệt tối ƣu cho phản ứng PCR trình bày ở trên.
Ngoài ra một yếu tố khác cũng không kém phần quan trọng là nhiệt độ gắn mồi. Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào từng loại mồi cụ thể đƣợc tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi:
Tm = 20C x (A + T) + 40C x (G +C) + 3,30C A, T, G, C: các bazơ nitơ
Sau khi tính đƣợc nhiệt độ Tm theo lý thuyết, phản ứng PCR đƣợc tiến hành chạy tại các nhiệt độ gắn mồi khác nhau và đã chọn đƣợc nhiệt độ gắn tối ƣu là 500C trong thời gian 1 phút.
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc tiến hành kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 3.26). Kết quả chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen SSU có kích thƣớc khoảng 0,5 kb đúng theo tính toán lý thuyết. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trƣớc đó [36].
48
Hình 3.9. Kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm PCR M: Marker – thang DNA chuẩn 1 kb.
1: DNA nhân bởi cặp mồi SSU có kích thƣớc 0.5 kb.
3.5.3. Tinh sạch sản phẩm PCR
Nhƣ đã nói ở trên, sản phẩm PCR sau phản ứng vẫn còn lẫn mồi dƣ lại do đó để có đủ lƣợng DNA cho việc giải trình tự gen, sản phẩm PCR đƣợc chúng tôi tiến hành điện di lƣợng lớn với tổng thể tích mỗi giếng là 50 µl, sau đó cắt những băng DNA đặc hiệu dƣới tia UV trƣớc khi thực hiện tinh sạch thu DNA tinh khiết nhất. Kết quả điện di thôi gel ở (hình 3.9.A).
A B
Hình 3.10. Kết quả sản phẩm PCR. M: Marker DNA chuẩn 1 kb.
1: DNA nhân bởi cặp mồi SSU có kích thước 0,5kb (Hình A thôi gel sản phẩm PCR, Hình B tinh sạch sản phẩm PCR).
49
Trong quá trình tiến hành, để thuận tiện cho việc điện di sản phẩm PCR thể tích lớn, ba giếng điện di đƣợc ghép vào làm một (Hình 3.10. A). Trên hình ảnh kết quả, các băng DNA đều rất đặc hiệu, rõ nét, không có dấu hiệu bị đứt gãy và kích thƣớc các băng phù hợp với kích thƣớc đã thiết kế mồi nằm trong khoảng 0,5 kb trong khi mồi dƣ hoàn toàn nằm phía dƣới. Do đó, đoạn gel chứa các băng DNA đƣợc cắt dƣới tia UV sau đó tiến hành tinh sạch, tạo nguyên liệu cho quá trình giải tự gen. Kết quả điện di DNA sau khi tinh sạch thể hiện ở (hình 3.10. B). Trên hình ảnh điện di, các băng DNA hiện rõ nét, không có dấu hiệu đứt gãy, kích thƣớc phù hợp và đặc biệt là đã không còn dƣ lại mồi ở phía dƣới. Điều đó chứng tỏ DNA lúc này đã hoàn toàn tinh khiết, đủ điều kiện để tiến hành giải trình tự gen.
50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Trong 60 mẫu đƣợc khảo sát tại đất trồng cam tại xã Minh Tân huyện Quỳ Hợp, Tỉnh Nghệ An , năm 2011 có tổng số 16 kiểu hình bào tử AMF đƣợc tìm thấy thuộc 6 chi: Acaulospora, Entrophospora, Glomus, Sclerocystis, Glomites và Gigaspora; 3 họ: Acaulosporaceae, Glomaceae và Gigasporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae và Gigasporinae.
Số lƣợng và thành phần loài AMF trong đất trồng cam ở Quỳ Hợp Nghệ An thay đổi theo giống cam, tầng đất.
Thay đổi theo giống cam: Số lƣợng, thành phần loài AMF cao nhất với giống cam Xã Đoài ( 16 AMF), Vân Du (9 AMF), V2( 12 AMF).
