3.3.3.1. Tách các phân đoạn bằng chiết phân bố lỏng-lỏng Thưc hiện như sau:
Cao cồn toàn phần (cao cồn 1), khoảng 700 g, đem khuấy lần lượt với diethyl ether và ethyl acetat.
- Với diethyl ether, cho 700g cao cồn 1 vào bình thuỷ tinh rồi thêm diethyl ether với tỉ lệ DE : cao (1 lít : 700g), khuấy trong 30 phút ở tốc độ 8. Sau đó chuyển dịch chiết sang bình lắng gạn, đợi 2 chất lỏng phân lớp thì lấy lớp ether ở phía trên để riêng, phần dịch chiết cồn ở dưới chuyển sang bình thuỷ tinh tiếp tục chiết với ether thêm 2 lần nữa. Gộp các dịch chiết ether lại rồi loại dung môi đến cắn khô, thu cao DE (45g).
- Với ethyl acetat, lấy phần bã dược liệu sau khi đã chiết với diethyl ether thêm nước cất (tỉ lệ 1 : 2), khuấy đều. Tiếp tục khuấy với ethyl acetat theo tỉ lệ 1: 2 trong 30 phút. Sau đó chuyển dịch chiết sang bình lắng gạn, đợi 2 chất lỏng phân lớp thì gạn lấy lớp ethyl acetat ở trên để riêng. Chiết lặp lại 2 lần nữa và gộp tất cả các dịch ethyl acetat vào trong bình thuỷ tinh. Dịch ethyl acetat được đem cô đặc dưới áp suất giảm thu được cao EA (76 g).
Sơ đồ 3.2. T
Cao cồn
(700g)
đoạn bằng chiết phân bố lỏng - lỏng
Chiết với DE x 3 lần (1 lít : 700g cao)
Dịch DE Bã dược liệu
Cô quay + Nước (350ml : 700g cao)
Kiểm tra các ng SKLM, phát hiện b , nm.
Cao DE (45g) Dịch nước Chiết với EA x 3 lần (1 : 2) Dịch EA Cô Cao EA (76g) ách các phân
Hình 3. 9. Kiểm tra kết quả phân bố lỏng - lỏng. Hệ CHCl3 : MeOH : H2O (7:3:1)
Nhận xét: Như vậy từ cao cồn ban đầu gồm nhiều thành phần phức tạp (các thành
phần có độ phân cực khác nhau nhiều) qua lắc phân bố lỏng - lỏng đã thu được các phân đoạn có thành phần đơn giản hơn, thuận lợi hơn cho việc tách chiết các chất sau này. Các phân đoạn này sẽ được tinh chế thêm bằng cách rửa với cồn 96%. 3.3.3.2. Phân lập - tinh chế các chất từ cao diethyl ether
Cao DE (45g) thu được từ lắc phân bố lỏng – lỏng để vài ngày thấy có xuất hiện tủa (tủa A). Dùng cồn 96% rửa đi rửa lại nhiều lần, thu tủa A và dịch cồn B. Tiếp tục xử lý tủa này như sau: cho MeOH vào và đánh bằng sóng siêu âm cho tan hoàn toàn. Đợi một thời gian thấy xuất hiện tủa vàng, nhớt và đóng lại thành một khối. Tách riêng phần tủa vàng này ra. Phần dịch tiếp tục đun hồi lưu khoảng 15 phút, để nguội, thu tủa trắng. Lấy riêng tủa trắng này ra, hoà tan với hỗn hợp DCM : MeOH (1:2), đợi một thời gian, thấy xuất hiện kết tinh trắng. Lọc kết tinh bằng phễu thuỷ tinh xốp, thu P1 (0,96g).
Phần dịch cồn B đem cô quay để loại bớt dung môi, khi cô quay thấy xuất hiện tủa, ngừng cô quay và tiến hành dùng cồn 96% để rửa tủa này, thu tủa có màu hồng (1,52g) và dịch cồn. Sau đó, phần tủa hồng tiếp tục đun hồi lưu bằng MeOH rồi để nguội, đợi kết tinh, thu P2 (0,75g).
