PCR là chữ viết tắt của Polymerase Chain Reaction, đƣợc dịch là phản ứng chuỗi trùng hợp hay “phản ứng khuếch đại gen. Máy chu trình nhiệt (máy PCR), các chuỗi DNA mong muốn đƣợc nhân lên hàng triệu lần trong thời gian ngắn nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide tƣơng tự hai đầu 3’ ở hai của đoạn DNA đích với sự tham gia của Taq DNA polymerase.
Quá trình PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bƣớc (biến tính, gắn mồi, kéo dài) lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ làm tăng gấp đôi lƣợng mẫu của lần trƣớc. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống nhƣ E. coli hay nấm men. PCR cũng là một phƣơng pháp thông dụng hiện nay để phát hiện các bệnh di truyền.
Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thƣờng chỉ đƣợc nhân lên trong quá trình phân bào nguyên nhiễm. Để thực hiện đƣợc quá trình này, đòi hỏi phải có mặt một enzyme DNA polymerase, cũng nhƣ sự tham gia của các đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn với sợi DNA khuôn có đầu 3’OH tự do và các dNTP làm nguồn cung cấp các nucleotide. Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép đƣợc mở xoắn và tách thành DNA sợi đơn. Dƣới tác dụng của DNA polymerase, quá trình tổng hợp DNA đƣợc xảy ra theo cách gắn lần lƣợt các nucleotide vào đoạn mồi tại vị trí 3’OH để kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn.
28
Nguyên tắc của PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp trong ống nghiệm các DNA mới, từ mạch khuôn trong môi trƣờng dƣ thừa dNTP và các cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn DNA mới hình thành lại đƣợc sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Nhƣ vậy số lƣợng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lƣợng bản sao là 2n
.
Kỹ thuật PCR yêu cầu các thành phần sau: + DNA khuôn mẫu.
+ Mồi đặc hiệu chiều dài 15 - 30 nucleotide.
+ Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (viết chung là dNTP).
+ Taq DNA polymerase chịu nhiệt. Nhân đoạn gen SSU bằng PCR
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR
- Thành phẩn phản ứng Nồng độ phản ứng Thể tích (µl)
Nƣớc đã khử ion vô trùng 11,75
Buffer 1 X 2,5
dNTP 10 mM 0,5
Mồi xuôi 10 pmol 1
Mồi ngƣợc 10 pmol 1
Taq DNA polymerase 1 U 0,25
DNA khuôn 8
29
Chu trình nhiệt đã đƣợc tối ƣu hóa: Cho phản ứng PCR
Hình 2.2. Chu trình nhiệt PCR
Chu trình nhiệt trong kỹ thuật PCR đƣợc thực hiện trên máy GenAmp PCR System 9700 thông qua 3 giai đoạn (Hình 2.9):
Giai đoạn 1: Giai đoạn tiền biến tính, tháo xoắn DNA ở 950C trong 3 phút.
Giai đoạn 2: Giai đoạn khuếch đại đoạn DNA thông qua 3 bƣớc. Một là bƣớc biến tính DNA ở 950
C trong 1 phút, hai là bƣớc gắn mồi ở 500C trong 1 phút và ba là bƣớc kéo dài chuỗi ở 720
C trong 2 phút 30 giây. Quá trình này lặp lại trong 30 chu kì.
Giai đoạn 3: Giai đoạn tổng hợp nên chuỗi DNA mới ở 720C trong 10 phút, sau đó mẫu đƣợc bảo quản ở 40
C.
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sau khi tiến hành điện di các mẫu PCR lƣợng lớn, phần gel chứa đoạn gen mong muốn đƣợc thu lại vào ống effendorf 1,5 ml. Quá trình tinh sạch bao gồm những bƣớc sau:
30
Bƣớc 2: Bổ sung Binding buffer II vào ống, chú ý cứ 100ng gel cần bổ sung thêm 400 µl buffer (Ví dụ: 125ng gel thì cần thêm 500 µl buffer), sau đó đem ủ ống trong bể ổn nhiệt ở 65oC đến khi gel tan hoàn toàn.
