Khảo sát thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của rễ củ cây sắn dây (pueraria thomsonii benth )

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ CẨM NHUNG KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CỦ CÂY SẮN DÂY PUERARIA THOMSONII BENTH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm (hướng Hóa Sinh) Mã số: 60 42 30 Hướng dẫn khoa học: TS VÕ VĂN LẸO Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 LỜI CẢM ƠN Khoảng thời gian làm khoá luận là khoảng thời gian khó quên nhất trong đời tôi Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả những người đã giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS Võ Văn Lẹo, thầy đã trực tiếp hướng dẫn, kiên nhẫn truyền đạt những kiến thức quí báu, tận tình giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị công nhân viên trong Bộ môn Dược liệu và các thầy cô trong Bộ môn Hóa sinh trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ để em có thể hoàn thành khoá luận một cách tốt nhất Con xin cảm ơn cha mẹ đã luôn bên cạnh quan tâm chăm sóc, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cả về tinh thần và vật chất Đồng thời, cũng xin gởi lời cảm ơn chân thành tới những người bạn đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này Trân trọng Phạm Thị Cẩm Nhung i MỤC LỤC MỤC LỤC .i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ iv DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ v MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Tổng quan về thực vật học 3 1.1.1 Giới thiệu về họ Đậu (Fabacecae) 3 1.1.2 Giới thiệu về cây Sắn dây Pueraria thomsonii Benth 4 1.2 Tổng quan về hóa học 6 Thành phần hoá học của Sắn dây 6 1.3 Tổng quan về tác dụng dược lý và công dụng 9 1.3.1 Tác dụng dược lý 9 1.3.2 Sắn dây trong Đông y cổ truyền 11 1.3.3 Sắn dây trong dược học hiện đại 12 1.4 Các phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa 14 1.4.1 Phương pháp FRAP 14 1.4.2 Phương pháp đo MDA 15 1.4.3 Phương pháp sàng lọc khả năng loại gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) 16 1.4.4 Phương pháp xác định khả năng bất hoạt enzyme xanthin oxidase 18 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên liệu 19 2.2 Dung môi, hoá chất 19 2.3 Dụng cụ, thiết bị 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Khảo sát thực vật học 20 2.4.2 Thử tinh khiết 21 i 2.4.3 Khảo sát thành phần hoá học 22 2.4.4 Phương pháp nghiên cứu về tác dụng chống oxy hoá 28 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 Khảo sát về thực vật học 28 3.1.1 Đặc điểm hình thái dược liệu 28 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu rễ 29 3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 31 3.2 Thử tinh khiết 32 3.2.1 Xác định độ ẩm 32 3.2.2 Xác định độ tro 32 3.3 Nghiên cứu thành phần hoá học 33 3.3.1 Định tính sơ bộ thành phần hoá học 33 3.3.2 Chiết xuất bằng ngấm kiệt với cồn 96% 34 3.3.3 Phân tách các phân đoạn và phân lập các chất 36 3.3.4 Kiểm tra các chất phân lập được từ các cao chiết 42 3.3.5 Xác định cấu trúc hóa học của P6 48 3.4 Thử tác dụng chống oxy hoá in vitro trên mô hình DPPH 52 3.4.1 Chiết xuất cao dược liệu cho thử nghiệm in vitro 52 3.4.2 Kết quả thử tác dụng chống oxy hoá của các cao chiết, các phân đoạn chiết và các chất phân lập được 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 Kết luận 55 Đề nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 5 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT dd: dung dịch DCM: Dichloromethane DE: Diethyl Ether EA: Ethyl Acetate HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng cao áp) Me: Methanol MS: Mass Spectometry (Phương pháp khối phổ) NMR: Nuclear Magnetic Resonance (Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân) SKLM: Sắc kí lớp mỏng Pđ: phân đoạn DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cây sắn dây (Pueraria thomsonii Benth.) 4 Hình 1.2 Lá Sắn dây 5 Hình 1.3 Lá kèm 2 của Sắn dây 5 Hình 1.4 Một số chế phẩm có chứa Sắn dây trên thị trường 13 Hình 1.5 Phản ứng FRAP 14 Hình 1.6 Phản ứng tạo sản phẩm MDA - TBA 15 Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 17 Hình 3 1 Rễ củ Sắn dây 29 Hình 3.2 Rễ củ 30 Hình 3.3 Libe-gỗ cấp 3 30 Hình 3 4 Cụm sợi libe 30 Hình 3 5 Gỗ cấp 2 30 Hình 3.6 Bột dược liệu 31 Hình 3.7 Các cấu tử trong bột rễ củ Sắn dây 31 Hình 3 8 Kiểm tra cao cồn bằng SKLM 35 Hình 3 9 Kiểm tra kết quả phân bố lỏng - lỏng 38 Hình 3 10 Kiểm tra các phân đoạn từ cao DE Hệ CHCl3 : MeOH : H2O (7:3:1) 40 Hình 3 11 Kiểm tra các phân đoạn từ cao EA Hệ CHCl3 : MeOH : H2O (7:3:1) 42 Hình 3 12 Sắc đồ kiểm tra các chất phân lập Hệ CHCl3 : MeOH : H2O (7:3:1) 43 Hình 3 13 Sắc đồ kiểm tra các chất phân lập Hệ EA : MeOH (85 : 15) 43 Hình 3 14 Phổ UV của P1 44 Hình 3 15 Phổ UV của P2 44 Hình 3 16 Phổ UV của P3 45 Hình 3 17 Phổ UV của P4 45 Hình 3 18 Phổ UV của P5 46 Hình 3 19 Sắc kí đồ tinh chế P5 qua cột rây phân tử 47 Hình 3 20 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của P6 48 Hình 3 21 Phổ UV của daidzein [27] 48 Hình 3 22 Phổ UV của P6 48 Hình 3 23 Cấu trúc của P6 (= Daidzein) 51 Sơ đồ 1.1 Vị trí phân loại của Sắn dây 4 Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết rễ củ Sắn dây bằng ngấm kiệt với cồn 96% 34 Sơ đồ 3.2 Tách các phân đoạn bằng chiết phân bố lỏng - lỏng 37 Sơ đồ 3.3 Phân lập các chất từ cao diethyl ether 39 Sơ đồ 3.4 Phân lập các chất từ cao ethyl acetat 41 DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ Bảng 3 1 Kết quả xác định độ ẩm của rễ củ Sắn dây 32 Bảng 3 2 Kết quả xác định độ tro của bột rễ củ Sắn dây 32 Bảng 3 3 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hoá học rễ củ Sắn dây 33 Bảng 3 4 So sánh λmax của P1, P2, P3, P4 và P5 43 Bảng 3 5 Bảng so sánh λmax của P6 với λ max của daidzein 49 Bảng 3 6 So sánh số khối của P6 với daidzein 49 Bảng 3 7 Dữ liệu phổ 13C-NMR của P6 so sánh với daidzein trong tài liệu [31] 51 Bảng 3.8 Hàm lượng các cao chiết (%) với các hệ dung môi khác nhau 52 Bảng 3 9 Độ hấp thu của các cao chiết tại λ = 517nm trên mô hình DPPH 53 Bảng 3 10 Độ hấp thu của các chất phân lập tại λ = 517nm trên mô hình DPPH 53 Biểu đồ 3.1 Kết quả hoạt tính chống oxy hoá các phân đoạn trên mô hình DPPH 54 8 MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, việc phòng và chữa các bệnh do sự tác động của các gốc tự do như một số bệnh ung thư, tim mạch, tiểu đường và một số chứng bệnh của phụ nữ tiền mãn kinh đang ngày càng trở nên cấp thiết trong công tác chăm sóc sức khoẻ ở nhiều quốc gia trên thế giới [40] và việc tìm ra các chất chống oxy hoá có nguồn gốc tự nhiên để làm thuốc chữa các bệnh trên là một nhu cầu thực tế của xã hội Ở phương Đông, Sắn dây (Pueraria thomsonii Benth.) là một loại thảo dược phổ biến được dùng lâu đời ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam Các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của rễ bao gồm chủ yếu là các isoflavon, saponin và tinh bột Trong y học cổ truyền, Sắn dây được dùng để chữa bệnh cảm sốt, sởi mọc không đều, viêm ruột, kiết lỵ kèm sốt và khát nước Bột Sắn dây được dùng như một thứ nước giải khát thông thường, pha nước uống giải nhiệt, làm mát cơ thể trong mùa hè Trong y học hiện đại, Sắn dây được dùng để chữa các cơn đau thắt ngực trong bệnh mạch vành, một công dụng nữa cũng đáng quan tâm là dùng để chữa chứng nghiện rượu Riêng isoflavon là thành phần đang được quan tâm để chữa ung thư và các rối loạn của phụ nữ trong giai đoạn tiền mãn kinh Các tác dụng này ít nhiều có liên quan đến tác dụng chống oxy hoá Tuy vậy hiện có rất