Cao DE
Rửa nhiều lần bằng cồn 96%
Tủa A Dịch cồn B
+ MeOH, siêu âm Cô quay
Tủa vàng Tủa trắng Tủa thô
Rửa nhiều lần + DCM : Me (1:2), đun,
để nguội. Chờ kết tinh
bằng cồn 96%
P1 (0,96g) hồngTủa Dịch cồn
+ MeOH, đun, để nguội. Chờ kết tinh
P2 (0,75g)
Sơ đồ 3.3 Phân lập các chất từ cao diethyl ether.
Kiểm tra các chất phân lập được từ cao diethyl ether bằng SKLM, phát hiện bằng cách soi UV 254 nm, UV 365 nm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3. 10 Kiểm tra các phân đoạn từ cao DE. Hệ CHCl3 : MeOH : H2O (7:3:1)
Nhận xét: Dùng phương pháp rửa giúp thu được các chất chính của Sắn dây mà
không cần phải qua cột, tiết kiệm dung môi và thời gian thực hiện. Tuy nhiên P1, P2 vẫn chưa tinh khiết (còn 2 vết trên sắc đồ).
3.3.3.3. Phân lập các chất từ cao ethyl acetate
Tương tự như đối với cao DE, cao ethyl acetat để vài ngày cũng thấy có một lượng tủa khá lớn (Tủa C). Lọc và dùng cồn 96% rửa tủa nhiều lần cho sạch. Thu tủa C và dịch cồn.
Tủa C được hoà với 100 ml MeOH, đun hồi lưu cho đến khi thấy tan hoàn toàn thì ngưng. Để nguội thu tủa D (4,04 g) và dịch lọc MeOH.
- Cho vào bình cầu tủa D và 250 ml MeOH, đun hồi lưu cho tan hoàn toàn, để nguội xuất hiện kết tinh P3 (0,21g) và dịch lọc MeOH (3’).
- Phần dịch lọc MeOH để vài ngày, thấy xuất hiện kết tinh P4 (0,52g). Lấy riêng kết tinh này ra. Còn lại phần dịch lọc MeOH (4’).
Gộp chung dịch lọc MeOH (3’) và (4’) vào bình nón, cho vào một ít than hoạt, đun hồi lưu 15 phút, lọc. Để nguội, sau vài ngày thấy có kết tinh P5 (1,75g).
Kết quả của quá trình này được mô tả theo sơ đồ 3.4. dưới đây: Cao EA
Rửa nhiều lần bằng cồn 96%
Tủa C Dịch cồn
+ 100 ml MeOH, đun hồi lưu
+ 250 ml MeOH, đun hồi lưu, đợi kết tinh
Tủa D Dịch lọc MeOH Để vài ngày P3 (0,21g) lọc 3’Dịch lọc 4’Dịch P4 (0,52g) P5 (1,75g)
+ Than hoạt, đun hồi lưu. Lọc. Đợi kết tinh
Sơ đồ 3.4 Phân lập các chất từ cao ethyl acetat.
Kiểm tra các chất phân lập được từ cao ethyl acetat bằng SKLM, , phát hiện bằng cách soi UV 254 nm, UV 365 nm
Hình 3. 11 Kiểm tra các phân đoạn từ cao EA. Hệ CHCl3 : MeOH : H2O (7:3:1)
Nhận xét: Các chất thu được khá sạch: P3 còn lẫn một vết, P4 còn 3 vết, P5 còn 2
vết. Bằng nhận xét cảm quan thì thấy P5 khá trắng, sạch. Dự định cho mẫu này qua cột Sephadex để thu được kết tinh tinh khiết hơn.
Như vậy, chỉ bằng phương pháp rửa cồn 96% và kết tinh lại mà các chất thu được có độ tinh sạch khá cao (P1, P2, P3, P4 và P5).
Tóm lại, các chất sau đã được phân lập:
P1: 0,96g P2: 0,75g P3: 0,21g P4: 0,52g P5: 1,75g