Thay đổi theo độ sâu tầng đất: Phẫu diện 0 – 20 cm có số lƣợng loài và thành phần đa dạng nhất (16 loài), kế đó là tầng 20 – 40 cm (12 loài) và thấp nhất là tầng 40 – 60 cm (chỉ có 9 loài).
2. Cây cam con có khả năng sinh trƣởng và phát triển về chiều dài thân ,rễ và số lƣợng rễ khi nhiễm nấm Mycorrhiza so với cây đối chứng.
3. Lần đầu tiên ở Việt Nam đã tách chiết DNA từ bào tử Mycorrhiza trong đất và rễ cam. Đã nhân đƣợc đoạn gen 18S rRNA có kích thƣớc khoảng 0,5 kb từ dịch chiết bào từ nấm và rễ cây nhiễm Mycorrhiza.
Kiến nghị
* Tiếp tục nghiên cứu phân tích giải trình tự đoạn gen 18S rRNA để định danh chính xác tên loài AMF.
* Tiếp tục nghiên cứu hƣớng thu sinh khối bào tử Mycorrhiza để tạo phân bón cho cây cam.
51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Sỹ Giao (1976). Ảnh hưởng của rễ nấm đối với sinh trưởng và
phát triển của cây non thông nhựa. T/s Lâm nghiệp 25, số 12/1976, tr
21 - 36.
2. Nguyễn Sỹ Giao, Nguyễn Thị Nhâm (1977). Bước đầu nghiên cứu ứng dụng một số loại nấm cộng sinh thuần chủng đ ể tạo rễ nấm ở cây con thông nhựa (Pinus Merkussi). Kỉ yếu khoa học, 1976 - 1977, Viện
Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, tr 98 – 103.
3. Nguyễn Sỹ Giao, Nguyễn Thị Nhâm (1980). Nghiên cứu bệnh vàng còi
cây Thông nhựa, dựa vào qui luật cộng sinh với nấm. Kỉ yếu Khoa học
1970 -1980. Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, tr 216 – 224.
4. Nguyễn Sỹ Giao và cộng sự (1998). Viện Thổ nhƣỡng Nông hoá, Viện Lâm Nghiệp, Viện Công Nghệ Sinh, hội thảo về nấm rễ Mycorrhiza. 5. Nguyễn Hồng Hà, Trịnh Thị Thu Hà, Nguyến Thị Hồng Hải, Nguyễn
Ngọc Cƣờng, Trần Ngọc Ninh (2003). Thu thập bào tử nấm cộng sinh
trong vùng rễ quyển cây dược liệu. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn
quốc, Hà Nội 2003, tr 238 - 240.
6. Nguyễn Viết Hiệp (2008) , phân bố nấm rễ cộng sinh Arbuscular mycorhiza fungi trong đất trồng chè ở Thái Nguyên. T/c Khoa học đất,
số 29, tr 17 – 23.
7. Trần Văn Mão – sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích tập 2. Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội 2004 tr 247-251.
8. Nguyễn Thị Minh (2005). Phân lập và tuyển chọn nấm rễ Arbuscular mycorhizae để xử lý cho cây trồng. T/c Khoa học đất, số 23/2005, tr 46
52
9. Nguyễn Thị Minh (2007). Ảnh hưởng của một số loại phân hữu cơ đến
sự thiết lập mối quan hệ cộng sinh của nấm rễ Arbuscular mycorhizae, Gigaspora margirita và sự sinh trưởng của cây chủ. T/c Khoa học đất,
số 28, tr 27 - 31.
10. Nguyễn Đình Quyến – vai trò của Mycorrhiza trong nền Nông – Lâm
nghiệp hiện đại, hội thảo về nấm rễ Mycorrhiza. Viện Thổ Những Nông Hóa, 11/2004.
11. Nguyễn Văn Sức, Bùi Quang Xuân, Nguyễn Viết Hiệp (2004), nghiên cứu, áp dụng kỹ thuật phát triển cộng sinh Mycorrhiza cho một số cây trồng chính tại một số vùng sinh thái phục vụ cho sản xuất nông nghiệp bền vững, báo cáo kết quả nghiên cứu 2004. Viện Thổ Nhƣỡng Nông Hóa, Hà Nội 12/2004.
12. Nguyễn Văn Sức, Bùi Quang Xuân, Nguyễn Viết Hiệp, Nguyễn Thị Nga (2005). Nấm rễ nội cộng sinh (VAM) và quần thể vi sinh vật trong
đất trồng bưởi đặc sản Đoan Hùng – Phú Thọ. T/c Khoa học đất, số
23, tr 42-46.
13. Nguyễn Văn Sức, Bùi Quang Xuân, Nguyễn Viết Hiệp (2006). Khả năng nhân bào tử nhờ các cây ký chủ của 3 chủng nấm rễ nội cộng sinh (Vesicular Arbuscular mycorhiza) SHM 4-DH16, SHM 04-DH47 và SHM 04-TC 139 phân lập từ đất Việt Nam. T/c Khoa học đất, số 24,
tr 33 - 37.
14. Phạm Quang Thu và Nguyễn Đức Thắng (1998). Bước đầu nghiên cứu
thành phần loài nấm ngoại cộng sinh với một số loài Thông ở Việt Nam, Thông tin khoa học Lâm nghiệp 1.
15. Phạm Quang Thu (1999). Ứng dụng vi sinh vật cộng sinh trong việc sản xuất cây con ở vườn ươm. Tạp chí Khoa học, Công nghệ và Quản lí
53
16. Phạm Quang Thu (2002) - Sử dụng nấm cộng sinh và vi sinh vật phân
giải phốt phát để sản xuất cây con Thông nhựa chất lượng cao ở vườn ươm. Bản tin trồng mới 5 triệu ha rừng.
17. Nguyễn Hoàng Yến (2007). Phân bố nấm nội cộng sinh với loài Sao đen (Hoperata Odorata Roxb) tại tỉnh Đồng Nai. Luận văn Thạc sỹ
Khoa học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp. Tiếng nƣớc ngoài
18. Abbott L. K, Robson A. D. (1982). Infectivity of vesicular Arbuscular Mycorrhiza Fungi in agricultural soils. Aust J. Agric Res. 33, pp. 1049
– 1059.
19. Bagyaraj D. J. (1984). Biological interactions with VA mycorrhizal fungi. In: VA mycorrhizae. Bailey C. L. and Mansfield J. W. CRC
Press, Boca Raton, Florida, USA, pp.131 - 154.
20. Bali V, Mammta J, and Mukerji T. (2002). Effect of VAM fungi on Fusarium wilt of cotton and jute. ACOM 1, University of Madras, p. 2.
21. Barea J. (1982). Production of plant growth – regulating substances by
VAM fungus Glomus mosseae. Applied and Environmental
Microbiology. Vol 43, No 3, pp. 810 - 813.
22. Boddington C. L, Dodd, J. C. (2000). The effect of agricultural practices on the development of indigenous Arbuscular Mycorrhiza Fungi I; Field studies in an Indonesian ultisol. Plant and Soil. 218,
137-144.
23. Brundrett M. (2004). Diversity and classification of mycorrizal associations. Biol. Rev. 79, pp. 473 – 495.
24. Brundrett M. (1996). Working with Mycorrhiza in Forestry and Agriculture. Canberra, Australia, pp 141 - 252.
54
25. Daniels B. A, Skipper H. D. (1982). Methods for recovery and quantitative estimation of propagules from soil. In: Schenck NC (ed)
Methods and principles of mycological research. The American Phytological Society, St. Paul, MN, pp 29 – 35.
26. Dehne J. (1982). Interaction between vesicular-Arbuscular Mycorrhiza
Fungi and plant pathogens. Phytopathology, 72: 1115 – 1118.
27. Dirk R. (2003). Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza Fungi, pp.21 – 28. 28. Fa Y. W, Zhao Y. S. (2008). Biodiversity of Arbuscular Mycorrhiza
Fungi in China: a Review. Advances in Environmental Biology, 2(1):
pp. 31 - 39.