ít công trình nghiên cứu trên Sắn dây về lĩnh vực này ở Việt Nam Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài“Khảo sát thành phần hoá học và tác dụng chống oxy hoá của rễ củ cây Sắn dây Pueraria thomsonii Benth.” nhằm khảo sát thành phần hoá học của rễ và sàng lọc tác dụng chống oxy hoá của các phân đoạn, chất phân lập được trên mô hình chống oxy hoá in vitro, để bước đầu chứng minh tác dụng cây thuốc và làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo với các mục tiêu cụ thể như sau: - Từ rễ củ Sắn dây được trồng ở Việt Nam, khảo sát phương pháp chiết xuất cao toàn phần và tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau - Từ các phân đoạn đơn giản tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất chính có trong các phân đoạn này Khao sat tinh ch6ng oxy hoa cua cac cao chi6t tlr cac dung moi c6 eli) phan qrc khac nhau, CUa cac phan dOI_lll thu dUQ'C tlr phan b6 J6ng-J6ng va CUa cac ch t phan lp dugc tren mo hinh ch6ng oxy hoa in vitro (mo hinh DPPH) Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về thực vật học 1.1.1 Giới thiệu về họ Đậu (Fabacecae) 1.1.1.1 Đặc điểm thực vật Họ Đậu là một họ lớn, phân bố hầu như khắp nơi trên thế giới Cây thảo, lá kép lông chim lẻ, luôn luôn có lá kèm Cụm hoa chùm hay chuỳ Hoa đối xứng 2 bên, cánh hoa cờ (cánh lớn và trùm lên 2 cánh bên), tràng tiền khai lợp úp Nhị 10, tất cả đều dính nhau thành ống, 9 dính nhau còn chiếc thứ 10 tự do Noãn cong hình móng ngựa và có chân ngắn [13] Quả đậu nhưng đôi khi không mở mà phân đốt, đứt khúc thành từng đoạn có 1 hạt ở bên trong [14] Trên thế giới có 500 chi, 20.000 loài, phân bố toàn cầu Ở Việt Nam có 90 chi, trên 450 loài 1.1.1.2 Chi Pueraria DC Pueraria DC là chi nhỏ, gồm các loài là dây leo quấn, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á (16 loài); Việt Nam có 5 loài Một số loài có rễ củ, nhiều tinh bột được dùng làm thực phẩm hay làm thuốc; vài loài khác có tác dụng phủ đất, lấy lá làm thức ăn cho gia súc Cá biệt có loài P tuberosa (Roxb Ex Willd) DC mọc ở Nêpan, Pakistan và Ấn Độ, rễ củ có độc, thường dùng để thuốc cá.[10] Spectrum Peak Pick Report 12/21/20 02:58:23 Data Set: Storage 025511 PM- RawData- D:\UV Duoc lieu\nhung\P8'.2.spc 2.000r -, , , -, 1.500 1.000 0.500 250.00 Measurement Properties Wavelength Range (nm.): Scan Speed: Medium Sampling Interval: 0.5 Auto Sampl ing Interval: Scan Mode: Single 350.00 400.00 No P/V 200.00 to 600.00 Wavelength Abs Descriptio! Enabled Sample Preparation Properties Weight: Volume: Dilution: Path Length: Additional Information: Instrument Properti es Instrument Type: UV-1700 Measuring Mode: Absorbance Slit Width: 1.0 nm Light Source Change W a velength: SI R Exchange: Normal Atta chmen t Properties Attachment: None 300.00 nm 340.8 nm Phl.lll.IC 4 Ph6 UV cua P6 Spectrum Peak Pick Report 12121120 02:58:23 PM Data Set: Storage 025511 PM - RawData - D:\UV Duoc lieu\nhung\P8'.2.spc 2.000, , -, . -, 1 500 t 0.500 "' 30000 Measurement Properties Wavelength Range (nm.): 200_00 to 600_00 Scan Speed: Medium Sampling Interval: 0 5 A uto Sampling Interval· Enabled Scan Mode: Single 340_8 nm A ttachment Properties A ttachment: None Page 1 I 1 Phi:J li:JC 5 Ph6 1H NMR cua P6 400.00 No PN Wavelength Abs Descript ion Sample Preparation Properties Weight: Volume: Dilution: Path Length Additional Information: Instrument Properties Instrument Type: UV-1700 Measuring Mode: Absorbance Slit Width: 1.0 nm Light Source Change Wavelength S/R Exchange: Normal 350.00 0 "' co , 0 < Lfl Lfl 00'1 N0\0\, ,I"'""0\0\0\0\000JOOr- 0'1 O\ P6-DMS0-1H 0\I.OLile»\Of""lN , \.DU"' c»r-r-r-r-\D\D\D\D\.D\D\D\0 N NLI'IW CX> r- "t::: O'\.-ir- -ioqo O r- M Cl:lr Nnt l');:t=: "'" "'"' I Oat.a ?a:-a." EXPUO '"'"" 1 PROCtlO F2 - Ac: