NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI CỦA NẤM RỄ NỘI CỘNG SINH (ARBUSCULAR MYCORRHIZA)TRONG ĐẤT TRỒNG NGÔ

Nấm rễ nội cộng sinh (AMF Arbuscular Mycorrhizal Fungi) là một nhóm nấm có lợi trong đất và sống cộng sinh trong rễ của thực vật bậc cao. Đây là quần hợp nấm thực vật được biết nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng như hệ sinh thái. AMF được phát hiện từ ít nhất 400 triệu năm trước, có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển, sinh sản của cả thực vật và nấm. Đây được xem là nhóm vi sinh vật chủ yếu tồn tại ở rễ và đất của cây trồng, được tìm thấy trong hầu hết các sinh cảnh trên toàn thế giới và trong khoảng 90% các loài thực vật 74. Mặc dù là nội cộng sinh bắt buộc nhưng mối quan hệ giữa nấm và thực vật được được coi là mối quan hệ “Hội sinh”, do nó mang lại lợi ích cho cả vật chủ và nấm. Trước hết, nấm nhận được các sản phẩm quang hợp từ thực vật bằng cách sống cố định trong rễ của chúng và sau đó phát triển mạng lưới hệ sợi nấm trong vùng bầu rễ để tạo thuận lợi cho việc hấp thụ các chất dinh dưỡng và cung cấp các chất có lợi khác cho vật chủ, cạnh tranh với các vi khuẩn trong đất khác, đồng thời giúp thực vật tăng khả năng lấy nước và chất dinh dưỡng như phốt pho, lưu huỳnh, nitơ và các vi chất dinh dưỡng từ các sợi nấm tạo ra ngoài vùng rễ. Ngoài ra, sự cộng sinh của nấm đã được chứng minh là giúp cho cây trồng có khả năng chống chịu được sự khô hạn hay đề kháng với một số tác nhân gây bệnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-LƯU THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN

LOÀI CỦA NẤM RỄ NỘI CỘNG SINH (ARBUSCULAR MYCORRHIZA)

TRONG ĐẤT TRỒNG NGÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-LƯU THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN

LOÀI CỦA NẤM RỄ NỘI CỘNG SINH (ARBUSCULAR MYCORRHIZA)

TRONG ĐẤT TRỒNG NGÔ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS LÊ THỊ HOÀNG YẾN

TS MAI THỊ ĐÀM LINH

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin phép được gửi những lời cảm ơn sâu sắc tới Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Vi sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành Luận án này.

Tôi xin phép được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Đại học Quốc gia Hà Nội, là đơn vị hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu từ đề tài QG 16.35 để tôi thực hiện được nghiên cứu trong Luận văn này.

Tôi xin phép được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, là đơn thị thực hiện nghiên cứu đã cung cấp cơ

sở vật chất để tôi hoàn thành kết quả nghiên cứu được trình bày trong Luận văn này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Lê Thị Hoàng Yến, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, là giáo viên hướng dẫn đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành Luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Mai Thị Đàm Linh, Bộ môn Vi sinh vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, là giáo viên hướng dẫn đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành Luận văn này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn bộ cán bộ của Viện Vi Sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo của Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.

Tôi xin phép gửi lời cảm ơn tới Khoa Kiểm định Vắc xin Vi rút, Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế, là nơi tôi công tác đã tạo mọi điều kiện cho tôi để tôi hoàn thành Luận văn này.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên, hỗ trợ, dõi theo các bước tiến và chia sẻ với tôi mọi mặt trong cuộc sống và công việc.

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới bố mẹ và gia đình đã luôn bên cạnh, ủng hộ và đồng hành cùng tôi và cho tôi ngày hôm nay.

Hà Nội, ngày 02 tháng 1 năm 2018 Học viên

Lưu Thị Dung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Nấm rễ nội cộng sinh 3

1.2 Lịch sử nghiên cứu 3

1.3 Phương pháp phân loại nấm rễ nội cộng sinh 4

1.3.1 Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh 4

1.3.2 Phân loại 5

1.4 Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh đối với thực vật 10

1.4.1 Khả năng huy động nước và các chất dinh dưỡng 10

1.4.2 Thu nhận hợp chất cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza 10

1.4.3 Tăng sức chống chịu của cây trồng trong điều kiện bất lợi của môi trường 11 1.4.4 Giúp cây chống chịu với bệnh hại 11

1.4.5 Hấp thu lân 12

1.5 Tình hình nghiên cứu AMF trên thế giới 12

1.6 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 16

1.7 Đặc điểm tự nhiên của địa điểm nghiên cứu 18

1.7.1 Đặc điểm tự nhiên của Duy Tiên – Hà Nam 18

1.7.2 Đặc điểm tự nhiên của Thường Tín - Hà Nội 19

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.3 Vật liệu và trang thiết bị 21

2.3.1 Nguyên vật liệu 21

2.3.2 Dụng cụ 22

2.4 Phương pháp 22

2.4.1 Lấy mẫu đất 22

2.4.2 Phân lập AMF 22

2.4.3 Tiệt trùng các bào tử AMF 23

2.4.4 Phân loại nấm rễ nội cộng sinh 24

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Phân lập AMF từ mẫu đất thu thập 28

3.2 Phân loại AMF bằng phương pháp hình thái học 29

3.3 Đánh giá đa dạng thành phần loài của AMF trong các vùng sinh thái nghiên cứu và mối tương quan giữa điều kiện môi trường sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô 45

3.3.1 Dựa vào thành phần loài 45

3.3.2 Dựa vào tần suất xuất hiện 46

3.3.3 Dựa vào mật độ loài 51

3.4 Lựa chọn một số AMF có độ đa dạng cao để phân loại chúng bằng kỹ thuật sinh học phân tử 52

KẾT LUẬN 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

- ADN (Acid deoxiribonucleic): Axit deoxiribonucleotit

- ARN (Acid ribonucleic): Axit ribonucleotit

- AMF(Arbuscular Mycorrhizal Fungi): Nấm rễ nội cộng sinh

- BP (Base pair): Cặp bazơ

- dNTP ( Deoxynucleotide Triphosphates): Nucleotide

- PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng khuếch đại

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại AMF về hình thái học 7

Bảng 2.1 Danh sánh mẫu đất trong nghiên cứu 21

Bảng 2.2.Thành phần của phản ứng PCR 25

Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 26

Bảng 3.1 Số lượng bào tử AMF phân lập 28

Bảng 3.2 Tần suất xuất hiện của các chi AMF 47

Bảng 3.3 Tần suất xuất hiện của các loài AMF 49

Bảng 3.4 Sự phân bố của AMF trong đất theo mật độ loài (SR) 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vị trí địa lý của Duy Tiên - Hà Nam trên bản đồ 19

Hình 1.2 Vị trí địa lý của Thường Tín-Hà Nội trên bản đồ 20

Hình 3.1 Biểu đồ mật độ bào tử AMF phân lập các mẫu ở Hà Nội và Hà Nam 29

Hình 3.2 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora gerdemanii (kích thước bar 100µm) 30

Hình 3.3 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora longula, kích thước bar 30 µm 31

Hình 3.4 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora mellea, kích thước bar 20 µm 31

Hình 3.5 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora morrowiae, kích thước bar 50 µm 32

Hình 3.6 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora rehmii phân lập, kích thước bar 50 µm 32

Hình 3.7 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora sp 1, kích thước bar 30 µm 33

Hình 3.8 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora sp.2, kích thước bar 20 µm 33

Hình 3.9 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora sp.3, kích thước bar 50 µm 34

Hình 3.10 Hình ảnh bào tử loài Centraspora pellucida, kích thước bar 50µm 34

Hình 3.11 Hình ảnh bào tử loài Dentiscutata nigra, kích thước bar 50µm 35

Hình 3.12 Hình ảnh bào tử loài Dentiscutata reticulata, kích thước bar 50µm 35

Hình 3.13 Hình ảnh bào tử loài Dentiscutata sp., kích thước 50 µm 36

Hình 3.14 Hình ảnh bào tử loài Glomus ambisporum, kích thước bar 50 µm 37

Hình 3.15 Hình ảnh bào tử loài Glomus multicaule, kích thước bar 50 µm 37

Hình 3.16 Hình ảnh bào tử loài Glomus intraradice, kích thước bar 50µm 38

Hình 3.17 Hình ảnh bào tử loài Gigasspora albida, kích thước 50µm 38

Hình 3.18 Hình ảnh bào tử loài Gigasspora decipiens, kích thước bar 50µm 39

Hình 3.19 Hình ảnh bào tử loài Gigasspora gigantean, kích thước 100 µm 39

Hình 3.20 Hình ảnh bào tử loài Gigasspora margarita, kích thước bar 50 µm 40

Hình 3.21 Hình ảnh bào tử loài Racocetra gregari, kích thước bar 50µm 41

Hình 3.22 Hình ảnh bào tử loài Rhizophagus clarus, kích thước bar 50µm 41

Hình 3.23 Hình ảnh bào tử loài Rhizophagus sp., kích thước bar 50µm 42

Hình 3.24 Hình ảnh bào tử loài Septoglomus constrictum, kích thước bar 50 µm 42

Hình 3.25 Hình ảnh bào tử loài New Genus 1 sp., kích thước bar 50µm 43

Hình 3.26 Hình ảnh của bào tử loài New Genus 2 sp., kích thước bar 50µm 44

Hình 3.27 Hình ảnh bào tử loài New Genus 3 sp., kích thước bar 50µm 44

Hình 3.28 Tần số xuất hiện của các chi AMF 47

Hình 3.29 Tần suất xuất hiện của các loài AMF 50

Hình 3.30 Mật độ loài AMF 52

Hình 3.31 Cây chủng loại phát sinh của các chủng AMF nghiên cứu và các loài có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào phân tích trình tự 18S 53

MỞ ĐẦU

Nấm rễ nội cộng sinh (AMF - Arbuscular Mycorrhizal Fungi) là một nhómnấm có lợi trong đất và sống cộng sinh trong rễ của thực vật bậc cao Đây là quầnhợp nấm - thực vật được biết nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng trong quá trìnhphát triển của thực vật cũng như hệ sinh thái AMF được phát hiện từ ít nhất 400triệu năm trước, có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển, sinh sản của cả thựcvật và nấm Đây được xem là nhóm vi sinh vật chủ yếu tồn tại ở rễ và đất của câytrồng, được tìm thấy trong hầu hết các sinh cảnh trên toàn thế giới và trong khoảng90% các loài thực vật [74] Mặc dù là nội cộng sinh bắt buộc nhưng mối quan hệgiữa nấm và thực vật được được coi là mối quan hệ “Hội sinh”, do nó mang lại lợiích cho cả vật chủ và nấm Trước hết, nấm nhận được các sản phẩm quang hợp từthực vật bằng cách sống cố định trong rễ của chúng và sau đó phát triển mạng lưới

hệ sợi nấm trong vùng bầu rễ để tạo thuận lợi cho việc hấp thụ các chất dinh dưỡng

và cung cấp các chất có lợi khác cho vật chủ, cạnh tranh với các vi khuẩn trong đấtkhác, đồng thời giúp thực vật tăng khả năng lấy nước và chất dinh dưỡng như phốtpho, lưu huỳnh, nitơ và các vi chất dinh dưỡng từ các sợi nấm tạo ra ngoài vùng rễ.Ngoài ra, sự cộng sinh của nấm đã được chứng minh là giúp cho cây trồng có khảnăng chống chịu được sự khô hạn hay đề kháng với một số tác nhân gây bệnh[55,57]

Cây ngô là nhóm cây chủ lực của Việt Nam, đứng thứ hai sau cây lúa Tuynhiên, sự đa dạng nấm AMF trong đất trồng ngô ở Việt Nam cũng như mối tươngquan giữa điều kiện môi trường sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủngnấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô còn chưa được nghiên cứu nhiều Việcnghiên cứ sự có mặt của AMF trong đất trồng ngô sẽ góp phần làm rõ hơn về sự đadạng của nhóm nấm này trên cây ngô Đồng thời, từ kết quả nghiên cứu có thể lựachọn được những loài ưu thế, tìm hiểu được vai trò và có những đặc tính của AMFtrong việc ứng dụng nâng cao năng suất cây trồng

Xuất phát từ những lý do nếu trên, đề tài “Nghiên cứu đa dạng thành phần

loài nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza) trong đất trồng ngô” được tiến

hành với các mục tiêu nghiên cứu sau:

1 Phân lập, phân loại các chủng nấm rễ nội cộng sinh từ đất trồng ngô tại HàNội và Hà Nam

2 Đánh giá đa dạng thành phần loài của AMF trong các vùng sinh tháinghiên cứu và mối tương quan giữa điều kiện môi trường sống tới sự đa dạng thànhphần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Nấm rễ nội cộng sinh

Nấm rễ (Mycorrhizal) là một hình thức sinh trưởng cộng sinh giữa thực vật

và nấm Đây là quần hợp nấm - thực vật được biết nhiều nhất và đóng vai trò quantrọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng như nhiều hệ sinh thái, với hơn90% các loài thực vật có quan hệ với nấm theo hình thức nấm rễ và phụ thuộc vàomối quan hệ này để tồn tại [67] Có hai loại nấm rễ: nấm rễ nội sinh và nấm rễ ngoạisinh [63]

Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhizal Fungi, AMF) là nhóm cộng

sinh bắt buộc với thực vật và thuộc ngành Glomeromycota.

Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizal) là sợi nấm bao quanh rễ dinh dưỡngchưa hóa gỗ, không xuyên qua mô tế bào mà chỉ kéo dài giữa các vách tế bào

Để phát triển, đầu tiên bào tử nấm thâm nhập qua tế bào vỏ của rễ cây, sau

đó màng sinh chất của tế bào chủ bao quanh sợi nấm, tạo ra những vòng xoắn củasợi nấm ở bên trong tế bào Nấm rễ cộng sinh vào rễ thực vật, hình thành hệ sợi, mởrộng thành mạng lưới vào đất xung quanh rễ và hình thành một mối liên kế cơ bản

và quan trọng giữa thực vật và môi trường xung quanh nó Sự nội cộng sinh nấm và

rễ cây thực chất là hình thức hỗ sinh Cả hai bên sử dụng chất dinh dưỡng trong mốiquan hệ tương hỗ, nấm rễ giúp thực vật lấy dinh dưỡng như photpho, sulfur,nitrogen và các vi lượng từ đất Sự cộng sinh của nấm làm cải thiện khả năng hấpthụ và tuổi đời rễ, tăng cường hấp thu các dinh dưỡng đặc biệt là phốt phát và giảm

khả năng nhiễm bệnh của cây [55,57] Các nấm này đồng thời cũng giảm những ảnhhưởng gây ra bởi các vi sinh vật nhiễm vào rễ, đất mặn, hay bởi nước tù [46]

1.2 Lịch sử nghiên cứu

Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên được Frank - nhà bệnh cây lâm nghiệpngười Đức đưa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấmngoại cộng sinh Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza(rễ) Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nấm nội

cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và Orchid, từng được gọi là

“Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với dạng cộng sinh của nấm bậc

cao với các loài trong họ Ericaceae và Orchidaceae

Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi củahình thức cộng sinh này Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng bọng bêntrong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là “Vesicules” (gọi là thể V).Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi (chùm) trong tế bào thường đượcquan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A) Do vậy, tên gọi “Vesicular - ArbuscularMycorrhiza” (viết tắt là VAM) được hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây.Bên cạnh đó, một số bài báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi

“Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [26]

Những nghiên cứu sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của cácchi nấm AMF, còn sự hình thành thể V không thấy có mặt ở tất cả nấm nội cộngsinh Do vậy, loại hình cộng sinh này còn có tên gọi là “Arbuscular Mycorrhiza” tuynhiên tên này vẫn chưa hoàn toàn thống nhất

Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 được tổ chức tại BồĐào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (AMF) để chỉ loạihình cộng sinh này Do vậy, trong các tài liệu được công bố sau này, thuật ngữ

“Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt là AMF) đã được thống nhất sử dụng thaycho thuật ngữ “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza” bắt đầu từ năm 2008 [30]

1.3 Phương pháp phân loại nấm rễ nội cộng sinh

1.3.1 Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh

Nấm rễ nội cộng sinh có đặc điểm không thể nuôi cấy được trên các môitrường nuôi cấy thông thường mà chỉ có thể sinh trưởng phát triển trong rễ cây nênviệc phân lập nấm rễ nội cộng sinh phải gián tiếp dựa vào sự có mặt của các bào tửtrong đất xung quanh rễ thực vật Hay nói các khác, việc phân lập nấm rễ nội cộngsinh được thực hiện thông qua việc phân lập các bào tử của loài nấm này

Bào tử AMF phân bố rộng rãi trong lòng đất, từ bề mặt phía trên đến độ sâu2,2m Tuy nhiên, 70-85% các bào tử là được tìm thấy ở lớp đất bề mặt 3-10 cm[79] Do vậy, để phân lập AMF, lấy các mẫu đất đã được loại bỏ lớp bên ngoài (3

cm ở phía trên) để đảm bảo mật độ, cấu trúc quần thể nấm AMF không bị ảnhhưởng của các yếu tố (ánh sáng, nhiệt độ,…)

Để phân lập AMF, trước hết cần tách bào tử từ đất bằng phương pháp sàngướt và lọc Phương pháp này được Gerdemann, 1963 đã cải biên cho phù hợp vớinấm nội cộng sinh [38] Trên cơ sở đó, nhóm tác giả Daniel và Skipper, 1982 vàtiếp sau đó tác giả Tommerup, 1992 đã cải tiến thành phương pháp sàng ướt (wetsieving) kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) [28,70]

Phương pháp tích cực và hiệu quả nhất thường được sử dụng rộng rãi trongcác nghiên cứu của Brundrett, 1996 là dùng sàng lọc với các kích cỡ màng khácnhau: 250µm, 100µm và 45µm đường kính lỗ sàng kết hợp với ly tâm ở các nồng

độ đường khác nhau [28] Bào tử AMF sau khi phân lập được phân loại dựa vàohình thái, kích thước theo khóa phân loại của Monton, 1988; Schenck và Pertez,

1990 [51,62]

1.3.2 Phân loại

1.3.2.1 Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái học

Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trước hết phải kể đến việc hình

thành chi Endogone năm 1808 Tiếp đó là chi Glomus do anh em Tulasne mô tả năm 1844 Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ Endogonaceae, sau đó họ

này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc điểm chung Đây là thời điểm đểhoàn thiện sự phân loại và phương pháp nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF.

Năm 1959, Moss (nhà Giải phẫu thực vật) và Bowen (nhà Sinh thái học) đãđưa ra hệ thống mô tả dựa trên cấu trúc vách tế bào, màu sắc và đặc điểm tế bàochất [53] Tuy nhiên, khi áp dụng phương pháp này thì Gerdermann đã phát hiện ra

rằng nhóm Endogone có số lượng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh là Endogone, Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora (trong

đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới) Với hệ thống phân loại của

Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Ấn Độ đã phân

lập từ đất vườn ươm 4 chi AMF: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và

1 chi không cộng sinh (Endogone) [36].

Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đưa 5 loài AMF ra khỏi chi

Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [71], đến năm 1987 Walker cũng

đề xuất như trên [74] Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của Walker vào

3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này được đặt trong bộ mới Glomales [52] Thông

thường, việc phân loại nấm rễ nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái

và cấu trúc của các loại bào tử Một trong những cơ sở quan trọng để phân loại theohình thái là bảng màu của Morton [51] Nhìn chung, hệ thống phân loại AMF đang

áp dụng dựa trên cơ sở hệ thống phân loại của Morton và Benny đưa ra vào năm

1990 và được hoàn chỉnh dần nhờ hàng loạt các nhà nghiên cứu tiếp đó [52]

Năm 1998, Trung tâm Nghiên cứu AMF của Đài Loan (Arbuscularmycorrhizal fungal Collection center in Taiwan - ACT) đề nghị công nhận 2 chi

mới là Glomites và Jimtrappea Hiện nay, hệ thống phân loại của ACT thường được

sử dụng ở các nước Châu Á

Năm 2008, Shipra Singh và cộng sự tiếp tục công bố thêm 2 họ AMF là

Archacosporaceae và Paraglomaceae với 2 chi mới là Archacospora và Paraglomus [66].

Hiện nay, đặc điểm đặc trưng của nhóm nấm rễ nội cộng sinh đã được thốngnhất là không có sự biến đổi màu sắc và hình thái của rễ, có lông hút, không có thểsợi nấm và không có mạng lưới Hartig Nấm rễ nội cộng sinh gồm 2 loại là nấm rễnội cộng sinh không có màng ngăn (AEM) và sợi nấm nội cộng sinh có màng ngăn(SEM) Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ có các túibọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular).

Đặc điểm nhận dạng của một số loài bào tử AMF (dựa theo phân loại củaGerdemann, 1963) được thể hiện trong Bảng 1.1 [38]

Bảng 1.1 Phân loại AMF về hình thái học

có 2 lớp

ambisporum Hình cầu hoặc hình

marcaropus Hình cầu hoặc hìnhtrứng Nâu hoặc mầu vàngnhạt 100-125 Thành bào tử mỏng,có quả bào tử

Acaulospora

appendicula

delicate có quả bào tử, hìnhcầu Có mầu nâu, nâuđậm 100-175 Thành bào tử dày

dilatata Hình cầu, có quả bàotử Có mầu nâu, đen 125-200 Thành bào tử dày,cónhiều lớp

myriocarpa

Có quả bào tử, hìnhcầu hoặc gầnhình cầu

Có mầu nâu hoặc

Thành bào tử dày, cóvách ngăn

bireticulata Hình cầu, dạng quả

schenckii. Hình cầu ,hình tròn Có mầu nâu nhạt 150-200 Thành dày chia bào

Tên chi Tên loài Hình dạng Màu sắc Kích thước (µm) Đặc điểm

Sclerocystis

coccogena hình cầu, gần hìnhBào tử có dạng

Có mầu nâu, nâu

Thành bào tử có 3lớp chia làm 2nhóm

albida Bào tử có dạng hìnhcầu, hoặc elip Có mầu vàng nhạt 120-150

Thành bào tử cócấu trúc nối tiếp,gồm 3 - 5 lớp

1.3.2.2 Phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Các loài AMF khác nhau thường xuất hiện trong cùng một rễ Do vậy, việcphân loại bằng hình thái học trở nên cực kỳ khó khăn Khoảng 160 loài AMF đãđược mô tả bằng các đặc điểm hình thái học của bào tử theo tạp trí VesicularArbuscular Mycorrhiza (INVAM) quốc tế [82] Tuy nhiên, trong tự nhiên, có sựkhác biệt lớn về hình thái bào tử thậm chí trong một số loài AMF [75] và nhiềuAMF chỉ có thể tái sinh sản mà không tạo ra bào tử [42] Phương pháp phân loạibằng kỹ thuật sinh học phân tử là quá trình cần thiết trong việc phân loại và địnhdanh nấm rễ nội cộng sinh mà không phụ thuộc vào các tiêu chí hình thái

Các chuỗi trình tự được sắp xếp bên trong (ITS) đã được sử dụng rộng rãitrong phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử [56].Tuy vậy trình tự này có mức

độ biến đổi cao trong các loài AMF và ngay cả trong các bào tử đơn lẻ [47] Do đó,

sẽ rất khó để tìm ra các ITS đặc trưng cho tất cả AMF

Ngày nay, trong một số ít nghiên cứu đoạn 18S, 28S đoạn D1D2 và ITSđược sử dụng để phân loại AMF, trong đó trình tự 18S vẫn là trình tự được dùngphổ biến cho nhóm nấm này [63] rRNA là công cụ thích hợp cho việc nhận dạng vànghiên cứu phát sinh loài trong Các gen rRNA đã được sử dụng trong phần lớn cácnghiên cứu về sinh học phân tử của AMF và cho kết quả tương đồng với cách phânloại về hình thái bào tử [65] Phản ứng khuếch đại PCR chọn lọc phụ thuộc nhiềuvào tính đặc hiệu của mồi do vậy đã có nhiều nỗ lực nghiên cứu để thiết kế cặp mồiđặc hiệu cho AMF Tuy nhiên, rất khó để có thể khuếch đại chính xác các trình tự từmột số nhóm AMF đã được mô tả gần đây và do đôi khi chúng khuếch đại nhầmsang DNA của các sinh vật khác Các mồi PCR cho các phân nhóm nhỏ hoặc cácgen mục tiêu của AMF tương đối dễ thiết kế và đã được sử dụng thành công trongmột số nghiên cứu [33] Vì vậy để nghiên cứu toàn diện về cấu trúc của toàn bộ hệgen AMF và đa dạng sinh học đòi hỏi các mồi PCR phải đặc hiệu cho tất cả AMF,

và vẫn còn đang trong quá trình hoàn thiện Việc thiết kế mồi đòi hỏi một trình tựmới khi các thông tin của các trình tự AMF mới được cập nhật vào ngân hàng gen.Nghiên cứu của Jaikoo Lee và cộng sự, cặp mồi AML1 và AML2 khuếch đại gen

10

18S của rARN được công bố dùng để phát hiện và nhận dạng AMF Trình tự mồiPCR đã được chứng minh có độ đặc hiệu tốt hơn và bao phủ được tất cả các loàiAMF đã được biết đến [43]

1.4 Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh đối với thực vật

1.4.1 Khả năng huy động nước và các chất dinh dưỡng

Hệ sợi nấm cộng sinh phát triển xung quanh vùng rễ giúp làm tăng diện tích

bề mặt tiếp xúc, tăng khả năng hút nước và các chất dinh dưỡng của cây trồng Đốivới các chất dinh dưỡng kém di động (như ion phốt phát, đồng, kẽm…), cây trồnghút các ion này nhanh hơn khả năng khuyếch tán của chúng trong dung dịch đất nênthường hình thành vùng hẹp cạn kiệt xung quanh rễ Khi đó, hệ sợi nấm nhanhchóng dài ra, vượt qua vùng cạn kiệt để đến với nơi có dinh dưỡng dễ phân giải Do

có đường kính nhỏ hơn so với lông hút của rễ, sợi nấm có thể len lỏi khắp nơi trongđất, kể cả các lỗ hổng rất nhỏ mà rễ không qua được để thu nhận chất dinh dưỡngcung cấp cho cây Ví dụ, như trong trường hợp phốt pho bị cố định chặt, sợi nấmcộng sinh sẽ tiếp cận và tiết ra các axít hữu cơ để sau đó có thể đổi chỗ cho phốtpho (bị hút chặt bề mặt bởi hydroxide kim loại) bằng phản ứng trao đổi, hoà tanoxide kim loại, tạo phức kim loại trong dung dịch, do vậy ngăn chặn được sự kết tủacủa phốt phát kim loại Nấm cộng sinh Mycorrhiza còn giải phóng phốt pho vô cơthông qua khoáng hoá chất hữu cơ (thuỷ phân hợp chất ester phốtphát hữu cơ) Cáchình thức cộng sinh ở Ericoid Mycorrizha và Ectomycorrizha còn có vai trò quantrọng trong việc khoáng hoá nitơ Chỉ cần một lượng nhỏ AMF có thể huy độngdinh dưỡng từ khối lượng lớn xác thực vật có tỷ lệ C/N cao (hàm lượng lignin vàtannin cao) [29,38,57,67]

1.4.2 Thu nhận hợp chất cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza

Dòng cacbon có thể theo một chiều từ cây xuống AMF hoặc theo chiềungược lại do AMF tự phân giải hợp chất giàu cacbon ở đất Dòng chảy cacbon từcây xuống đất không làm cây trồng thiếu hụt cacbon vì khi AMF xâm nhiễm vào rễcây sẽ kích thích quá trình quang hợp hoạt động mạnh lên nhiều lần (trừ trường hợpánh sáng quá yếu) Trong hệ sinh thái, dòng chảy cacbon xuống nấm và đất mang

11

lại nhiều lợi ích, trong đó: sợi AMF sản sinh ra các enzyme thủy phân (nhưprotease, phosphatase…) có vai trò quan trọng trong quá trình khoáng hoá chất hữu

cơ và huy động chất dinh dưỡng cho cây trồng Sợi nấm kéo dài làm tăng liên kếtvới các hạt đất, cải thiện cấu tượng đất, thông thường có đến 1 – 20 m sợi nấm/gamđất Tạo nên cộng đồng vi sinh vật vùng rễ Đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá

độ phì nhiêu của đất [67]

1.4.3 Tăng sức chống chịu của cây trồng trong điều kiện bất lợi của môi trường

Ở cây nho, nước đóng vai trò rất quan trọng, nên việc thiếu hụt nước tưới gâyảnh hưởng rất lớn lên chất lượng của quả nho [46] Kết quả nghiên cứu ảnh hưởngcủa chủng nấm rễ lên cây nho trồng trong điều kiện thiếu nước cho thấy, việc bổsung nấm rễ giúp nho cải thiện tình trạng hút nước và chất dinh dưỡng Thêm vào

đó, khi môi trường đất bị nhiễm mặn và bị nhiễm kim loại nặng, nấm rễ sẽ hấp thucác kim loại năng hoặc muối và tích trữ chúng trong các túi vesicles bên trong rễcây và có thể lưu trữ các ion muối như natri, clorua và các kim loại nặng [67].Trong môi trường đất khô nấm rễ giúp cây hấp thu nước bằng cách tăng cường tốc

độ thoát hơi nước so với những cây không có nấm rễ cộng sinh Allerm cho rằng tácdụng của nấm trong vùng khô hạn biểu hiện chủ yếu là làm tăng tính chịu hạn củacây và tăng nhanh tốc độ truyền nước trong cây Trước đó, vào năm 1982, Berea vàcộng sự lại cho rằng tác dụng của nấm rễ là cải thiện kết cấu đất và nâng cao lượngnước trong đất từ đó làm tăng khả năng hấp thu nước cho cây [23]

1.4.4 Giúp cây chống chịu với bệnh hại

Nấm cộng sinh ở rễ cây có tác dụng bảo vệ cây chống lại một số vi sinh vật

cây bệnh như Phytophthora infestans (một loài tảo tương tự nấm), do Phytophthora infestans không thể xâm nhập qua hệ sợi nấm để lọt vào rễ [13] Ngoài ra, nấm còn

giúp ngăn chặn cơ học sự xâm nhập của nguồn bệnh bằng cấu trúc sợi đan xen trong

rễ cây, sản sinh các hợp chất kháng sinh (antibiotic), cạnh tranh dinh dưỡng với visinh vật gây bệnh, góp phần làm tăng sức đề kháng cho cây chủ Nấm rễ giúp câytrồng kháng được một số nguồn bệnh trong đất, tiết ra hệ thống đối kháng (induceplant systemic resistance) ngăn cản sự tấn công do một số vi khuẩn và nấm gây hại

12

từ trong đất, giúp chống lại bệnh bạc lá sớm trên cây cà chua do Alternaria solani

gây ra thông qua kích thích hoạt động của β-1,3-glucanase, chitinase, phenylalanineammonia-lyase (PAL) và lipoxygenase (LOX) có trong lá cà chua [55,67] Năm

2003, Salem đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nấm rễ và vi khuẩn vùng rễ cà chualên sự ức chế với bệnh đốm lá của cây Kết quả cho thấy, khi chủng nấm rễ kết hợp

với vi khuẩn Pseudomonas làm tăng khả năng ức chế sự phát triển của bệnh và tăng

năng suất cà chua [59] Song và cs, 2010 đã kết luận rằng, sự cộng sinh của nấm rễđối với cây bắp giúp cho cây tiết ra hợp chất 2,4-dihydroxy-7-methoxy-2 H-1,4-

benzoxazin-3(4 H)-one (Hx) đối kháng với bệnh cháy bìa lá do nấm Rhizoctonia solani và giúp cây bắp tăng trưởng [68].

1.4.5 Hấp thu lân

Deressa và Schenk (2008) nghiên cứu về cây hành tím Allium CepaL và báo

cáo rằng cây hành tím là loài thực vật có hệ thống rễ ngắn, không phân nhánh vàmọc cạn trên bề mặt đất do đó bộ rễ của cây hành tím không thể hút được đầy đủnguồn dưỡng chất trong đất đặc biệt là lân (P) và kết quả là năng suất của hành bịgiảm [29] Nhờ có mối quan hệ cộng sinh với nấm rễ, cây hành có thể chống chịuđược với điều kiện bất lợi của môi trường và gia tăng năng suất củ [24,38,44].Trong canh tác hành tím theo truyền thống thì năng suất của củ hành tím có tươngquan rất lớn với sự cộng sinh của nấm rễ [34]

1.5 Tình hình nghiên cứu AMF trên thế giới

Năm 1963, tác giả Gerdemann đã sử dụng đất không khử trùng như một cáchlây nhiễm AMF và đã chứng minh được rằng cây trồng sẽ phát triển nhanh khi cómặt AMF [37] Năm 1959, trong một báo cáo khoa học khác đã chỉ ra rằng, việcnhiễm AMF làm tăng sinh trưởng của cây táo con từ chồi [53] Cho đến năm 1968,Gerdemann tiến hành thí nghiệm trên cây ngô và yến mạch cũng cho kết quả tương

tự [35] Tuy nhiên, những nghiên cứu về AMF này mới chỉ tập trung vào vấn đềảnh hưởng của chúng đối với sinh trưởng cây trồng mà chưa đề cập nhiều đến giá trịAMF đã mang lại cho cây chủ

13

Năm 1968, những nghiên cứu về AMF và ảnh hưởng của chúng đối với thựcvật mới được tiến hành sâu rộng trên nhiều lĩnh vực nông lâm nghiệp khi các công

bố về mối quan hệ cộng sinh giữa AMF và cây trồng (cả invitro và invivo) đượccông bố [35,54]: AMF không chỉ làm tăng khả năng sinh trưởng, phát triển của câytrồng mà còn có thể làm tăng khả năng hấp thu khoáng (như phốtpho, đồng, kẽm…)trong đất; làm giảm mức độ “sốc” của cây khi đất bị nhiễm mặn, đất quá ẩm, nhiệt

độ đất cao và nhiều nguyên nhân khác

Khi nghiên cứu số lượng AMF trong đất, Schuybert và cộng sự đã nhận thấyrằng: có sự thay đổi về số lượng bào tử AMF trên các loại đất khác nhau [64] Đồngthời với những nghiên cứu về phân loại, tách bào tử, cấu trúc AMF thì ảnh hưởngcủa AMF đối với sự sinh trưởng của cây cũng được quan tâm từ rất sớm Khi nhiễm

3 loài Gigaspora margarita, Glomus macrocarpum và Glomus caledonium cho cây

dâu tây, đã làm tăng đáng kể sinh khối và hàm lượng phốt pho trong cây, trong đó,

Gigaspora margarita có hiệu quả kích thích mạnh hơn 2 loài còn lại Năm 1982,

Dehne cũng phát hiện tác dụng kích thích sinh trưởng của AMF trên cây hành vàcây ngô [28]

Đến năm 1989, nghiên cứu khác còn phát hiện thêm bên cạnh khả năng tăngsinh khối, tăng tỷ lệ thân/rễ thì việc nhiễm AMF còn làm tăng hoạt động củaenzyme nitrogenase và tăng mức độ đồng hoá phốtpho của các cây họ đậu [73].Ngoài ra, Schonbeck và cs còn cho thấy: Thông qua hoạt động trao đổi chất củamình, AMF có ảnh hưởng đến Pyrophotphat (PPi) trong cây chủ, điều này cho thấytác dụng rất lớn của AMF đối với toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển củacây chủ [61]

Năm 1983, Hayman đưa ra kết luận số lượng bào tử AMF trong đất là chỉtiêu quan trọng để đánh giá mức độ ưu thế của loài Trong đó ở đất canh tác, sốlượng loài và số lượng bào tử nhiều hơn trong đất tự nhiên [47] Mặt khác theoFriese thì AMF không dễ phát tán nên tầng đất canh tác là vị trí tốt nhất để xác định

số lượng bào tử [41]

14

Năm 1989, Schonbeck đã phân lập được 15 loài thuộc 3 chi khác nhau là:Glomus, Sclerocystis, Acaulospora trong đất vùng rễ của cây nho và 7 loài thuộcchi Glomus trong đất vùng rễ của cây táo Trong đất trồng trọt thường xuyên (đấttrồng lúa nước, đậu, lúa mỳ và nhiều loại cây trồng khác) luôn có số lượng bào tửAMF cao hơn nhưng thành phần loài của AMF lại thấp hơn so với trong đất tựnhiên Về khả năng bảo vệ cây chủ chống lại các tác nhân gây bệnh của AMF,Schonbeck và Dehne, 1989 đã nghiên cứu trên 11 loại cây trồng phổ biến là đậu, lúamạch, lúa mì, cà rốt, ngô, hành, thuốc lá, cà chua, dưa chuột, rau diếp, hồ tiêu đãnhận thấy, chúng làm giảm 40% các bệnh ở rễ thường gặp trên các loại cây chủ này.Kết quả nghiên cứu về mối quan hệ giữa AMF với các vi sinh vật vùng rễ, cho thấy

sự có mặt AMF đã làm tăng đáng kể lượng vi khuẩn tổng số (đặc biệt là nhóm

Pseudomonas) [61].

Năm 1991, tác giả Friese và Koske cho rằng tất cả bào tử của AMF đều đượcphán tán một cách thụ động với những nhân tố tích cực là gió và động vật [32].Nhưng theo MacMahon và Warner thì ở những vùng khô hạn, gió là nhân tố quantrọng nhất tạo ra sự lây nhiễm tự nhiên của AMF [49] Còn với những nơi ẩm ướt,động vật lại là nhân tố đóng vai trò chủ yếu [32]

Năm 2000, tác giả Ted cũng chỉ ra kết quả tương tự khi nghiên cứu khả năngchống bệnh ở các cây nhiệt đới có AMF (giảm 30 - 45% các tác nhân gây bệnh) [69]

Năm 2002, bằng thực nghiệm, Bali và cộng sự, đã chứng minh hiệu quả của

AMF đối với bệnh héo cây bông do nấm Fusarium gây ra Đối với bệnh ở rễ gây ra

bởi tuyến trùng, AMF có thể cải thiện sức sống của cây chủ, từ đó hạn chế nhữngthiệt hại về sản lượng, đặc biệt với những vùng đất có hàm lượng P2O5 thấp và câyđược nhiễm AMF trước khi bị nhiễm tuyến trùng Như vậy, AMF có thể làm giảmnguồn bệnh hoặc giảm ảnh hưởng của bệnh ở rễ có nguyên nhân do nấm và tuyếntrùng gây ra Tuy nhiên, tác dụng của AMF không thể hiện rõ đối với bệnh ở lá vàbệnh do virus [21]

Trong nhiều năm qua, nấm nội cộng sinh AMF đã được nghiên cứu phổ biếnrộng rãi ở khắp mợi nơi trên thế giới vì rằng việc sử dụng AMF trong nông nghiệp

15

xanh không những làm tăng năng suất cây trồng mà còn giúp hạn chế gây ô nhiễm môitrường và đảm bảo sức khỏe con người so với việc sử dụng phân bón hóa học [50].

AMF có thể nội cộng sinh với 90-95% thực vật trên cạn là vật chủ củachúng, trong đó bao gồm các cây lương thực, cây nông nghiệp và các loại cây trồng

có giá trị Ngô là loại cây nông nghiệp trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới, chiếm tỉtrọng lớn trong số các cây lương thực chính và cũng là một vật chủ quan trọng củaAMF Vì vậy có nhiều nghiên cứu về mối tương quan giữa nấm rễ nội cộng sinhtrong đất trồng ngô ở các nước trên thế giới Ngô là loại cây thích hợp với việc sửdụng hàm lượng P cao 5-20kg P/ha, trồng trong đất pha cát Để cây có thể sử dụng

P tốt hơn, việc sử dụng MAF, đặc biệt là AMF bản địa giúp chúng thâm nhập vào

hệ rễ tốt hơn Phương thức, cách thức bổ sung AMF cũng đã được các nhà khoa họcnghiên cứu và công bố cho rằng bổ sung AMF trong giai đoạn phát triển trong giaiđoạn sớm của ngô giúp việc hấp thu P sớm hơn, tăng cao năng suất cây trồng Hơnnữa, MAF có thể giúp cây hấp thu P và Zn ở khoảng < 15cm [45]

Việc bổ sung AMF vào đất chuyên canh ngô đóng vai trò quan trọng cho sựbền vững hệ sinh thái đất cũng như năng suất cây trồng Nếu trong vùng đất chuyêncanh ngô, không bổ sung AMF trong một khoảng thời gian dài mà chỉ bổ sung phânbón hóa học NP sẽ làm giảm số lượng bào tử cũng như thành phần AMF bản địa[20,60] Năm 2013, Mobasser và Tavassoli đã nghiên cứu ảnh hưởng của nấm AMFtồn tại trong đất trồng ngô trong điều kiện khô hạn ở vùng Goharkouh - Iran chothấy khi xử lý đất trồng ngô với 140kg AMF/ha và không xảy ra khô hạn (điều kiện

lý tưởng) thì số lượng hạt, năng suất sinh học, năng suất hạt và chỉ số thu hoạch làcao nhất Tuy nhiên, hàm lượng protein sẽ đạt hiệu quả cao nhất khi bón 80kgAMF/ha và gây hạn hán tại thời điểm hoa cái nở được 20 ngày [50] Vamerali và cs,(2003) đã chỉ ra rằng, nếu ủ hạt ngô cùng AMF trước khi trồng sẽ tăng năng suấtngô bởi vì AMF giúp vận chuyển nước và chất dinh dưỡng tốt hơn sẽ giúp quá trìnhquang hợp tốt hơn và làm tăng năng suất cây trồng [72] Sajedi và Madani, (2006)cho rằng, trồng ngô có sử dụng AMF tăng năng suất cây trồng trong cả điều kiệnđầy đủ nước và điều kiện khô hạn [58] Hajilau và cs, 2010 cho thấy, sử dụng AMF

16

có thể làm tăng năng suất hạt 5% [39] Đa dạng AMF trong đất trồng ngô cũngđược nghiên cứu rộng rãi, chẳng hạn như: Ở Trung Quốc, năm 2008 Wang và cs đãnghiên cứu đa dạng AMF từ 90 mẫu đất nông nghiệp (trồng ngô, lúa mì hoặc camngọt) ở vùng tìm được 30 loài AMF [77].

1.6 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam AMF đã được nghiên cứu từ những năm 1976 đến nay và đã đạtđược một số kết quả nghiên cứu quan trọng

Nghiên cứu đầu tiên của Nguyễn Sỹ Giao (1976) là về sự có mặt của nấmngoại cộng sinh ở rễ cây thông Nghiên cứu sử dụng nấm cộng sinh thuần chủng đểtạo rễ nấm cho cây thông con, kết quả cho thấy sự vượt trội về chiều cao và đườngkính của những cây được nhiễm nấm so với công thức đối chứng là 20 - 30%, đồngthời đã sử dụng nấm nội cộng sinh để phòng bệnh vàng còi ở thông con và cũng đạtđược những kết quả nhất định [1, 2, 3]

Năm 1998, Phạm Quang Thu và cộng sự tiếp tục nghiên cứu về nấm cộngsinh với thực vật, trong đó được 37 loài nấm (thuộc 9 họ và 7 bộ) cộng sinh với 3

loài thực vật (thông nhựa Pinus merkussi, thông đuôi ngựa Pinus massoniana và thông caribe Pinus caribaea) Công trình này được coi như sự khởi đầu lại cho

những nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, đặc biệt trên đối tượng cây lâmnghiệp Kết quả không chỉ dừng lại ở việc xác định thành phần loài nấm mà còn đisâu hơn trong việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm nấm cộng sinh, ứng dụng rộngrãi trong gieo ươm cây con ở keo và bạch đàn Đây là một mốc quan trọng trongnghiên cứu ứng dụng nấm cộng sinh vì đã chủ động được nguồn nấm lây nhiễmthông qua các chế phẩm sinh học Giá trị của nghiên cứu này còn được thể hiệntrong thực tiễn sản xuất tại tỉnh Vĩnh Phúc, sử dụng chế phẩm nấm cộng sinh đã cảithiện đáng kể tình hình sinh trưởng của cây trồng ở nhiều vùng đất đồi Về mốiquan hệ giữa AMF với cây dược liệu, nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam mới chỉ dừnglại ở việc thu thập mẫu bào tử nấm cộng sinh [15,16,17]

Năm 2004, Trần Văn Mão đã nghiên cứu hiệu quả của nấm VA - Mycorrhizachủ yếu là nấm Glomus, về khả năng hấp thu dinh dưỡng P Hàm lượng P trong tế

17

bào rễ cây bắp có sự cộng sinh của nấm VA - Mycorrhiza tăng 35% đối với các loài

nấm Glomus mosseae và 98% đối với loài nấm Glomus fasciculatum Hàm lượng P

được tích luỹ trong rễ bắp ở dạng hỗn hợp phân tử P hữu cơ và acid hoà tan Hàngngày P được di chuyển đến các bộ phận của cây bắp theo phương pháp động lựchọc, và phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh trưởng của cây [8]

Năm 2005, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Sức và cộng sự, khi tiến hành

nghiên cứu “Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) và quần thể vi

sinh vật trong đất trồng bưởi đặc sản Đoan Hùng, Phú Thọ” đã phát hiện sự có mặtcủa AMF trong tất cả các mẫu thu thập được nhưng tỷ lệ xâm nhiễm thấp chỉ đạtmức 3/5, khả năng nảy mầm của các bào tử nấm rễ bưởi thấp (chỉ đạt 16%) Trongmột nghiên cứu khác, các tác giả đã sử dụng 3 loại cây ký chủ (ngô, cao lương, lúamạch) và 3 chủng AMF để nhân bào tử và đưa ra kết luận: Khi nhân bào tử nhờ cây

ký chủ, mỗi loài cây ký chủ thích hợp cho một chủng nấm, riêng cao lương khôngthích hợp dùng làm cây ký chủ để nhân nhanh bào tử AMF, thời gian thu bào tử tốtnhất là 25 - 40 ngày sau khi cây ký chủ mọc [12,13,14] Các kết quả nghiên cứu gầnđây của Nguyễn Thị Minh (2005, 2007) trên cây họ đậu cũng cho một số kết quảkhả quan ban đầu [9,10] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu còn cho thấy AMF có thể cộngsinh vào các thực vật dược liệu [4], trên đất trồng chè [6], đất trồng bưởi ĐoanHùng [12,13]

Nghiên cứu mới đây của Phạm Quang Thu và Lê Quốc Huy về ảnh hưởngcủa chế phẩm AMF dùng cho cây trồng rừng cho thấy: sau 1 năm bón nhiễm chếphẩm AM đã làm tăng trưởng Keo tai tượng, Keo lá tràm từ 16,29 - 34,14% tùytừng loài và tùy từng địa điểm Bên cạnh đó, sau một năm bón nhiễm chế phẩm

AM, môi trường đất có xu hướng cải thiện về số lượng vi sinh vật đất tổng số, đặcbiệt số lượng bào tử AM trong đất tại hiện trường Đoàn Hùng tăng mạnh đạt 492bào tử /100 gam đất, cao hơn đối chứng 112% [13]

Năm 2012, Trần Thị Như Hằng và cộng sự đã nghiên cứu đa dạng AMF trêncây lúa và cây cà chua và đã tìm thấy 5 chi: Scutellospora, Glomus, Acaulospora,Gigaspora, và Entrophospora [5] Trong đất và rễ cam tại Quỳ Hợp - Nghệ An,

18

Nguyễn Thị Kim Liên và CS (2012) đã điều tra từ từ 60 mẫu đất và rễ cam và đãphân lập được 16 loài AMF thuộc 6 chi: Acaulospora, Entrophospora, Glomus,Sclerocystis, Glomites và Gigaspora Sự phân bố của AMF ở các tầng đất khácnhau từ 0-20cm, 20-40cm, 40-60cm cho thấy có sự khác biệt rất lớn về sự phân bốcủa AMF giữa các giống cam và giữa các tầng phẫu diện Nghiên cứu còn cho thấy

có sự xâm nhiễm trở lại của AMF trên cây cam con, cây cam con được bổ sung bào

tử AMF có chiều dài rễ và số lượng rễ lớn hơn so với cây đối chứng [7]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu trên chủ yếu tập trung vào phân lập, phânloại và đánh giá thành phần các loài nấm rễ trên các cây nghiên cứu Tuy nhiên,trong các nghiên cứu của nhóm nghiên cứu Phạm Quang Thu và Lê Quốc Huy thì

đã nghiên cứu phát triển chế phẩm AMF cho cây lâm nghiệp, trong đó chú trọngđến cây thông và cây bạch đàn [17]

Mặc dù, AMF có quá nhiều lợi ích, song sản phẩm thương mại từ chúngchưa được phổ biến rộng rãi trên thị trường bởi vì có quá nhiều khó khăn trong các

kỹ thuật nuôi cấy nhân giống bào tử AMF Đặc biệt là phương pháp phân lập bào tửAMF Do vậy việc nghiên cứu tìm kiếm phương pháp phân lập bào tử để thu nhậnnấm AMF, đồng thời đánh giá thành phần loài, mối tương quan và sự đa dạng vềnấm AMF ở các khu vực là cần thiết và có ý nghĩa khoa học

1.7 Đặc điểm tự nhiên của địa điểm nghiên cứu

1.7.1 Đặc điểm tự nhiên của Duy Tiên – Hà Nam

Duy tiên Hà Nam là huyện nằm ở phía bắc của tỉnh Hà Nam, phía bắc giáp

Hà Nội Huyện có địa hình đặc trưng của vùng đồng bằng thuộc khu vực châu thổSông Hồng Nhìn chung địa hình của huyện khá thuận lợi cho phát triển sản xuấtnông nghiệp, đặc biệt là trồng lúa và cây vụ đông (cây ngô, cây khoai tây và câyđậu tương…)

Mùa mưa: Bắt đầu từ tháng 4 và kết thúc vào tháng 10 với đặc trưng là nóng,

ẩm và mưa nhiều Hướng gió thịnh hành là gió Đông - Nam với tốc độ m/s Nhiệt

độ trung bình cao nhất 38ºC, lượng mưa từ 1.100-1.500 mm, chiếm 80% lượng mưa

cả năm

19

Mùa khô: Bắt đầu từ giữa tháng 11 cho đến cuối tháng 3 năm sau, có khí hậulạnh, ít mưa Hướng gió thịnh hành là Đông – Bắc, thường gây lạnh đột ngột Nhiệt

độ trung bình thấp nhất là 15ºC

Lượng mưa: Lượng mưa hàng năm từ 1.800-2.000 mm, tập trung vào tháng

7, 8, 9 (chiếm 80% tổng lượng mưa trong năm)

Hình 1.1 Vị trí địa lý của Duy Tiên - Hà Nam trên bản đồDuy Tiên có diện tích tự nhiên 12.100,35 ha Đất đai trong huyện chủ yếuđược hình thành do quá trình bồi lắng của phù sa hệ thống sống Hồng và sông ChâuGiang Theo nguồn gốc phát sinh có thể chia đất đai của huyện thành 3 nhóm chính:Nhóm Đất phù sa, với 6.679,0 ha (48,55% diện tích tự nhiên) đóng vai trò chínhtrong sản xuất nông nghiệp Đây là loại đất phân bố hầu hết ở các xã trong huyện,được sử dụng với nhiều cơ cấu cây trồng cũng như chế độ canh tác khác nhau

1.7.2 Đặc điểm tự nhiên của Thường Tín - Hà Nội

Thường Tín - Hà Nội là huyện nằm phía Nam của thành phố Hà Nội, trongkhu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa đặc trưng bởi mùa hè nóng, ẩm ướt, mưa to, mùađông lạnh và ít mưa với diện tích là 2.193 km², lượng mưa trung bình hàng năm là

20

1.900 mm, nhiệt độ trung bình là 23.5°C Sự khác biệt khá cao giữa các vùng, mùa

hè ở đồng bằng đến 36-37°C, độ ẩm không khí trung bình hàng năm là 82 %

Hình 1.2 Vị trí địa lý của Thường Tín-Hà Nội trên bản đồ

Về thổ nhưỡng của huyện Thường Tín chủ yếu được bồi đặp bởi 2 con sôngchính là sông Nhuệ và sông Hồng, được chia làm 5 loại chính:

Đất cát trắng: có diện tích khoảng 122,22 ha chiếm 0,96% tổng diện tích đất tựnhiên của huyện Đất phù sa trung tính gley: có diện tích khoảng 171,56 ha chiếm1,34% Đất phù sa chua: có diện tích 6,059,48 ha chiếm 57,45% Đât phù sa trungtính gley: có diện tích 1.711.06 ha, chiếm 13.04% Đất phù sa gley chua: có diệntích khoảng 386,92 ha chiếm 3,03%

21

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1.8 Đối tượng nghiên cứu

Nấm rễ nội cộng sinh được phân lập từ các mẫu đất đã trồng ngô được thuthập tại khu vực Duy Tiên - Hà Nam và Thường Tín - Hà Nội

1.9 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học

Thời gian nghiên cứu: 01/2016- 11/2017

1.10 Vật liệu và trang thiết bị

1.10.1 Nguyên vật liệu

30 mẫu đất đã được thu thập từ các cánh đồng ngô của Duy Tiên - Hà Nam(15 mẫu) và Thường Tín - Hà Nội (15 mẫu)

Bảng 2.1 Danh sánh mẫu đất trong nghiên cứu

Tính chất đất

TT Mẫu Hà Nội Hà Nam

Tính chất đất

1.10.2 Dụng cụ

- Nồi khử trùng - Lequex (France)

- Kính hiển vi - Olympus (Japan).

- Máy ly tâm (Germany)

Bước 2: Dùng xẻng (đã được vô trùng bằng cồn) đào lấy phần bầu đất quanh

rễ cây (ở độ sâu 3 - 20 cm) mỗi mẫu đất trồng ngô khoảng 500 gam Đào lấy rễ vàđất từ từ để hạn chế đứt phần rễ non Mẫu đất sau khi được thu thập về phòng thínghiệm được để khô tự nhiên trong bóng mát, sau đó được đựng trong hộp nhựakín, bảo quản ở nhiệt độ thấp (2-5ºC) tối thiểu 4 ngày trước khi sử dụng cho phântích hoặc nuôi cấy [37]

Bước 3: Khuấy đảo nhẹ nhàng các hạt trong chất lỏng đã đi qua sàng thô vàcho phép các hạt nặng hơn lắng xuống trong vài giây.

Bước 4: Tiếp tục lọc qua sàng 250μm) để loại bỏ các phần lớn các chấtm

Bước 5: Rửa vật liệu giữ lại trên sàng để đảm bảo rằng tất cả các vật liệu cókích cỡ nhỏ hơn 250μm) để loại bỏ các phần lớn các chấtm đã đi qua sàng

Lưu ý: có thể sử dụng sàng có kích thước khác nhau (100μm) để loại bỏ các phần lớn các chấtm, 50μm) để loại bỏ các phần lớn các chấtm) để sàng

và lặp lại các bước như ở trên để lấy bào tử có kích thước mong muốn

Bước 6: Chuyển phần vật chất dư lại trên sàng ở các kích cỡ khác nhau phíatrên vào dung dịch đường nồng độ 30-50%

Loại cloramin bằng pipet và hòa dung dịch bào tử lại trong dung dịch khángsinh (1% gentamycin sµlfate + 2% streptomcyin sµlfate)

Lưu trữ ở 4oC cho đến khi sử dụng

1.11.4 Phân loại nấm rễ nội cộng sinh

1.11.4.1Phân loại AMF bằng phương pháp hình thái học

Chuẩn bị dung dịch Melzer [51,52]

Bước 1: Hoà tan 1,5g KI đến 20ml nước cất

Bước 2: Hòa tan 0,5g I2 trong dung dịch từ bước 1

Bước 3: Hoà tan 20g clorrat hydrat trong dung dịch từ bước 2

Bào tử được nhuộm bằng dung dịch thuốc thử Melzer Từng bào tử đơn độc

đã được quan sát, phân tích trước và sau khi nhuộm chất thử của Melzer dưới kínhhiển vi Nhận biết bào tử dựa vào màu sắc bào tử, kích thước, bề mặt và cấu trúcvách, đối chiếu các mô tả và hình ảnh trong khóa phân loại của Bảo tàng nấmMycorhiza Quốc tế của Đại học West Verginia (https://invam.wvu.edu/) vàSchenck, Pertez, 1990 [62]

1.11.4.2 Lựa chọn các chủng nấm rễ nội cộng sinh có khả năng xâm nhiễm cao

Qua phân tích hình thái học, tiến hành lựa chọn các bào tử AMF có tần xuấtbắt gặp cao nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo [37]

1.11.4.3 Phân loại AMF bằng kỹ thuật sinh học phân tử

a Tách ADN

- Hút từng bào tử đơn độc vào ống eppendorf, dùng đầu côn phá vỡ bào tử

- Bổ sung 70µl đệm phá vỡ tế bào (100mM Tris-HCl (pH=8.0), 20mM

Na2EDTA, 0.5 M NaCl và 1% sodium dodecylsµlfat)

- Sau đó thêm 70µl CI (hỗn hợp chloroform: isoamylacohol = 24:1); li tâmthường 15000 vòng/ 5 phút Lặp lại 2 lần bước này

- Hút ra 70µl dịch phía trên lớp huyền phù ra 1 ống eppendorf mới Thêm70µl isopropanol và 7µl sodium acetate 3M rồi bảo quản mẫu ở -20°C trong 2 giờ.Sau đó tiến hành li tâm lạnh 15000 vòng/15 phút để thu lấy kết tủa

- Thêm 500µl ethanol 70%, li tâm lạnh 15000 vòng/15 phút (lặp lại bước này

2 lần) Loại bỏ cồn, để khô tự nhiên

- Thêm 50µl MQ để trong tủ -20oC dùng cho các bước thí nghiệm tiếp theo

b Khuếch đại ADN

Nhân đoạn ARN 18S dùng cặp mồi NS1 (5’-GTA GTCATA TGC TTG TCTC-3’) và NS4 (5’-CTT CCG TCAATT CCT TTA AG-3’) (White và cs, 1990) Tiếp

theo đó chúng tôi tiến hành PCR lồng (nested RCR) bằng mồi AML1 (5’-ATC

AAC TTTCGA TGG TAGGAT AGA-3’) và AML2 (5’-GAACCC AAA CAC TTTGGT TTC C-3’) đặc hiệu cho AMF để nhân đoạn gen AML của chúng (Jaikoo Lee

và cs, 2008) DNAr được khuếch đại trên máy GeneAmo PCR System 9700(Appiled Biosystems), với các chu trình nhiệt như sau: đầu tiên ADN bị biến tínhthành sợi đơn ở 94oC trong 3 phút, sau đó ADN được nhân đoạn ở 35 vòng, chutrình nhiệt như sau: (1) giai đoạn biến tính ADN thành sợi đơn ở 94oC trong vòng

30 giây, (2) giai đoạn bắt cặp - các cặp mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu củaADN đích: 50oC trong 60 giây, (3) cuối cùng nhiệt độ được nâng lên ở 72oC trong 1phút nhiệt độ thích hợp cho enzyme Taq polymerase hoạt động; kết thúc nhân đoạnADN: nâng nhiệt độ lên 72oC trong 5 phút, sau đó giảm xuống 4oC, giữ mẫu ở nhiệt độnày Thành phần và chu kỳ của phản ứng PCR được thể hiện ở Bảng 2.2 và Bảng 2.3

Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR

15000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ dịch phía trên Rửa bằng 10µl ethanol 70%

Ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút Làm khô mẫu bằng máy cô quay chânkhông trong 3-5 phút

d Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Quá trình điện di các sản phẩm của phản ứng PCR được thực hiện trên thạchagarose trong đệm TAE Đun tan 0,8 % agarose trong dịch TAE (1x) (dung dịch50x TAE: 2ml; nước cất: 98ml; agarose: 0,8g) để ấm, đổ vào khuôn đã cắm lược,đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di Lấy 1µl dung dịch dye, trộnđều với 3µl mẫu, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điệnthế 100V, cường độ dòng điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịchethidium bromua (nồng độ 0,5µl/ml) trong 20 phút, vớt ra quan sát Quan sát trên

máy soi gel.

e Phân tích trình tự gen

Trình tự ADNr của AML được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động(3100 Avant, ABI, Mĩ) Kết quả đọc trình tự được so sánh với các trình tự của cácloài đã được xác định trong ngân hàng gen bằng chương trình BLAST