Bƣớc 3: Cho toàn bộ dịch trong ống effendorf vào cột li tâm lồng trong ống EZ 10 (loại ống chuyên dùng cho li tâm) và để im trong 2 phút ở nhiệt độ phòng. Sau 2 phút, đem ống đi li tâm 12000 vòng/phút trong 3 phút. Kết thúc li tâm, loại bỏ hết phần dịch ở đáy ống, thu cột.
Bƣớc 4: Chuyển cột sau li tâm trƣớc đó vào ống EZ 10 mới, bổ sung Wash Solution với lƣợng tối đa 800 µl và đem đi li tâm lạnh 12000 vòng/phút trong 2 phút. Cũng giống nhƣ bƣớc 3, bỏ phần dịch ở đáy ống, thu cột.
Bƣớc 5: Bổ sung 500 µl Binding buffer nếu nhƣ mẫu muốn tiến hành đọc trình tự luôn.
Bƣớc 6: Bổ sung 700 µl wash buffer tiếp tục li tâm lạnh 12000 vòng/ 1 phút.
Bƣớc 7: ly tâm lại một lần nữa để loại bỏ hết dịch.
Bƣớc 8: chuyển cột từ bƣớc 7 sang ống 1,5 ml đã khử trùng. Bổ sung 50 µl Elution Buffer tiếp tục li tâm lạnh 12000 vòng/ 1 phút.
Bƣớc 9: DNA sau khi đƣợc tinh sạch cần phải đƣợc bảo quản ở -20 o C, dùng 3 - 5 µl mẫu đi điện di kiểm tra, chạy điện di bằng gel agarose 0,8% trong 30 phút, sau đó nhuộm bằng EtBr trƣớc khi chụp ảnh dƣới tia UV trên máy Bio Ra.
31
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LOẠI AMF TRONG CÁC MẪU NGHIÊN CỨU
3.1.1. Hình thái và cấu tạo bào tử AMF trong đất trồng cam ở Quỳ Hợp - Nghệ An
Trong tổng số 60 mẫu đƣợc khảo sát tại đất trồng cam ở Quỳ Hợp – Nghệ An năm 2011 có tổng số 16 kiểu hình bào tử AMF thuộc 6 chi đƣợc tìm thấy nhƣ bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kết quả phân loại bào tử AMF Tên chi Tên chủng Kích
thƣớc µm
Đặc điểm Hình dạng
Acaulospora
Appendicula 150-175
Bào tử hình cầu hoặc gần hình cầu. Đa số bào tử màu trắng, một số ít bào tử màu nâu hoặc nâu nhạt, đôi khi xuất hiện các bào tử màu nâu đỏ (mã màu 20/60/30/10).
Delicate 100-175
Bào tử hình cầu hoặc elip, màu nâu nhạt hoặc nâu vàng (mã màu từ 40/80/70/10). không bắt màu khi nhuộm Melzer
32
Dilatata 125-200
Phần lớn bào tử có dạng hình cầu hoặc gần hình cầu, đôi khi có dạng tròn. Bào tử có màu đỏ đậm, (mã màu từ
60/80/20/00 đến 40/60/100/00),
Lacunose.
120-175
Bào tử có dạng hình cầu hoặc gần hình cầu, đôi khi có dạng elip, màu đỏ vàng (mã màu từ 20/60/60/00 đến
20/60/100/10). Thành bào tử có cấu trúc 5 lớp, chia thành 3 nhóm.
Myriocarpa 150-200
Bào tử có dạng hình trứng hoặc hình tròn, bề mặt có vết lõm,màu nâu hoặc có màu nâu nhạt (40/80/60/00). Thành bào tử có 1 – 3 lớp, bắt màu vàng khi nhuộm Melzer.
scrobiculata 120-175
Bào tử có dạng hình cầu hoặc elip, đặc biệt trên thành tế bào có quả bào tử. Mã màu bào tử từ 40/60/40/00 đến 40/60/80/00. Thành bào tử có 2 lớp, có phản ứng khi nhuộm Melzer.
33
Glomus
Aggregatum 120-175
Bào tử có hình cầu hoặc elip, đặc biệt bào tử có cuống bào tử. Bào tử thƣờng có màu nâu đậm, có thể xuất hiện vàng. Cấu trúc thành rõ rệt, gồm 4 lớp, chia thành 3 nhóm.
Ambisporum 100-150
Bào tử hình cầu, gần hình cầu hoặc hình trứng, đa số màu nâu hoặc có màu nâu đỏ, (mã màu từ 20/60/40/00), thành bào tử rất dày, có khoảng 5 – 6 lớp.
Marcaropus 100-125
Bào tử có hình cầu hoặc gần hình cầu, hình elip. Đa số bào tử có màu vàng hoặc vàng nhạt, (mã màu từ
20/40/100/10). Thành bào tử dày, nhiều lớp, bắt màu vàng nhạt trong phản ứng nhuộm Melzer.
34
Sclerocystis
.
Coccogena
120-150
Bào tử có dạng hình cầu, gần hình cầu, có màu nâu hoặc nâu nhạt
(40/80/30/10). Thành bào tử gồm 2 - 3 lớp.
Coremioides 100-150
Bào tử có hình tròn, màu nâu, đôi khi có màu đỏ, (mã màu từ 40/60/80/00 ). Thành bào tử có 2 lớp, lớp ngoài dày và có màu nâu nhạt đến nâu đậm.
Glomites Rhyniensis 150-200
Bào tử hình cầu hoặc hình elip, đặc biệt trên thành bào tử có cuống bào tử có mầu nâu đậm. Bào tử có màu nâu đậm. Thành bào tử có cấu trúc kiểu liên tiếp, gồm nhiều lớp.
35
Entrophospora
colombiana 150-200
Bào tử hình cầu, gần cầu, bề mặt có các lƣới đa giác, đa số có màu nâu đỏ, số ít có màu nâu thành bào tử dầy, có nhiều quả bào tử.
schenckii 150 -200
Bào tử hình cầu, gần hình cầu hoặc hình thận, bề mặt có các gai nhỏ. Bào tử có màu xám xỉn hoặc nâu tối
(60/80/70/10). Thành bào tử gồm 2 lớp
Gigaspora
Candida, 120–160
Bào tử thƣờng có hình cầu và gần hình cầu, một số có hình elip. Bào tử có màu nâu hoặc đỏ (mã màu từ
20/60/20/00). Thành bào tử có cấu trúc nối tiếp, gồm 3 – 5 lớp
Albida 120-150
Bào tử hình cầu hoặc gần hình cầu, đa số có màu trắng, vàng hoặc vàng kem, (mã màu 60/80/60/00). Thành bào tử có 3 lớp.
36
3.1.2 Thành phần loài AMF trong đất trồng cam ở quỳ hợp thuộc xã Minh Tân - huyện Quỳ Hợp - Tỉnh Nghệ An.
16 kiểu hình AMF xác định đƣợc trong đất trồng cam phủ quỳ xã Minh Tân – huyện Quỳ Hợp - tỉnh Nghệ An thuộc 6 chi, 3 họ và 2 bộ phụ.
Các chi AMF xuất hiện trong đất trồng cam Phủ Quỳ xã Minh Tân- huyện Quỳ Hợp – tỉnh Nghệ An là: Acaulospora, Entrophospora, Glomus, Sclerocystis, Glomites và Gigaspora.
Các họ đƣợc tìm thấy ở đây là: Acaulosporaceae, Glomaceae và
Gigasporaceae.
Các bộ phụ tìm thấy là: Glomineae và Gigasporinae
Thành phần loài chi tiết của 6 chi AMF trong đất trồng cam.
* Chi Acaulospora: Có 6 loài, bao gồm các loài Acaulospora appendiculata, Acaulospora delicate, Acaulospora dilatata, Acaulospora myriocarpa, Acaulospora bireticulata, Acaulospora lacunose.
* Chi Entrophospora: Có 2 loài, bao gồm các loài Entrophospora colombiana, Entrophospora schenckii.
* Chi Glomus: Có 3 loài là Glomus aggretum, Glomus ambisporum, Glomus marcaropus.
* Chi Sclerocystis: Có 2 loài là Sclerocystis coccogena và Sclerocystis coremioides.
* Chi Glomites: Có 1 loài duy nhất Glomites rhyniensis.
* Chi Gigaspora: Có 2 loài Gigaspora candida, Gigaspora albida.
3.1.3. Đặc điểm phân bố AMF trong đất trồng cam Quỳ Hợp – Nghệ An
Cam có thể sinh trƣởng và cho thu hoạch bình thƣờng ở đất xốp. Nhƣng chỉ ở đất tốt, cây cam mới cho năng suất cao, chất lƣợng. Ở Việt Nam, cây cam đƣợc trồng trên 6 loại đất chính trong đó đất đỏ bazan chiếm từ 50 – 60% diện tích đất trồng cam.
37
3.2. PHÂN BỐ CỦA AMF THEO GIỐNG CAM
Các kết quả điều tra chỉ rõ rằng ở Phủ Quỳ, Nghệ An có rất nhiều giống cam khác nhau nhƣng phổ biến nhất là: cam Xã Đoài, Vân Du, và V2. Sƣ̣ phân bố của nấm Mycorrihza giƣ̃a các giống cam có sƣ̣ khác nhau (Hình 3.9).
Giống cam Xã Đoài
Ở giống cam Xã Đoài đã phát hiện đƣợc 16 loài AMF trong đó có: * 6 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora appendiculata, Acaulospora dilatata, Acaulospora bireticulata, Acaulospora lacunose, Acaulospora scrobiculata, Acaulospora elegans, Acaulospora rehmii.
* 2 loài thuộc chi Entrophospora là Entrophospora schenckii,
Entrophospora infrequens.
* 3 loài thuộc chi Glomus là Glomus aggretum, Glomus ambisporum, Glomus australe,
* 2 loài thuộc chi Sclerocystis là Sclerocystis coccogena và Sclerocystis
coremioides.
* 1 loài thuộc chi Glomites là Glomites rhyniensis.
* 2 loài thuộc chi Gigaspora là Gigaspora candida, Gigaspora albida.
Giống Vân Du
Trong đất trồng cam Vân Du có tổng số 9 loài AMF xuất hiện, gồm: * 4 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora delicate, Acaulospora dilatata, Acaulospora myriocarpa, Acaulospora bireticulata, Acaulospora lacunose.
* 2 loài thuộc chi Entrophospora là Entrophospora schenckii, Entrophospora infrequens.
* 1 loài thuộc chi Glomus là:Glomus ambisporum, Glomus aggretum. * 1 loài thuộc chi Gigaspora là Gigaspora candida.
38 Giống cam V2
Ở giống cam V2 đã phát hiện đƣợc 12 loài AMF trong đó có:
* 4 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora delicate, Acaulospora dilatata, Acaulospora lacunose, Acaulospora rehmii.
* 2 loài thuộc chi Entrophospora là Entrophospora colombiana, Entrophospora infrequens.
* 3 loài thuộc chi Glomus là Glomus aggretum, Glomus ambisporum, Glomus marcaropus, Glomus australe.
* 2 loài thuộc chi Sclerocystis là Sclerocystis coccogena và Sclerocystis
coremioides.
* 1 loài thuộc chi Glomites là Glomites rhyniensis.
39
Hình 3.2. Phân bố loài AMF trong chi theo giống cam
Từ kết quả trên cho thấy số lƣợng loài AMF trong đất trồng cam giống cam Xã Đoài là cao nhất (16 loài) sau đó đến giống cam V2 (12 loài) và thấp nhất là giống cam Vân Du (9 loài) (Hình 3.9).
Trong 6 chi AMF xuất hiện ở đất trồng cam ở Quỳ Hợp – Nghệ An, giống cam Xã Đoài có mặt cả 6 chi, Vân Du và V2 chỉ xuất hiện 4 chi xuất hiện là Acaulospora, Entrophospora, Glomus và Gigaspora. Hai chi nấm AMF là Sclerocystis và Glomites không xuất hiện ở đất trồng cam Vân Du,
chi Gigaspora không xuất hiện ở đất trồng cam V2 (Hình 3.10). Theo
Boddington và đtg thì nguyên nhân của sự sai khác này có thể bắt nguồn từ tính chất của giống cam [22]. Đến năm 2002 một lần nữa Roy và đtg cũng khẳng định nguyên nhân sai khác ở các loài là do giống cây [44].
Giống cam Xã Đoài hay còn gọi là giống cam Vinh là giống địa phƣơng hỗn hợp, nhiều biến dị, mọc khỏe, bộ rễ lớn, tán xòe rộng mọc tốt trên cả đất xấu. Đây có thể đƣợc coi là giống thực vật bản địa.
40
Giống cam V2 là giống nhập nội, nguồn gốc từ Nhật Bản, hình thái cây to trung bình, tán đứng, mật độ cành hơi thƣa đƣờng kính thân cây to, phân cành dày, bộ khung tán khỏe, cây sinh trƣởng khá, khi trồng cây có tỷ lệ sống cao.
3.3.PHÂN BỐ CỦA AMF THEO TẦNG ĐẤT
Kết quả nghiên cứu về sự phân bố của thành phần loài AMF trong đất trồng cam ở Phủ Quỳ - Nghệ An theo 3 tầng phẫu diện ở (hình 3.11) nhƣ sau:
Tầng 0 – 20 cm
Trong tầng đất này có tổng số 16 loài AMF xuất hiện bao gồm:
* 6 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora appendiculata, Acaulospora delicate, Acaulospora dilatata, Acaulospora bireticulata, Acaulospora scrobiculata, Acaulospora elegans và Acaulospora rehmii.
* 2 loài thuộc chi Entrophospora là Entrophospora colombiana,
Entrophospora schenckii và Entrophospora infrequens.
* 3 loài thuộc chi Glomus là Glomus ambisporum, Glomus marcaropus và Glomus mosseae.
* 2 loài thuộc chi Sclerocystis là Sclerocystis coccogena và Sclerocystis
coremioides.
* 1 loài thuộc chi Glomites là Glomites rhyniensis.
* 2 loài chi Gigaspora là Gigaspora albida , Gigaspora candida. Tầng 20 – 40 cm
Không nhiều nhƣ ở tầng 0 - 20cm, trong tầng 20 - 40cm, chỉ có 12 loài AMF xuất hiện, bao gồm:
* 4 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora delicate, Acaulospora
dilatata, Acaulospora scrobiculata và Acaulospora elegans.
* 2 loài thuộc chi Entrophospora là Entrophospora colombiana, Entrophospora infrequens.
41
* 1 loài thuộc chi Sclerocystis là Sclerocystis coccogena * 1 loài thuộc chi Glomites là Glomites rhyniensis.
* 2 loài chi Gigaspora là Gigaspora candida, Gigaspora albid Tầng 40 – 60 cm
Có 9 loài AMF xuất hiện trong tầng đất này là:
* 3 loài thuộc chi Acaulospora là Acaulospora dilatata, Acaulospora lacunose và Acaulospora elegans.
* 2 loài thuộc chi Glomus là Glomus aggretum và Glomus australe. * 1 loài thuộc chi Sclerocystis là Sclerocystis coccogena.
* 1 loài thuộc chi Glomites là Glomites rhyniensis.
* 2 loài thuộc chi Gigaspora là Gigaspora candida và Gigaspora
decipiniens.
42
Hình 3.4. Phân bố loài AMF trong chi theo tầng phẫu diện
Nhƣ vậy, thành phần loài AMF tập trung chủ yếu ở tầng mặt (16 loài), giảm dần xuống tầng 20 – 40 (12 loài), thấp nhất ở tầng 40 – 60cm (9 loài). Nói một cách khác số lƣợng loài nấm AMF giảm dần theo chiều sâu phẫu diện ở đất trồng cam. Kết quả phân bố này tƣơng tự nhƣ phân bố của vi sinh vật nói chung trong đất của Tortora (2002) [57].
Một số nghiên cứu cho biết cam có 2 loại rễ là rễ hút và rễ dẫn. Rễ cam có đƣờng kính <1mm, màu vàng ngà đƣợc gọi là rễ hút. Rễ dẫn có đƣờng kính >1mm, màu nâu hoặc nâu đỏ. Ở tầng đất mặt lƣợng rễ hút tập trung đến 60%. Có thể chính vì nguyên nhân này khiến cho số lƣợng loài AMF tập trung chủ yếu ở tầng 0 – 20 cm theo Newman [42]. Nhìn lại các kết quả của các tác giả khác trên thế giới ta cũng thấy chiều hƣớng tƣơng tự. Kết quả nghiên cứu của Redhead (1980) cho thấy AMF giảm đáng kể khi độ sâu tầng
43
đất đạt dƣới 15 cm. Tuy nhiên có nghiên cứu cũng cho thấy AMF có thể xuất hiện dƣới các tầng phẫu diện sâu hơn [46]. Năm 1983, Ted và Chiristopher đã