Khảo sát thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của rễ củ cây sắn dây (pueraria thomsonii benth )

MỤCLỤC MỤCLỤC...iD ANHMỤCCÁCKÍHIỆU,CÁCCHỮVIẾTTẮT...iiiDANH MỤCCÁCHÌNH,SƠĐỒ...ivDANHMỤ CCÁCBẢNG,BIỂUĐỒ...vMỞĐẦUVÀĐ ẶTVẤNĐỀ...1 Chương1.TỔNGQUANTÀILIỆU...3 1.1Tổngquanvềthựcvậthọc...3 1.1.

Khoảngthờigianlàmkhoáluậnlàkhoảngthờigiankhóquênnhấttrongđờitôi.Tôimuốngửilờicảmơnchânthànhđếntấtcảnhữngngườiđãgiúpđỡtôitrongthờigianvừaqua

EmxingửilờicảmơnchânthànhnhấtđếnTS.VõVănLẹo,thầyđãtrựctiếphướngdẫn,kiênnhẫntruyềnđạtnhữngkiếnthứcquíbáu,tậntìnhgiúpđỡemhoànthànhkhoáluậnnày

Emxinchânthànhcảmơncácthầycô,cácanhchịcôngnhânviêntrongBộmônDượcliệuvàcácthầycôtrongBộmônHóasinhtrườngĐHKhoahọcTựnhiênđãnhiệttìnhchỉbảovàtạomọiđiềukiệngiúpđỡđểemcóthểhoànthànhkhoáluậnmộtcáchtốtnhất

Conxincảmơnchamẹđãluônbêncạnhquantâmchămsóc,độngviênvàtạođiềukiệntốtnhấtcảvềtinhthầnvàvậtchất.Đồngthời,cũngxingởilờicảmơnchânthànhtớinhữngngườibạnđãluônbêncạnhđộngviênvàgiúpđỡtôihoànthànhkhóaluậnnày

Trântrọng

PhạmThịCẩmNhung

MỤCLỤC

MỤCLỤC iD ANHMỤCCÁCKÍHIỆU,CÁCCHỮVIẾTTẮT iiiDANH MỤCCÁCHÌNH,SƠĐỒ ivDANHMỤ CCÁCBẢNG,BIỂUĐỒ vMỞĐẦUVÀĐ

ẶTVẤNĐỀ 1

Chương1.TỔNGQUANTÀILIỆU 3

1.1Tổngquanvềthựcvậthọc 3

1.1.1.GiớithiệuvềhọĐậu(Fabacecae) 3

1.1.2.GiớithiệuvềcâySắndâyPuerariathomsonii.Benth 4

1.2.Tổngquanvềhóahọc 6

ThànhphầnhoáhọccủaSắndây 6

1.3.Tổngquanvềtácdụngdượclývàcôngdụng 9

1.3.1.Tácdụngdượclý 9

1.3.2.SắndâytrongĐôngycổtruyền 11

1.3.3.Sắndâytrongdượchọchiệnđại 12

1.4.Cácphươngphápsànglọckhảnăngchốngoxyhóa 14

1.4.1.PhươngphápFRAP 14

1.4.2.PhươngphápđoMDA 15

1.4.3.PhươngphápsànglọckhảnăngloạigốctựdoDPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 16

1.4.4.Phươngphápxácđịnhkhảnăngbấthoạtenzymexanthinoxidase 18

Chương2.ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 19

2.1.Nguyênliệu 19

2.2.Dungmôi,hoáchất 19

2.3.Dụngcụ,thiếtbị 19

2.4.Phươngphápnghiêncứu 20

2.4.1.Khảosátthựcvậthọc 20

2.4.2.Thửtinhkhiết 21

2.4.3.Khảosátthànhphầnhoáhọc 22

2.4.4.Phươngphápnghiêncứuvềtácdụngchốngoxyhoá 28

Chương3.KẾTQUẢVÀBÀNLUẬN 28

3.1.Khảosátvềthựcvậthọc 28

3.1.1.Đặcđiểmhìnhtháidượcliệu 28

3.1.2.Đặcđiểmviphẫurễ 29

3.1.3.Đặcđiểmbộtdượcliệu 31

3.2.Thửtinhkhiết 32

3.2.1.Xácđịnhđộẩm 32

3.2.2.Xácđịnhđộtro 32

3.3.Nghiêncứuthànhphầnhoáhọc 33

3.3.1.Địnhtínhsơbộthànhphầnhoáhọc 33

3.3.2.Chiếtxuấtbằngngấmkiệtvớicồn96% 34

3.3.3.Phântáchcácphânđoạnvàphânlậpcácchất 36

3.3.4.Kiểmtracácchấtphânlậpđượctừcáccaochiết 42

3.3.5.XácđịnhcấutrúchóahọccủaP6 48

3.4.ThửtácdụngchốngoxyhoáinvitrotrênmôhìnhDPPH 52

3.4.1.Chiếtxuấtcaodượcliệuchothửnghiệminvitro 52

3.4.2.Kếtquảthửtácdụngchốngoxyhoácủacáccaochiết,cácphânđoạnchiếtvàcácchấ tphânlậpđược 52

