Điện di là kỹ thuật tách các phân tử dựa trên điện tích, kích thƣớc và hình dạng của chúng trên gel. Trong phƣơng pháp điện di trên gel, các phân tử
26
DNA có điện tích âm, đƣợc kéo qua một lớp gel bán lỏng nhờ một dòng điện về phía cực dƣơng trong buồng điện di.
Thông thƣờng, gel có chứa một phần đƣờng của thạch tinh khiết gọi là agarose, chất này ngoài việc làm gel đồng nhất hơn so với thạch mà nó còn hoạt động nhƣ một rây phân tử, làm tách biệt các đoạn dựa trên kích thƣớc của chúng khi trong điện trƣờng.
Các đoạn DNA càng nhỏ sẽ chuyển động càng nhanh và càng xa so với các đoạn lớn. Để xác định kích thƣớc của một đoạn DNA, ngƣời ta so sánh khoảng cách nó so với khoảng cách mà các đoạn DNA tiêu chuẩn (là một tập hợp nhiều đoạn DNA đã biết rõ kích thƣớc - marker) đi qua.
Nồng độ agarose đƣợc sử dụng khác nhau tùy thuộc vào thí nghiệm cần nghiên cứu, thƣờng nằm trong vùng từ khoảng 0,8 - 1,5%.
Để hiện hình các băng DNA trên bản gel, ngƣời ta thƣờng sử dụng thuốc nhuộm ethydium bromide (EtBr). Chất này liên kết với DNA bằng cách xen vào giữa và kề sát với các cặp bazơ (liên kết nhuộm). Khi chiếu ánh sáng (tia UV) vào bản gel, các liên kết nhuộm sẽ hấp thụ và phát huỳnh quang, kết quả có thể nhận biết đƣợc bằng mắt thƣờng và chụp ảnh đƣợc.
Quy trình:
* Chuẩn bị gel agarose: cân 0,8 g agarose cho vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50 oC rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn lƣợc. Sau khoảng 30 phút, gỡ lƣợc ra và đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel 1 – 2 mm.
* Tra mẫu DNA: Lấy mẫu khoảng 5 – 10 µl mẫu DNA trộn với 3 µl đệm loading dye (chất này vừa có tác dụng tạo màu để quan sát, vừa có tác dụng giúp cho mẫu DNA lắng xuống đáy giếng trƣớc khi chạy điện di) và tra vào các giếng nhỏ trong gel. Sử dụng marker 1kb để làm chỉ thị phân tử.
27
* Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dƣơng. Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào dừng điện di.
* Nhuộm bằng EtBr: bản gel đƣợc lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 µl/ml trong thời gian khoảng 10 phút. Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nƣớc rồi quan sát và chụp ảnh dƣới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel (Bio – Rad).