29. Friese C. F, Koske R. E. (1991). The spatial dispersion of spores of vesicular-Arbuscular Mycorrhiza Fungi in a sand dune: Microscale patterns associated with the root architecture of American beachgrass.
Mycological Research. Vol. 95, No. 8, pp. 952 - 957.
30. Gerdemann J. W. (1968). Vesicular-arbuscular mycorrhizae and plant
growth. Annual Review of Phytopathology 6, pp. 397 - 418.
31. Gerdemann J. W. (1975). Vesicular-arbuscular mycorrhizae. In: The development and function of roots. (Eds. JG Torrey and DT Clarkson).
Academic Press, New York, USA, pp 575 - 591.
32. Gerdemann J. W, Nicolson T. H. (1963). Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting.
Transaction of the British Mycological Society 46, pp. 235 - 244.
33. Harley J. L. (1959). The biology of mycorrhiza. Leonard Hill, London,
UK
34. Hayman D. S. (1983). The physiology of vesicular arbuscular endomycorrhizal symbiosis. Canadian Journal of Botany 61, pp. 944 –
55
35. Kormanik P.P, McGraw A. C. (1982). Quantification of vesicualar arbuscualar mycorhizae in plant root. In: Scheck N. c. 9ed): method
and principles of mycorrhizal reseach. The American Phytopathological Society, St Paul, pp. 37 – 45.
36. MacMahon, Warner (1984). Dispersal of mycorrhizal fungi: Processes and agents. In: S.E. Williams and M.F. Allen, Editors.
37. Maxam A. M, Gilbert W. (1977). A new method for sequencing DNA,
Proc Natl Acad Sci U S A 74, 560-564.
38. Morton J. B. (1988). Taxonomy of mycorrhizal fungi: Classification nonmenclature and identification. Mycotaxon 32, pp. 276 – 324.
39. Morton J. B, Benny G. L. (1990). Revised classification of Arbuscular
Mycorrhiza Fungi (Zygomycetes): A new order Glomales, two new suborders, Glominae and Gigasporinae, and two new families, Acaulosporaceae and Gigasporaceae, with an emendation of Glomacease. Mycotaxon 37, pp. 471 – 491.
40. Moss E. B. (1959). Observation on the extramatrical mycelium of vesicular-arbuscular endophyte. Transactions of the British Mycological Society 42, pp. 439 – 418.
41. Mosse. B, Hepper. C. M. (1975). Vesicular-arbuscular infections in root organ cultures. Physiological Plant Pathology 5, 215-223.
42. Newman E. I. (1988). Mycorrhizal links between plants: their functioning and ecological significance. Advances in Ecological
Researc, 18: 243-270.
43. Phillips J. M, Hayman D. S. (1970). Improved procedure for clearing roots and staining parasitic and vesicular Arbuscular Mycorrhiza Fungi for rapid assessment of infections. Trans Br Mycol Soc 55:158–
56
44. Roy A. K, Kumari R, Chakraborty B. N, Chakraborty U. (2002). VA mycorrhizae in relation to growth of different tea varieties. Mycorrhiza
News 14, 9-11
45. Ram Reddy S, Pavan K.Pindi and Reddy S. M, 2005. Molecular methods for research on Arbuscular Mycorrhizal fungi in India:
problems and prospects. Current Science, Vol.89, No.10, 2005, pp 1699-1706.
46. Redhead J. F. (1980). Mycorrhiza in Natural Tropical Forest. In: Tropical Mycorrhiza research. (ed.). P. Mikola. Clarendon Press, Oxford.pp.127-142.
47. Schenck N. C, Perez Y. (1990). Manual for the identification of VA mycorrhizal fungi. 3rd edn. Synergistic Publications, Gainesville, FL.
48. Schonbeck F, Dehne H. (1989). VA – Mycorrhiza and plant health. in
“Interrelationships between microorganisms and plants in soil”. Czechoslovak Academy of Sciences, Praha 1989, pp. 83-93.