KẾTLUẬNVÀĐỀNGHỊ 55

Kếtluận 55

Đềnghị 56

TÀILIỆUTHAMKHẢO 57

NMR:NuclearMagneticResonance(Phươngphápcộnghưởngtừhạtnhân).SKLM:Sắckílớpmỏng

Pđ:phânđoạn

Hình1.1Câysắndây(PuerariathomsoniiBenth.) 4

Hình1.2.LáSắndây 5

Hình1.3Lákèm2củaSắndây 5

Hình1.4MộtsốchếphẩmcóchứaSắndâytrênthịtrường 13

Hình1.5PhảnứngFRAP 14

Hình1.6PhảnứngtạosảnphẩmMDA-TBA 15

Hình1.7PhảnứngtrunghòagốcDPPH 17

Hình3.1.RễcủSắndây 29

Hình3.2Rễcủ 30

Hình3.3Libe-gỗcấp3 30

Hình3.4Cụmsợilibe 30

Hình3.5Gỗcấp2 30

Hình3.6Bộtdượcliệu 31

Hình3.7CáccấutửtrongbộtrễcủSắndây 31

Hình3.8.KiểmtracaocồnbằngSKLM 35

Hình3.9.Kiểmtrakếtquảphânbốlỏng-lỏng 38

Hình3.10KiểmtracácphânđoạntừcaoDE.HệCHCl3:MeOH:H2O(7:3:1).40 Hình3.11KiểmtracácphânđoạntừcaoEA.HệCHCl3:MeOH:H2O(7:3:1).42 Hình3.12Sắcđồkiểmtracácchấtphânlập.HệCHCl3:MeOH:H2O(7:3:1) 43

Hình3.13Sắcđồkiểmtracácchấtphânlập.HệEA:MeOH(85:15) 43

Hình3.14PhổUVcủaP1 44

Hình3.15PhổUVcủaP2 44

Hình3.16PhổUVcủaP3 45

Hình3.17PhổUVcủaP4 45

Hình3.18PhổUVcủaP5 46

Hình3.19SắckíđồtinhchếP5quacộtrâyphântử 47

Hình3.20SắckýđồkiểmtrađộtinhsạchcủaP6 48

Hình3.21PhổUVcủadaidzein[27] 48

Hình3.22PhổUVcủaP6 48

Hình3.23CấutrúccủaP6(=Daidzein) 51

Sơđồ1.1VịtríphânloạicủaSắndây 4

Sơđồ3.1.QuytrìnhchiếtrễcủSắndâybằngngấmkiệtvớicồn96% 34

Sơđồ3.2.Táchcácphânđoạnbằngchiếtphânbốlỏng-lỏng 37

Sơđồ3.3Phânlậpcácchấttừcaodiethylether 39

Sơđồ3.4Phânlậpcácchấttừcaoethylacetat 41

Bảng3.1.KếtquảxácđịnhđộẩmcủarễcủSắndây 32

Bảng3.2KếtquảxácđịnhđộtrocủabộtrễcủSắndây 32

Bảng3.3.KếtquảđịnhtínhsơbộthànhphầnhoáhọcrễcủSắndây 33

Bảng3.4SosánhλmaxcủaP1,P2,P3,P4vàP5 43

Bảng3.5BảngsosánhλmaxcủaP6vớiλmaxcủadaidzein 49

Bảng3.6SosánhsốkhốicủaP6vớidaidzein 49

Bảng3.7Dữliệuphổ13C-NMRcủaP6sosánhvớidaidzeintrongtàiliệu[31] 51

Bảng3.8Hàmlượngcáccaochiết(%)vớicáchệdungmôikhácnhau 52

Bảng3.9Độhấpthucủacáccaochiếttạiλ=517nmtrênmôhìnhDPPH 53

Bảng3.10Độhấpthucủacácchấtphânlậptạiλ=517nmtrênmôhìnhDPPH 53

Biểuđồ3.1KếtquảhoạttínhchốngoxyhoácácphânđoạntrênmôhìnhDPPH 54

MỞĐẦUVÀĐẶTVẤNĐỀ

Hiệnnay,việcphòngvàchữacácbệnhdosựtácđộngcủacácgốctựdonhưmộtsốbệnhungthư,timmạch,tiểuđườngvàmộtsốchứngbệnhcủaphụnữtiềnmãnkinhđangngàycàngtrởnêncấpthiếttrongcôngtácchămsócsứckhoẻởnhiềuquốcgiatrênthếgiới[40]vàviệctìmracácchấtchốngoxyhoácónguồngốctựnhiênđểlàmthuốcchữacácbệnhtrênlàmộtnhucầuthựctếcủaxãhội

ỞphươngĐông,Sắndây(PuerariathomsoniiBenth.)làmộtloạithảodượcphổbiếnđượcdùn

glâuđờiởcácnướcnhưTrungQuốc,NhậtBản,ViệtNam.Cácnghiêncứuchothấythànhphầnhóahọccủarễbaogồmchủyếulàcácisoflavon,saponinvàtinhbột.Trongyhọccổtruyền,Sắndâyđượcdùngđểchữabệnhcảmsốt,sởimọckhôngđều,viêmruột,kiếtlỵkèmsốtvàkhátnước.BộtSắndâyđượcdùngnhưmộtthứnướcgiảikhátthôngthường,phanướcuốnggiảinhiệt,làmmátcơthểtrongmùahè.Trongyhọchiệnđại,Sắndâyđượcdùngđểchữacáccơnđauthắtngựctrongbệnhmạchvành,mộtcôngdụngnữacũngđángquantâmlàdùngđểchữachứngnghiệnrượu.Riêngisoflavonlàthànhphầnđangđượcquantâmđểchữaungthưvàcácrốiloạncủaphụnữtronggiaiđoạntiềnmãnkinh.Cáctácdụngnàyítnhiềucóliênquanđếntácdụngchốngoxyhoá.TuyvậyhiệncórấtítcôngtrìnhnghiêncứutrênSắndâyvềlĩnhvựcnàyởViệtNam.Dođó,chúngt

ôitiếnhànhđềtài“KhảosátthànhphầnhoáhọcvàtácdụngchốngoxyhoácủarễcủcâySắndây

PuerariathomsoniiBenth.”nhằmkhảosátthànhphầnhoáhọccủarễvàsànglọctácdụngchốn

goxyhoácủacácphânđoạn,chấtphânlậpđượctrênmôhìnhchốngoxyhoáinvitro,đểbướcđầu

chứngminhtácdụngcâythuốcvàlàmcơsởchocácnghiêncứutiếptheovớicácmụctiêucụthểnhưsau:

-TừrễcủSắndâyđượctrồngởViệtNam,khảosátphươngphápchiếtxuấtcaotoànphầnvàtáchthànhcácphânđoạncóđộphâncựckhácnhau

-Từcácphânđoạnđơngiảntiếptụcphânlậpvàxácđịnhcấutrúccủahợpchấtchínhcótrongcácphânđoạnnày

J6ngvaCUacacchtphanlpdugctrenmohinhch6ngoxyhoainvitro(mohinhDPPH).

oàiP.tuberosa(Roxb.ExWilld)DCmọcởNêpan,PakistanvàẤnĐộ,rễcủcóđộc,thườngdùn

gđểthuốccá.[10]

1.1.2.1.Têngọi

Tênkhoahọc:PuerariathomsoniiBenth;Puerarialobata(Willd.)Ohwi.;Puerariatrilobat aBacker.;PuerariahirsutaSchneid.

↓BộĐậu(Fabales)

↓HọĐậu(Fabacecae)

Dạngsống:dâyleodài,khỏe,cókhibòlanmặtđất;thânnonmàuxanh,mềm,cónhiềulôngmịnmàuvàngnâu;thângiàmàuxám,cứng,cónhiềunốtsần

Lámọccách,képlôngchimlẻcó3láchét,cuốnglámàuxanh,cónhiềulông,mặtbụngcórãnhởgiữa,dài10-13cm,phùởđáy

Hình1.2.LáSắndây

Hình1.3Lákèm2củaSắndây

Rễcủlớn,màuxám,vỏngoàicónhiềuđườngvântrònquanhcủ,bầndày,mộtsốchỗbongra,củcắtngangmàutrắng,nhiềusợi,cóvàivòngnâu.[10]

1.1.2.4.Phânbốsinhthái

PuerariaDC.làchinhỏ,gồmcácloàilàdâyleoquấn,phânbốchủyếuởcácvùngnhiệtđớivàcậnnhiệtđớiChâuÁ(16loài);ViệtNamcó5loài,trồngtừvùngnúiđếnđồngbằng.Câyưasáng,biênđộsinhtháirộng,sinhtrưởngpháttriểntốttrênnhiềuvùngđấtvàtiểukhíhậukhácnhau.Mùahoa:tháng9–10,mùaquả:tháng11–12

1.1.2.5.Bộphậndùngvàcáchchếbiến

Rễcủ(RadixPuerariae)thườnggọilàCátcăn,đượcthuháitừcuốitháng10đếntháng3-4nămsau,đemrửasạchđấtcát,tháimỏng,phơisấykhô.Trongyhọccổtruyền,ngườitacònđemxôngsinh(lưuhuỳnh)đểtẩytrắng,chovàobaobìphùhợp,bảoquảnnơithoángmátvàthườngxuyênkiểmtramốimọt.[3]

1.2.Tổngquanvềhóahọc

ThànhphầnhoáhọccủaSắndây

-Trongrễcủsắndâytươicó12%tinhbột(nếukhôcủcóđến40%tinhbột),saponosidvàisoflavon(puerarin,daidzin,daidzein…),puerosidA,puerosidB,nhómoleantritrerpen.Trongdâyvàlákhôcóchứa:protein16,3%;lipid1,8%;glucid31,1%;cellulose31,3%;cácaxítamin(asparaginic,glutamic,adenin,prolin,leucin…).[4]

-CấutrúccủamộtsốIsoflavonoidtrongrễcủSắndây[20]

+Daidzein:APCI–MS(M+H)+:255,137.1 3’),6.88(1H,d,J=2Hz,H-8),6.97(1H,dd,J=9,2Hz,H-6),7.37(2H,d,J=8Hz,H-

H-NMR(DMSO),δ:6.83(2H,d,J=8Hz,H-2’),7.94(1H,d,J=9Hz,H-5),8.25(1H,s,H-2).134),127.5(C-5),115.1(C-6),162.7(C-7),102.3(C-8),

1.3.1.Tácdụngdượclý

1.3.1.1.Tácdụngđốivớitimmạch

Thửnghiệmtrênchó,flavontoànphầncủaSắndâytiêmthẳngvàođộngmạchvànhvớiliều1mg/

kgdẫnđếnlưulượngmạchvànhtăngtrungbình24±5%vàsứckhángmạchvànhgiảm19±3%,nếutăngliều2mg/

kgthìlưulượngmạchvànhtăng53±6%vàsứckhánggiảm34±7%;tácdụngtrênkéodàitrongvòng3phút.Cònbằngđườngtiêmtĩnhmạchphảidùngliềuflavontoànphầncaohơn:20mg/kg,30mg/

kgthìlưulượngmạchvànhtăng15±4%,44,9%vàsứckhángmạchvànhgiảm13,4%,28±6%.Puerarintrênchóthínghiệmtiêmtĩnhmạchvớiliều20mg/

kgcótácdụnghạnchếphạmvinhồimáucơtimthựcnghiệm.Trênlâmsàngởnhữngbệnhnhânnhồimáucơtimcấptính,puerarintrêntĩnhmạchvớiliều4–5mg/

kgsauđó4giờtiếptụctiêmtruyềntĩnhmạchpuerarinvớiliều4–5mg/

kg,kếtquảcácchỉsốtiêuhaooxygencủacơtim,menphosphocreatine–

kinase,∑STtăngcao,∑Qbệnhlývàphạmvinhồimáucơtimđềugiảmsovớilôđốichứng.NhữngkếtquảtrênlàcơsởkhoahọcchoviệcgiảithíchtácdụngđiềutrịbệnhmạchvànhcủaSắndâytrênlâmsàng.[11]

1.3.1.2.Tácdụnghạhuyếtáp

CaoSắndâyvớiliều750mg/

kgtiêmtĩnhmạchcókhảnăngđốikhángvớitácdụngkíchthíchtimcủaisoprenalin,ngoàiracònlàmgiảmnhịptimvàgâyhạhuyếtáp.Trênmạctreoruộtchuộtnhắttrắngnhỏdungdịchpuerarin0,5%cótácdụngđốikhángvớinhữnghiệntượngdoandrenalingâynênnhưgâycobópcácviđộngmạch,lưulượngtuầnhoàngiảm.[11]

Puerarin,daidzeinvàdạngchiếtcồntừSắndây,trênchuộtcốngtrắngvàchuộtnhắttrắngvớinhữngmôhìnhgâyloạnnhịptimbằngaconitin,bariclorid,calciclorid,chloroformvàthắtđộngmạchvànhtráitrướcđềucótácdụngđốikhángrõrệtvớiloạnnhịptimdocáctácnhântrêngâynên.Sosánhtácdụngcủa3dạngthuốctrênthấyrằngdaidzeincótácdụngkhángloạnnhịptimtươngđốimạnh,đốivớicácloạnnhịptimtrênđềucótácdụngrõrệt,dạngchiếtcồncótácdụnggiốngvớidaidzein,điềuđóchứngtỏdaidzeinlàthànhphầnchủyếucótácdụngchốngloạnnhịptim.Cònpuerarinvớiliềulượngtươngđươngcótácdụngđốikhángrõrệtvớiloạnnhịptimdoaconitin,baricloridgâynên,giảmnhẹmứcđộloạnnhịpdothiếumáucơtim,còntácdụngđốikhángvớirungthấtthìkhôngbằngdaidzein.NhữngkếtquảtrênchứngminhviệcdùngSắndâyđểphòngngừavàđiềutrịrốiloạnnhịptim,đặcbiệtlàtrongtrườnghợpthiếumáucơtimlàcócơsởkhoahọc.[11]

1.3.1.4.Tácdụngchốngungthư

DạngchiếtcồntừSắndâyvớiliều10g/

kgtrênđộngvậtthínghiệmcótácdụngứcchếnhấtđịnhvớisựpháttriểncủatếbàosarcom180,ubángEhrlichvàtếbàoungthưphổiLewis.Daidzeinvớinồngđộ14µm/

mlcótácdụngứcchếsựtăngtrưởngcủatếbàoHL.60.[11]

1.3.1.5.Tácdụngphytoestrogen

MộtsốthànhphầncótrongSắndâynhưdaidzeinvàgenisteinhiệnđượcbiếtđếnnhưcácphytoestrogen.Phytoestrogenđượcsửdụngtrongliệupháphormonthaythế,dùngchophụnữtiềnmãnkinhđểhạnchếcácrốiloạndothiếuestrogengâyra.Tácđộngnàylàdochúngcócấutrúctươngtựnhưestrogennêncóthểgắnvàothụthểestrogen[5][28]

Ngoàira,chođếnnaynhiềunghiêncứudịchtễhọctrênphụnữchâuÁvàphụnữÂuMỹchothấycácchếđộăngiàuphytoestrogenđãcảithiệncáctriệuchứngthiếuhụtestrogenởphụnữmãnkinhvàcóthểdựphòngungthưvú,loãngxươngvà

bệnhlýtimmạch.Tuynhiêncácchấtnàythểhiệntácdụngsinhhọcthôngquacáccơchếcựckỳphứctạp.Tácdụngcủachúngtrêntếbàophụthuộcvàolượngthụthểαvàβcủaestrogen.MốiliênquangiữachếđộăngiàuphytoestrogenvàtầnsuấtthấpmắcphảiungthưvúvàungthưniêmmạctửcungđãđượckhảosátrấtkỹlưỡngvàđãđượckhẳngđịnhtrênquầnthểphụnữsinhsốngởĐôngÁ(NhậtBản,ĐàiLoan)vàHawaii.[16],[39]

-Tuynhiên,hiệntrênthịtrườngcórấtítcácsảnphẩmchếbiếntừsắndây.Nhằmtạorasảnphẩmchứcnăngmớicóchấtlượngtốt,cáctácgiảHoàngNgọcTúvàHuỳnhThịMinhTrang(S

inhviênTrườngđạihọccôngnghệSàiGòn)đãtiếnhànhthựchiệnđềtài“Nghiêncứusảnxu ấtrượuchứcnăngtừsắndây”.Trongquátrìnhlênmenrượu,cáctácgiảcũngđãtiếnhànhng

hiêncứutạorasảnphẩmđườngisomalto-oligosaccharid(IMO).Kếtquảphântíchchothấysảnphẩmrượusắndâycóchứapuerarin,đườngIMOcókhảnăngchốngoxyhóarấttốt.Sảnphẩmrượuvangsắndâysaukhitàngtrữvàlênmenphụtrong15ngàycóđộcồnlà12%,màuvàngrơm,trong,cómùivịđặctrưngcủaSắndây.ViệcđánhgiácảmquantheotiêuchuẩnTCVN3215-

79chothấysảnphẩmđạtloạikhá.[6]

-MộtsốchếphẩmđanglưuhànhtrênthịtrườngcóchứacácthànhphầnđượcchiếtxuấttừrễcủSắndây:

Thànhphầngồm:JujubeDates(ĐạiTáo),hỗnhợpProprietaryBlendvớicácacidamin,LáGinkgoBiloba,Isoflavones(từrễcâyKudzu:củsắndây).[42]

+ỶLan:làmộtloạithựcphẩmchứcnăngđượcsảnxuấttừcácnguyênliệuthiênnhiêncótácdụngbổsung,cânbằngnộitiếttốchonữgiới…Thànhphầngồm:Delta-

immun,caoHàthủôđỏ,caomầmCảicủ,caoCátcăn,caoláDâunon,caoláSenbánhtẻ,caoBroccoli,Isoflavonoid,Pregnenolone,DHEA[43]

+Metabosol:làmộtloạithựcphẩmchứcnănggồmcácloạithảodược,cóthểdùngchungvớithuốctâyđiềutrịđáitháođườngtíp1vàđáitháođườngtíp2.Thànhphần:alphaliopicacid,

Lyciumfruit(kỷtử),Morindacitrifolia(Nhàu),Dioscorea(hoàisơn),Cinnamon(Quếc hi),Cornus(Sơnthù),Pueraria(Cátcăn),Phelledendronamurerense(Hoàngbá)[44].

Hình1.4MộtsốchếphẩmcóchứaSắndâytrênthịtrường.

N NFe(II) N N

1,5mlthuốcthửđượctrộnvới50lmẫu.Hỗnhợpnàyđượcmangđiủtrongthờigian1,5giờở37

O

Cvàđượcđoởbướcsóng593nm.ĐườngchuẩnlàdungdịchFeSO4.7H2Ođượcphathànhcácnồngđộ1000,750,500,250và100mMrồichophảnứngvớithuốcthửFRAP.VitaminCđượcsửdụngnhưchấtđốichứng.KếtquảđượcthểhiệnquađơnvịđomolFeII/

PhươngphápđoMDAdựavàophảnứngvớiacidthiobarbituric.MDAphảnứngvớiacidthiobarbituric(TBA)ở90OCtrongmôitrườngacidtạophứcMDA-

TBAcómàuhồng,gồm2molTBAkếthợpvớimộtmolMDA.PhứcmàuđượchoàtantrongdungmôihữucơnhưbutanolrồiđophổhấpthuUVởbướcsóng532nm

O CH=CH-HC

phúttrongthờigian10phút.Lấy2mldịchlytâm,chovào1ốngnghiệm,thêmvào2mlacidthiobarbituric(0,25%),đặtvàonướcsôikhoảng15phút,đểnguội,đođộhấpthuởbướcsóng532nm.Kếtquảđođượclặplạitrên3mẫuthửvàlấygiátrịtrungbình

Tínhkếtquả:

Phầntrămứcchếsựperoxyhóalipidđượctínhtheocôngthức:

%ứcchế=[(X-Y)/X]100Trongđó,X:độhấpthucủamẫuchứng(khôngcómẫuthử)

đượcminhhọatronghình1.7[16]

N N

Tínhkếtquả:

(%)ứcchếgốcDPPHcủacácmẫuthửđượctínhtheocôngthức:

%ứcchếDPPH=[(Ac-At)/Ac]100Trongđó,Ac:độhấpthucủamẫuchứng(khôngcómẫuthử)At:độhấ

pthucủamẫuthửnghiệmởt=16phút

PhươngphápđượcthựchiệntheoNorovàcộngsự(1983)[29],[33]

Nguyêntắc:

Xanthinoxidaselàmộtenzymetiềnoxyhóaxúctácphảnứngoxyhóaxanthintạoaciduric,đồngthờihìnhthànhgốctựdoO2-.PhươngphápthửxanthinoxidasesửdụngphổUV-

Viskhảosátkhảnăngứcchếenzymexanthinoxidasecủacácmẫuthửthôngquamậtđộquangcủasảnphẩmacidurichìnhthành.Aciduriccóbướcsónghấpthucựcđạiở290nm.Chấtcókhảnăngchốngenzymexanthinoxidasecàngcaosẽcànghạnchếsựhìnhthànhaciduric,dođómậtđộquangcủaaciduricsẽgiảm

Thuốcthử:Đệmphosphat70mM(pH=7,5);xanthinoxidase0,08U/ml;HCl1N.

Tiếnhành:

Mộthỗnhợpgồm300ldungdịchmẫu,1500lđệmphosphat70mMvà100lxanthinoxidase0,08U/mlđượcđemđiủtrong15phútở25OC.Sauđóthêmvào

900dungdịchxanthinvàtiếptụcủtrong30phút.CuốicùngphảnứngđượckếtthúcbằngHCl1Nvàđượcđomậtđộquangởbướcsóng290nm

Tínhkếtquả:

Khảnăngứcchếenzymexanthinoxidaseđượctínhtheocôngthức:I(%)=[(

Ac-As)/Ac]100Trongđó,Ac:Giátrịmậtđộquangcủamẫuchứng(khôngcómẫuthử)As:Giátrị

mậtđộquangcủamẫuthửnghiệm

-Cácthuốcthửdùngchophòngthínghiệmdượcliệuhọc(FeCl31%trongethanol,dungdịchNaOH,…)

- Bìnhngấmkiệt

- MáycôquaychânkhôngBuchiiRotavaporR-300kèmbộsinhhàntựđộng

HaakeK-20

- Cácphổ1H-NMR,13d6vớichuẩnnộiTMStrênmáyBrukerAC-500MHztạiViệnhóa–

C-NMR,DEPT,COSY,HSQC,HMBCđượcđotrongDMSO-TrungtâmKhoahọctựnhiênHàNội.CácđộdờihoáhọcđượcghitheođơnvịppmtheochiềutrườnggiảmtínhtừTMS

–

RễSắndâycắtnhỏđượcsấyởnhiệtđộkhoảng60oC,tánnhỏ,nghiềnnáthoặcxaynhỏ.Râyquarâysố32(râymịn).Phầncònlạitrênrâyđượctánhoặcxayvàrâytiếp(cóthểsấylạichodễxaytán,nếucần)chođếnkhitấtcảdượcliệutrênrâytrởthànhbộtmịn

(Khôngđượcbỏquaphầncònlạitrênrây)

–

Phươngphápthựchiện:Chomộtgiọtnướccấtvàogiữaphiếnkính,dùngquesạchtrộnđềubộtdượcliệuđãxay,lấymộtítbộtchovàogiữagiọtchấtlỏng,dùngmộtgóccủalákínhkhuấynhẹđểphântánbộtvàđậylákínhlại.Lấyngóntaytrỏdinhẹtrênlákínhđểcácphầntửcủabộttáchrờiravàphântánđều.Loạibỏphầnbộtvànướcthừanằmphíangoàilákínhbằnggiấythấm,lausạchmặttrênphiếnkínhvàlákínhtrướckhisoikínhhiểnvi

–

QuansáttrênkínhhiểnviđểtìmcáccấutửđặctrưngchorễcủtheochuyênluậnSắndâytrongDượcđiểnViệtNamIV

2.4.2.Thửtinhkhiết

- Xácđịnhđộẩm:tiếnhànhtheoDượcđiểnViệtNamIV(Phụlục9.6,trang182)[1][2][3]

Nguyêntắcxácđịnh:CânP(g)dượcliệu,đemsấyở105-110OCchođếnkhốilượngkhôngđổirồicân.Sựchênhlệchkhốilượngdượcliệutrướcvàsaukhisấytínhtheo%làđộẩmcủadượcliệu.Tiếnhànhđo3lần,lấykếtquảtrungbình

- Xácđịnhđộtrotoànphần:tiếnhànhtheoDượcđiểnViệtNamIV(Phụlục9.8,trang183)

Nguyêntắcxácđịnh:CânP(g)dượcliệu,đemnungở500-600OCchođếnkhichấthữucơcháyhoàntoàn.Lượngtrocònlạitínhtheo

%làđộtrotoànphầncủadượcliệu.Tiếnhànhđo3lần,lấykếtquảtrungbình

Trokhôngtantrongacidhydrochloriclàphầnchấtvôcơkhôngbịhòatantrongacidhydrochloric,thườnglàsilicoxyd.Trokhôngtantrongacidhydrochloricthườngnóilênmứcđộlẫncát,đấtcủadượcliệu

Nguyêntắcxácđịnh:

HòatantrotoànphầnbằngHCl10%.Lọcdungdịchquagiấylọckhôngtro,rửacắnvàgiấylọcbằngnướccấtnóngchođếnkhinướcrửatrungtínhvớichỉthịmàuvạnnăng.Chuyểngiấylọccóchứacắnvàochénnungởtrên,sấykhô,đốtrồinungởnhiệtđộ5000Cchođếnkhikhốilượngkhôngđổi.Cânvàtínhkếtquảtheo(%)

2.4.3.Khảosátthànhphầnhoáhọc

2.4.3.1.Phântíchsơbộthànhphầnhóahọc

Đâylàquytrìnhdùngđểxácđịnhnhanhmộtsốnhómhợpchấtthườnggặptrongnguyênliệuthựcvậtbằngcácphảnứnghóahọc

Nguyêntắc:Chiếttáchhỗnhợpcácchấtcótrongnguyênliệuthựcvậtthành3phânđoạntheođộ

phâncựctăngdần:kémphâncực,phâncựctrungbìnhvàphâncựcmạnhbằngcáchchiếtnguyênliệulầnlượtvớicácdungmôi:etherethylic,ethanolvànước.Sauđóxácđịnhcácnhómhợpchấttrongtừngdịchchiếtbằngcácphảnứnghóahọcđặctrưng

Cáchtiếnhành:



Chiếtdịchchiếtether:chiết25gbộtdượcliệubằngdiethylether,lắctrongmộtbìnhnóntrong20phút.Chiếtchotớikhidịchchiếtethersaukhibốchơikhôngcònđểlạilớpcắnmờtrênmặtkínhđồnghồ.Gộpdịchchiết,lọcvàcôlạiđếnkhicònkhoảng50mldịchchiếtether

Chiếtdịchchiếtcồn:Bãdượcliệuđượcchiếttiếpbằngcồncaođộ(96%)trongbìnhnónvớisinhhànhồilưukhoảng30phúttrênbếpcáchthủy,thựchiện3lần.Gộpcácdịchchiết,lọcvàcôlạiđếnkhicònkhoảng50mldịchchiếtcồn



Chiếtdịchchiếtnước:Bãdượcliệusaukhichiếtbằngcồnđượcđemchiếtnóngvớinướctrongbìnhnóntrênbếpcáchthủysôi.Gộpcácdịchchiết,đểnguội,lọcvàcôlạiđểthuđượckhoảng50mldịchchiếtnước

 Xácđịnhcácnhómhợpchấttrongtừngdịchchiếtbằngcácphảnứnghóahọcđặctrưng.2.4.3.2.Chiếtxuấtbằngphươngphápngấmkiệtvớicồn96%.[1]

Ngấmkiệtlàmộtphươngphápchiếtliêntụctrongđódungmôiđượcđiquadượcliệutheomộthướngnhấtđịnh,vớimộttốcđộnhấtđịnh.Quátrìnhhòatanxảyratrongphươngphápngấmkiệtkhônggiốngnhautrongtoànbộkhốidượcliệumàtheogradientnồngđộ,dungmôi/

dịchchiếtđitừnơidượcliệucóhoạtchấtthấptớinơicólượnghoạtchấtcaohơn

Doquátrìnhchiếtxảyratheogradientnồngđộnênquátrìnhchiếtxảyratriệtđểhơn,lượngdungmôisửdụngíthơnphươngphápngâmvàdượcliệuđượcchiếtkiệthơn

Cáchtiếnhành:dượcliệu,đãxaythànhbộtthô2-4mm,đượclàmẩmtrong30phútvớilượngcồnvừađủ.Sauđónạpdượcliệuvàobìnhngấmkiệtrồithêmdungmôiđếnkhidịchchiếtchảyrakhoảngvàichụcmlthìkhoábìnhvàđểngâmtrong24giờ.Sauđótiếnhànhrútdịchchiếttheocácthôngsốsau:

-Tốcđộrútdịchchiết:5ml/phút

-Tỉlệ(dượcliệu:dungmôi)=(1:6)

KiểmtrasựchiếtkiệtbằngphảnứngvớiFeCl3.Dịchchiếtđượcthuhồidungmôidướiápsuấtgiảm,caothuđượcdùngđểchiếtphânbốlỏng–lỏng

Chiếtphânbốlỏng–

lỏngvớicácdungmôicóđộphâncựctăngdần:diethylether,ethylacetatnhằmmụcđíchlàmgiàucácchấtcóđộphâncựckhácnhauvàgiúpchoviệcphânlậpcácchấttinhkhiếtởgiaiđoạnsautrởnênđơngiảnhơn

2.4.3.4.Phânlậpvàtinhchế

Mụcđíchcủagiaiđoạnnàylàloạibớtcáctạpchấttrongcaochiếtbanđầuđểthuđượccáccaochiếttinhsạchhơn,cácphânđoạngiàuhoạtchấthaycácchấttinhkhiếtphùhợpvớimụcđíchcủaviệcchiếtxuất

Sắckícộtrâyphântử

Nguyêntắc:Cơchếrâyphântửlàmộtcơchếtách,theođó,nhữngchấtcókíchthướcphântửkhá

cnhausẽxâmnhậpvàophatĩnhnằmtrongcácxoangxốpcủagiámangởcácmứcđộkhácnhau,bịgiữtạiphatĩnhvớithờigianlưukhácnhauvàđượcrửagiảiratạicácthờiđiểmkhácnhau.Trongsắckírâyphântử,cácchấtcókíchthướcphântửlớnsẽrakhỏihệthốngtrước,cácchấtcókíchthướcphântửnhỏhơnsẽrasau

Ngoàicơchếrâyphântửlàcơchếchủđạo,chấtrâyphântửnhưSephadexLH-20cũngcònkèmtheocơchếhấpphụvìtrongcấutrúccủacácchấtrâyphântửnàyvẫncònmộtsốnhóm–OHtựdo

Tinhchếbằngphươngpháprửa

Cácchấtcóthểtinhchếbằngcáchrửachosạchcáctạpchất,dungmôirửaphảihoàtanđượctạpvàíthoàtanchấtcầnphânlập.Rửabằngdungmôikémphâncựcđếnphâncựcrồilàmkhôtrongchânkhông

2.4.3.5.Xácđịnhđộtinhkhiếtvàcấutrúccácchấtphânlậpđược

Tiếnhànhtriểnkhaisắckílớpmỏng,đophổMS,NMRvàcácthôngsốvậtlýkhácđểthôngquađóxácđịnhcấutrúcphântử

PhươngphápđophổcộnghưởngtừhạtnhânNMR(NuclearMagnetic

ResonanceSpectroscopy)

PhươngphápđophổNMRlàmộttrongnhữngkĩthuậtquantrọngnhấtvàđượcdùngrộngrãichoviệcxácđịnhcấutrúccácnhómhoạtchất.CócácloạiphổNMRcơbảnsau:

Phổ13C–DEPT-NMR

-

Dấuhiệuđểnhậnbiếtphổnày:Đâylàbộphổ13C-NMR(thangđến200ppm)vàthườngchiathành3phổnhỏ(DEPT90,DEPT135,CPD)

- Thôngtin

+C-IVkhôngchopeaktươngtác

+CHcho1peaktươngtácduynhất

+CH2cho2peaktươngtácvới2proton(thườngtươngđươngnhau)+CH3cho1peaktươngtácmạnhvới1tínhiệuHmethyl

PhổHMBC–NMR

Làphổtươngtác2DgiữaCvàHquanhiềunối(HeteronuclearMultipleBondCoherence)

- Dấuhiệunhậnbiết:

+Ôchữnhật(13Cx1H)+peaktươngtác:nthường≥2,phứctạp

2.4.4.Phươngphápnghiêncứuvềtácdụngchốngoxyhoá

diphenyl–2–picrylhydrazyl)

hóa(AO)củamẫuthử

SựchênhlệchΔAbs(sựsuygiảmđộhấpthucủa[DPPH])sẽchobiếtkhảnăngchốngoxy-Ac–AxAO=

Ac

x100%

-Ac:Độhấpthucủamẫuchứng(DPPH/MeOH)

-Ax:Độhấpthucủamẫuthử(mẫuthử+DPPH/MeOH)

3.1.2.Đặcđiểmviphẫurễ

Cắtngangrễđôikhithấylớpbầncònsótlạitừngmảngmàunâu,gồmnhiềutếbàohìnhchữnhật.Mômềmvỏgồmnhiềutếbàohìnhnhiềucạnhkhôngđều,màngmỏng.Trongmômềmvỏcólibegỗcấp3xếpthành1vòngđồngtâmhoặcthànhtừngvòngnhỏ.Libecấp2hìnhnón,trongcónhiềuđámsợi.Tầngsinhlibegỗthànhvòngliêntục,gồmnhiềutếbàodẹt,cómàngmỏng.Gỗcấp2ítpháttriển,rảiráccómạchgỗvớilớpmỏngmômềmgỗvànhữngđámsợinhỏ.Tiaruộtkhárộng,loeraởphầnmômềmvỏ.Trongmômềmvỏcònchứanhiềuhạttinhbộtvàrảiráccótinhthểcalcioxalathìnhkhối

Hình3.2Rễcủ Hình3.3Libe-gỗcấp3

Hình3.4Cụmsợilibe Hình3.5Gỗcấp2

Bộtmàutrắnghơivàngcólẫncáchạtmàunâu.Nhiềuhạttinhbột,hạtđơnhìnhchỏmcầu,hìnhgầntrònhoặcnhiềucạnh,đườngkính3-

37µm,rốnhìnhchấm,hìnhkhenứthoặchìnhsao;hạtképgồm2-10hạt.Sợiváchdàythườngtậptrungthànhbó,khôngcóhoặccótinhthểcalcioxalathìnhlăngtrụtạothànhsợitinhthể.Mạchkhárộngcóđườngviềnlõmvào,vếtlõmhình6cạnh,hìnhelipđượcsắpxếprấtdàyđặc

Hình3.6Bộtdượcliệu

Hình3.7CáccấutửtrongbộtrễcủSắndây

3.2.1.Xácđịnhđộẩm

Cânchínhxáckhoảng1gdượcliệu,dựatheophụlục9.6(DĐVN-IV,trang182),đođộẩmbằngmáySartoriusMA45,đo3lầnlấykếtquảtrungbình.Kếtquảđượctrìnhbàyởbảng3.1