2.4.3.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học
Đây là quy trình dùng để xác định nhanh một số nhóm hợp chất thường gặp trong nguyên liệu thực vật bằng các phản ứng hóa học.
Nguyên tắc: Chiết tách hỗn hợp các chất có trong nguyên liệu thực vật thành 3 phân
đoạn theo độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh bằng cách chiết nguyên liệu lần lượt với các dung môi: ether ethylic, ethanol và nước. Sau đó xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng.
Cách tiến hành:
Chiết dịch chiết ether: chiết 25g bột dược liệu bằng diethyl ether, lắc trong một bình nón trong 20 phút. Chiết cho tới khi dịch chiết ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50ml dịch chiết ether.
Chiết dịch chiết cồn: Bã dược liệu được chiết tiếp bằng cồn cao độ (96%) trong bình nón với sinh hàn hồi lưu khoảng 30 phút trên bếp cách thủy, thực hiện 3 lần. Gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50ml dịch chiết cồn. Chiết dịch chiết nước: Bã dược liệu sau khi chiết bằng cồn được đem chiết nóng
với nước trong bình nón trên bếp cách thủy sôi. Gộp các dịch chiết, để nguội, lọc và cô lại để thu được khoảng 50ml dịch chiết nước.
Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng.
2.4.3.2. Chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 96 %. [1]
Ngấm kiệt là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua dược liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hòa tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi / dịch chiết đi từ nơi dược liệu có hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn.
Do quá trình chiết xảy ra theo gradient nồng độ nên quá trình chiết xảy ra triệt để hơn, lượng dung môi sử dụng ít hơn phương pháp ngâm và dược liệu được chiết kiệt hơn.
Cách tiến hành: dược liệu, đã xay thành bột thô 2-4 mm, được làm ẩm trong 30
phút với lượng cồn vừa đủ. Sau đó nạp dược liệu vào bình ngấm kiệt rồi thêm dung môi đến khi dịch chiết chảy ra khoảng vài chục ml thì khoá bình và để ngâm trong 24 giờ. Sau đó tiến hành rút dịch chiết theo các thông số sau:
- Tốc độ rút dịch chiết: 5 ml/ phút - Tỉ lệ (dược liệu : dung môi) = (1: 6)
Kiểm tra sự chiết kiệt bằng phản ứng với FeCl3. Dịch chiết được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, cao thu được dùng để chiết phân bố lỏng – lỏng.
2.4.3.3. Phân tách các phân đoạn
Chiết phân bố lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: diethyl ether, ethyl acetat nhằm mục đích làm giàu các chất có độ phân cực khác nhau và giúp cho việc phân lập các chất tinh khiết ở giai đoạn sau trở nên đơn giản hơn.
2.4.3.4. Phân lập và tinh chế.
Mục đích của giai đoạn này là loại bớt các tạp chất trong cao chiết ban đầu để thu được các cao chiết tinh sạch hơn, các phân đoạn giàu hoạt chất hay các chất tinh khiết phù hợp với mục đích của việc chiết xuất.
Sắc kí cột rây phân tử
Nguyên tắc: Cơ chế rây phân tử là một cơ chế tách, theo đó, những chất có kích
thước phân tử khác nhau sẽ xâm nhập vào pha tĩnh nằm trong các xoang xốp của giá mang ở các mức độ khác nhau, bị giữ tại pha tĩnh với thời gian lưu khác nhau và được rửa giải ra tại các thời điểm khác nhau.
Trong sắc kí rây phân tử, các chất có kích thước phân tử lớn sẽ ra khỏi hệ thống trước, các chất có kích thước phân tử nhỏ hơn sẽ ra sau.
Ngoài cơ chế rây phân tử là cơ chế chủ đạo, chất rây phân tử như Sephadex LH-20 cũng còn kèm theo cơ chế hấp phụ vì trong cấu trúc của các chất rây phân tử này vẫn còn một số nhóm – OH tự do.
Chuẩn bị mẫu: mẫu được hoà tan trong một lượng tối thiểu dung môi thích hợp
(nước nếu là Sephadex G, methanol nếu là Sephadex LH - 20), lượng mẫu nằm trong khoảng 5 – 10% so với lượng gel của cột.
Chuẩn bị cột và triển khai: Các chất sau khi phân lập còn lẫn tạp, tiếp tục dùng sắc
kí rây phân tử để loại tạp. Pha tĩnh là Sephadex LH - 20 được khuấy trong MeOH thành một hỗn dịch đồng nhất và nạp lên cột, mẫu được hoà tan trong một lượng tối thiểu MeOH, rửa cột bằng pha động MeOH.
Trong quá trình sắc kí không cần thiết phải thay đổi hệ dung môi như sắc kí cột hấp phụ và cũng không nên thay đổi tốc độ khai triển cột. Các phân đoạn được chấm sắc kí và kiểm tra bằng hệ dung môi CH3Cl : MeOH : H2O = (7 : 3 : 1) , soi UV 365 nm và UV 254 nm. Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu được các phân đoạn hay chất tinh khiết.
Tinh chế bằng phương pháp rửa
Các chất có thể tinh chế bằng cách rửa cho sạch các tạp chất, dung môi rửa phải hoà tan được tạp và ít hoà tan chất cần phân lập. Rửa bằng dung môi kém phân cực đến phân cực rồi làm khô trong chân không.
2.4.3.5. Xác định độ tinh khiết và cấu trúc các chất phân lập được.
Tiến hành triển khai sắc kí lớp mỏng, đo phổ MS, NMR và các thông số vật lý khác để thông qua đó xác định cấu trúc phân tử.
Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)
Phương pháp đo phổ NMR là một trong những kĩ thuật quan trọng nhất và được dùng rộng rãi cho việc xác định cấu trúc các nhóm hoạt chất. Có các loại phổ NMR cơ bản sau:
Phổ 1H – NMR
- Dấu hiệu nhận biết:
+ Thang chia từ 1 ppm – 12 ppm
+ Tín hiệu dạng vạch + phân đỉnh + có chân + Có số tích phân (1 H, 2 H, 3 H...) bên dưới + Số scan thường nhỏ, đo nhanh (NS 8, 16, 32)
+ Tín hiệu của dung môi đo khó phân biệt. (7.27 s / CDCl3; 2.50 s / DMSO ...)
- Các thông tin có thể thu được từ phổ 1H – NMR là: + Số lượng H của từng tín hiệu
+ Môi trường H quanh H này (sự phân đỉnh)
+ Định hướng của H này ( / β; dựa vào hằng số ghép J)
Phổ 13C – NMR
- Dấu hiệu nhận biết:
+ Thang chia từ 1 ppm – 200 ppm + Thường ở dạng “giải ghép với proton”
+ Tín hiệu dạng vạch (không chẻ đầu, không có chân) + Không có số tích phân (1 C, 2 C, 3 C...) bên dưới + Dễ thấy chùm tín hiệu dung môi đo (thường rất mạnh) - Phổ này cung cấp các thông tin về:
+ Số lượng carbon trong khung: Do thường ở dạng “giải ghép với proton” nên 1 vạch tín hiệu tương ứng với 1 C đương lượng
+ Dạng carbon (>C=O; -COOR; -O-C-O-; >CHn=...) (1 cách tương đối)
Phổ 13C – DEPT-NMR
- Dấu hiệu để nhận biết phổ này: Đây là bộ phổ 13C-NMR (thang đến 200 ppm) và thường chia thành 3 phổ nhỏ (DEPT 90, DEPT 135, CPD)
- Thông tin thu được từ phổ này:
+ DEPT 90: chỉ cho biết các tín hiệu của CH + DEPT 135: cho biết các tín hiệu của CH và CH3
+ C13-CPD: cho biết tất cả các tín hiệu CH3, CH2, CH và C-IV
Phổ HSQC – NMR
Đây là loại phổ tương tác một nối C – H - Dấu hiệu nhận biết:
+ Ô chữ nhật (phổ 13C x phổ 1H) + Số peak tương tác: ≤ 2 (cross peaks) - Thông tin
+ Carbon nào gắn trực tiếp với (các) Hydro nào + C-IV không cho peak tương tác.
+ CH cho 1 peak tương tác duy nhất
+ CH2 cho 2 peak tương tác với 2 proton (thường tương đương nhau) + CH3 cho 1 peak tương tác mạnh với 1 tín hiệu H methyl.
Phổ HMBC – NMR
Là phổ tương tác 2D giữa C và H qua nhiều nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)
- Dấu hiệu nhận biết:
+ Ô chữ nhật (13C x 1H)
+ peak tương tác: n thường ≥ 2, phức tạp.
- Thông tin: H này đối diện C nào (qua 1-4 liên kết). Rất cần khi xác định vị trí nhóm thế, glycosid.
Phổ COSY
Là phổ tương tác giữa 2 hydro lân cận trên khung. - Dấu hiệu nhận biết:
+ Ô vuông (1H x 1H), cross-peak: n thường≤ 2; đơn giản + Đối xứng qua đường phân giác (chéo) rõ
- Thông tin: H này kế cận H nào trên khung (Hn và Hn±1)
Phổ NOESY
Là phổ tương tác giữa 2 hydro gần nhau trong không gian. - Dấu hiệu nhận biết:
+ Ô vuông (1H x 1H), cross-peak: n thường≤ 2; phức tạp. + Đối xứng qua đường phân giác (chéo) rõ.