49. Shipra Singh, Anita Pandey, Bhaskar Chaurasia and Lok Man S. Palni (2008). Diversity of Arbuscular Mycorrhiza Fungi associated with the rhizosphere of tea growing in „natural‟ and „cultivated‟ ecosites.
Canadian Journal of Microbiology, 1993, 39(6): pp 567-575.
50. Schuybert A, Hayman D. S. (1978). Plant growth responses to vesicular –asbuscular mycorrhizae: XVI. Effectiveness of different endophytes at different levels of soil phosphate. New Phytologist
103/1978, pp. 79-80.
51. Smith S.E, D.J. Read (1997). Mycorrhizal Symbiosis. 2nd edition. Academic Press, New York.
52. Sparling G. P, Tinker P. B. (1975). Endomycorrhizas. Academic,
57
53. Taylor T. N, Remy W, Hass A, and Kerp H. (1995). Fossil arbuscular
mycorrhizae from the Early Devonian. Mycologia 87, pp. 560 – 573.
54. Ted S. J. (2000). – The instant expert guide to Mycorrhiza: The conection for functional enocosystems.
55. Ted S. J, Chiristopher Uhl (1983). Mycorrhizae in the rain forest at San
Carlos De Rio Negro, Venezuaela. Acta Cient Venezolana 34/1983, pp.
233-237.
56. Tommerup I. C. (1992). Method for study of the population biology of vescular Arbuscular Mycorrhiza Fungi. In Method in Microbiology.
Vol. 24 Techniques for the study of mycorrhiza. Acedemic press, London, pp. 23-51.
57. Tortora J, Gerard (2002). Microbiology: An Introduction 1992. Benjamin /Cummings Publishing Company, 810pages with illustrations.
58. Trappe J. M, Schenck N. C. (1982). Taxonomy of the fungi forming endomycorrhizae. In: Methods and Principles of Micorrhizal Research
(N. C. Schenck, ed.), The American Phytopathological Society, St. Paul, p. 1-9.
59. Vancura V, Kunc F. (1989). Interrelationships between microorganisms and plants in soil. Publishing House of the
Czechoslovak academy of sciences, Praha, 1989.
60. Walker C. (1987). Current concepts in the taxonomy of the Endogonaceae. In Sylvia, D.M., Hung, L.L. & Graham, J.H. (eds.)
Mycorrhizae in the next decade. IFAS, Gainesville, Florida. Pp. 300 – 302.
58
61. White T. J, (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA gens for phylogentics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ(eds) PCR Protocols:a Guide to Methods and Applications, pp.315-322 Academic Press, New York.
62. http://www.ffp.csiro.au/research/mycorrhiza/ 63. http://www.invam.caf.wvu.edu/
59
PHỤ LỤC
Hình 2.3. Thu mẫu đất và rễ cam tại Quỳ Hợp - Nghệ An
Hình 2.4. Sàng và lọc đất qua rây
60
Hình 2.6. Soi mẫu, phát hiện bào tử AMF nhờ kính hiển vi
Hình 2.7. Chụp ảnh bào tử AMF qua kính hiển vi
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Hoàng – Trƣởng Phòng Vi sinh vật đất – Viện Công nghệ sinh học, đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong quá trình làm việc và hoàn thành luận văn.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến Ths. Nguyễn Viết Hiệp, Phó Trƣởng bộ môn vi sinh vật – Viện Thổ nhƣỡng nông hóa. Đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm tại phòng thí nghiệm. Qua đây tôi cũng xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các cô, các chị và các em trong Phòng Vi sinh vật đất đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực tập tại phòng.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô tham gia giảng dạy tại Khoa sinh, Trƣờng Đại học khoa học, Đại Học Thái Nguyên.
Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, ngƣời thân và bạn bè đã chia sẽ những khó khăn trong cuộc sống và công việc để tôi hoàn thành tốt luận văn.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Thái nguyên, ngày 30 tháng 7 năm 2012
Học viên
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi, các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố