3.3.1. Định tính sơ bộ thành phần hoá học
Cân 25 g bột dược liệu tiến hành định tính sơ bộ thành phần hoá học, nhằm xác định các nhóm hoạt chất có trong rễ củ Sắn dây. Kết quả thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3. 3. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hoá học rễ củ Sắn dây.
Thành phần Tinh dầu Chất béo Carotenoid Triterpenoid Coumarin Alkaloid Anthraquinon Flavonoid Saponin Tanin Các chất khử Các acid hữu cơ Hợp chất polyuronic
Ghi chú: (−) : không có (+) : có ít
Kết quả phân tích sơ bộ cho thấy dược liệu chứa flavonoid, chất béo, tanin và hợp chất polyuronic.
3.3.2. Chiết xuất bằng ngấm kiệt với cồn 96%.
Củ Sắn dây sau khi xắt thành lát mỏng, đem phơi khô, xay nhỏ. Cân 10 kg bột dược liệu đem làm ẩm với cồn 96%, sau đó nạp lên bình chiết cùng với 60 lít dung môi theo tỉ lệ (bột dược liệu : cồn 96%) = (1 : 6). Ngâm qua đêm rồi thu dịch chiết. Sau đó, tiến hành cô quay, thu 700 gam cao đặc (Cao cồn 1).
Kết quả của quá trình chiết được thể hiện trên sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết: Bột dược liệu (10kg) Ngấm kiệt với cồn 96% Dịch chiết cồn Cô quay Cao cồn 1 (700g)
Kiểm tra cao cồn bằng SKLM, phát hiện bằng cách soi UV 254 nm, UV 365 nm.
(1) (2) (3)
Hình 3. 8. Kiểm tra cao cồn bằng SKLM.
(1) : Hệ dung môi CHCl3 : MeOH : H2O (7 : 3 : 1) (2) : Hệ dung môi EA : MeOH (85 : 15)
(3) : Hệ dung môi DCM : MeOH (5 : 1)
Nhận xét: 3 hệ dung môi dùng để kiểm tra cao cồn 1 trên SKLM có độ phân cực
khác nhau. Nhận thấy hệ DCM : MeOH tách vết gọn, đẹp nhưng lại không đầy đủ các vết bằng hệ CHCl3 : MeOH : H2O, do đó chọn hệ CHCl3 : MeOH : H2O trong SKLM để kiểm tra các chất ở các phân đoạn.
3.3.3. Phân tách các phân đoạn và phân lập các chất
3.3.3.1. Tách các phân đoạn bằng chiết phân bố lỏng-lỏng Thưc hiện như sau:
Cao cồn toàn phần (cao cồn 1), khoảng 700 g, đem khuấy lần lượt với diethyl ether và ethyl acetat.
- Với diethyl ether, cho 700g cao cồn 1 vào bình thuỷ tinh rồi thêm diethyl ether với tỉ lệ DE : cao (1 lít : 700g), khuấy trong 30 phút ở tốc độ 8. Sau đó chuyển dịch chiết sang bình lắng gạn, đợi 2 chất lỏng phân lớp thì lấy lớp ether ở phía trên để riêng, phần dịch chiết cồn ở dưới chuyển sang bình thuỷ tinh tiếp tục chiết với ether thêm 2 lần nữa. Gộp các dịch chiết ether lại rồi loại dung môi đến cắn khô, thu cao DE (45g).
- Với ethyl acetat, lấy phần bã dược liệu sau khi đã chiết với diethyl ether thêm nước cất (tỉ lệ 1 : 2), khuấy đều. Tiếp tục khuấy với ethyl acetat theo tỉ lệ 1: 2 trong 30 phút. Sau đó chuyển dịch chiết sang bình lắng gạn, đợi 2 chất lỏng phân lớp thì gạn lấy lớp ethyl acetat ở trên để riêng. Chiết lặp lại 2 lần nữa và gộp tất cả các dịch ethyl acetat vào trong bình thuỷ tinh. Dịch ethyl acetat được đem cô đặc dưới áp suất giảm thu được cao EA (76 g).
Sơ đồ 3.2. T
Cao cồn
(700g)
đoạn bằng chiết phân bố lỏng - lỏng
Chiết với DE x 3 lần (1 lít : 700g cao)
Dịch DE Bã dược liệu
Cô quay + Nước (350ml : 700g cao)
Kiểm tra các ng SKLM, phát hiện b , nm.
Cao DE (45g) Dịch nước Chiết với EA x 3 lần (1 : 2) Dịch EA Cô Cao EA (76g) ách các phân
Hình 3. 9. Kiểm tra kết quả phân bố lỏng - lỏng. Hệ CHCl3 : MeOH : H2O (7:3:1) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét: Như vậy từ cao cồn ban đầu gồm nhiều thành phần phức tạp (các thành
phần có độ phân cực khác nhau nhiều) qua lắc phân bố lỏng - lỏng đã thu được các phân đoạn có thành phần đơn giản hơn, thuận lợi hơn cho việc tách chiết các chất sau này. Các phân đoạn này sẽ được tinh chế thêm bằng cách rửa với cồn 96%. 3.3.3.2. Phân lập - tinh chế các chất từ cao diethyl ether
Cao DE (45g) thu được từ lắc phân bố lỏng – lỏng để vài ngày thấy có xuất hiện tủa (tủa A). Dùng cồn 96% rửa đi rửa lại nhiều lần, thu tủa A và dịch cồn B. Tiếp tục xử lý tủa này như sau: cho MeOH vào và đánh bằng sóng siêu âm cho tan hoàn toàn. Đợi một thời gian thấy xuất hiện tủa vàng, nhớt và đóng lại thành một khối. Tách riêng phần tủa vàng này ra. Phần dịch tiếp tục đun hồi lưu khoảng 15 phút, để nguội, thu tủa trắng. Lấy riêng tủa trắng này ra, hoà tan với hỗn hợp DCM : MeOH (1:2), đợi một thời gian, thấy xuất hiện kết tinh trắng. Lọc kết tinh bằng phễu thuỷ tinh xốp, thu P1 (0,96g).
Phần dịch cồn B đem cô quay để loại bớt dung môi, khi cô quay thấy xuất hiện tủa, ngừng cô quay và tiến hành dùng cồn 96% để rửa tủa này, thu tủa có màu hồng (1,52g) và dịch cồn. Sau đó, phần tủa hồng tiếp tục đun hồi lưu bằng MeOH rồi để nguội, đợi kết tinh, thu P2 (0,75g).
Cao DE
Rửa nhiều lần bằng cồn 96%
Tủa A Dịch cồn B
+ MeOH, siêu âm Cô quay
Tủa vàng Tủa trắng Tủa thô
Rửa nhiều lần + DCM : Me (1:2), đun,
để nguội. Chờ kết tinh
bằng cồn 96%
P1 (0,96g) hồngTủa Dịch cồn
+ MeOH, đun, để nguội. Chờ kết tinh
P2 (0,75g)
Sơ đồ 3.3 Phân lập các chất từ cao diethyl ether.
Kiểm tra các chất phân lập được từ cao diethyl ether bằng SKLM, phát hiện bằng cách soi UV 254 nm, UV 365 nm
Hình 3. 10 Kiểm tra các phân đoạn từ cao DE. Hệ CHCl3 : MeOH : H2O (7:3:1)
Nhận xét: Dùng phương pháp rửa giúp thu được các chất chính của Sắn dây mà
không cần phải qua cột, tiết kiệm dung môi và thời gian thực hiện. Tuy nhiên P1, P2 vẫn chưa tinh khiết (còn 2 vết trên sắc đồ).
3.3.3.3. Phân lập các chất từ cao ethyl acetate
Tương tự như đối với cao DE, cao ethyl acetat để vài ngày cũng thấy có một lượng tủa khá lớn (Tủa C). Lọc và dùng cồn 96% rửa tủa nhiều lần cho sạch. Thu tủa C và dịch cồn.
Tủa C được hoà với 100 ml MeOH, đun hồi lưu cho đến khi thấy tan hoàn toàn thì ngưng. Để nguội thu tủa D (4,04 g) và dịch lọc MeOH.
- Cho vào bình cầu tủa D và 250 ml MeOH, đun hồi lưu cho tan hoàn toàn, để nguội xuất hiện kết tinh P3 (0,21g) và dịch lọc MeOH (3’).
- Phần dịch lọc MeOH để vài ngày, thấy xuất hiện kết tinh P4 (0,52g). Lấy riêng kết tinh này ra. Còn lại phần dịch lọc MeOH (4’).
Gộp chung dịch lọc MeOH (3’) và (4’) vào bình nón, cho vào một ít than hoạt, đun hồi lưu 15 phút, lọc. Để nguội, sau vài ngày thấy có kết tinh P5 (1,75g).
Kết quả của quá trình này được mô tả theo sơ đồ 3.4. dưới đây: Cao EA
Rửa nhiều lần bằng cồn 96%
Tủa C Dịch cồn
+ 100 ml MeOH, đun hồi lưu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ 250 ml MeOH, đun hồi lưu, đợi kết tinh
Tủa D Dịch lọc MeOH Để vài ngày P3 (0,21g) lọc 3’Dịch lọc 4’Dịch P4 (0,52g) P5 (1,75g)
+ Than hoạt, đun hồi lưu. Lọc. Đợi kết tinh
Sơ đồ 3.4 Phân lập các chất từ cao ethyl acetat.
Kiểm tra các chất phân lập được từ cao ethyl acetat bằng SKLM, , phát hiện bằng cách soi UV 254 nm, UV 365 nm
Hình 3. 11 Kiểm tra các phân đoạn từ cao EA. Hệ CHCl3 : MeOH : H2O (7:3:1)
Nhận xét: Các chất thu được khá sạch: P3 còn lẫn một vết, P4 còn 3 vết, P5 còn 2
vết. Bằng nhận xét cảm quan thì thấy P5 khá trắng, sạch. Dự định cho mẫu này qua cột Sephadex để thu được kết tinh tinh khiết hơn.
Như vậy, chỉ bằng phương pháp rửa cồn 96% và kết tinh lại mà các chất thu được có độ tinh sạch khá cao (P1, P2, P3, P4 và P5).
Tóm lại, các chất sau đã được phân lập:
P1: 0,96g P2: 0,75g P3: 0,21g P4: 0,52g P5: 1,75g
3.3.4. Kiểm tra các chất phân lập được từ các cao chiết
Hình 3. 12 Sắc đồ kiểm tra các chất phân lập. Hệ CHCl3 : MeOH : H2O
(7:3:1)
Hình 3. 13 Sắc đồ kiểm tra các chất phân lập. Hệ EA : MeOH (85 : 15)
Nhận xét: Kết quả cho thấy cả 5 chất phân lập được đều có màu sắc và Rf trùng với
nhau trên cả 2 hệ dung môi khác nhau. 3.3.4.2. So sánh phổ UV
Các mẫu đo được hoà tan trong MeOH với nồng độ thích hợp. Đem quét phổ hấp thu UV từ bước sóng 200 - 600 nm. Kết quả được ghi nhận trong bảng 3.4
Bảng 3. 4 So sánh λmax của P1, P2, P3, P4 và P5 Chất đo λmax P1 248,5 301 P2 249 301 P3 248 365 P4 248 300,5 P5 248,5 301 Phổ UV của P1
Hình 3. 14 Phổ UV của P1
Phổ UV của P2
Hình 3. 15 Phổ UV của P2
Hình 3. 16 Phổ UV của P3
Phổ UV của P4
Hình 3. 17 Phổ UV của P4
Hình 3. 18 Phổ UV của P5
Kết quả cho thấy P1, P2, P4, P5 đều có λmax và hình dạng phổ UV gần giống nhau. Riêng P3 có dạng phổ không giống hoàn toàn.
Nhận xét chung: Kết quả so sánh bằng SKLM và phổ UV cho thấy cả 5 chất phân
lập được đều giống nhau. P5 chiếm một lượng nhiều hơn hẳn so với các chất khác (1,75g). Do đó P5 được dùng để tiếp tục tinh khiết hoá bằng sắc ký rây phân tử. 3.3.4.3. Tinh khiết hoá P5 bằng sắc kí rây phân tử
Điều kiện chạy sắc kí: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cột sắc kí: thuỷ tinh: 120 x 2,5 cm - Pha tĩnh: Sephadex LH-20
- Pha động: MeOH
- Thể tích hứng: 5 ml - Tốc độ: 2 ml/phút
Các phân đoạn được kiểm tra trên SKLM với hệ dung môi CHCl3 : MeOH : H2O (7:3:1), phát hiện bằng cách soi UV 254 nm, UV 365 nm. Kết quả thể hiện ở hình 3.19
Hình 3. 19 Sắc kí đồ tinh chế P5 qua cột rây phân tử.
Kết quả thu được P6 chủ yếu ở phân đoạn 26 – 35 và tương đối sạch, gộp các phân đoạn này lại, cô bớt dung môi dưới áp suất giảm, để kết tinh, lọc lấy tinh thể P6, làm khô trong tủ sấy chân không, thu được (104,5mg). Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của P6 bằng SKLM được thể hiện ở hình 3.20.
Kiểm tra bằng SKLM, , phát hiện bằng cách soi UV 254 nm, UV 365 nm.
Hình 3. 20 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của P6
Nhận xét: Kết quả trên 2 hệ dung môi khác nhau, P6 chỉ cho 1 vết trên sắc ký đồ.
3.3.5. Xác định cấu trúc hóa học của P6
3.3.5.1 So sánh phổ UV
Bảng 3. 5 Bảng so sánh λmax của P6 với λmax của daidzein. Chất đo
Daidzein
P6
Nhận xét: Kết quả cho thấy giá trị λmax của P6 và daidzein gần như trùng lắp.
3.3.5.2. So sánh phổ MS Điều kiện chạy:
Máy QuattromicroTM API Waters
- Tốc độ dòng: 15 µl/phút - Điện áp mao quản: 3,2 (kV) - Mode đo: ESI-MS - Điện áp của cone: 50,30 (V) - Mass range: 100-1000 (m/z) - Điện áp của extractor: 2 (V) - Nhiệt độ nguồn: 100 oC - RF lens: 0.2
- Nhiệt độ de-sovat hóa: 150 oC
Kết quả đo được so sánh với số khối của daidzein trong tài liệu [27]
Bảng 3. 6 So sánh số khối của P6 với daidzein
Chất đo
Daidzein
3.3.5.3. So sánh phổ NMR
Phổ NMR của P6 được đo theo điều kiện ở chương “ Đối tượng và phương pháp
nghiên cứu”. Kết quả đo được ghi nhận như sau:
1H-NMR, (500 MHz, DMSO, ppm): 6,80 (2H, d, H-3’); 6,86 (1H, d, H-8); 6,93 (1H, dd, H-6); 7,37 (2H, d, H-2’); 7,96 (1H, d, H-5); 8,29 (1H, s, H-2); 9,55 (1H, s, 4’- OH); 10,70 (1H, s, 7-OH). 13C-NMR, (125 MHz, DMSO, ppm): 174,6 (C-4); 162,5 (C-7); 157,4 (C-4’); 157,1 (C-9); 152,8 (C-2); 130,0 (C-2’, C-6’); 127,3 (C-5); 123,5 (C-3); 122,5 (C- 1’); 116,6 (C-10); 115,1 (C-6); 114,93 (C-3’, C-5’); 102,0 (C-8).
Các tín hiệu phổ 13C-NMR cho thấy P6 có 15 carbon bao gồm 7 carbon tứ cấp và 8 carbon tam cấp. Trong số những carbon này, 2 carbon C-2’ và C-6’ở vị trí đối xứng, cộng hưởng ở 130,0 ppm; 2 carbon C-3’ và C-5’cũng đối xứng, cộng hưởng ở 114,9
ppm. Những tín hiệu khác nằm trong khoảng 114,9 – 162,5 ppm thuộc về carbon sp2
của nhân thơm. Tín hiệu ở 174,6 ppm thuộc carbon carbonyl ở C-4. Phổ 1H-NMR của P6 cũng cho thấy có sự hiện diện của 2 proton của nhóm OH ở 9,55 và 10,7 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ppm, các proton còn lại cộng hưởng ở 6,80-8,29 ppm, một đặc điểm của các proton gắn với carbon sp2.
Dựa vào các dữ liệu phổ của P6 và so sánh những dữ liệu này với các dữ liệu đã được công bố của daidzein, cấu trúc của P6 được xác định là daidzein, một trong những isoflavonoid chính của rễ củ Sắn dây (Bảng 3.7 và Hình 3.23).
Bảng 3. 7 Dữ liệu phổ
13
C-NMR của P6 so sánh với daidzein trong tài liệu [31] Carbon 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 4’-OH 7- OH 1 8 HO 9 O 7 6 4 10 5 O 2 3 1' 2' 3' 4' 6' OH 5'
3.4. Thử tác dụng chống oxy hoá in vitro trên mô hình DPPH3.4.1. Chiết xuất cao dược liệu cho thử nghiệm in vitro 3.4.1. Chiết xuất cao dược liệu cho thử nghiệm in vitro
Mục đích nhằm kiểm tra xem bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau thì cao thu được có khả năng oxy hoá ở mức nào.
Các bước thực hiện:
Cho vào 3 erlen 250 ml, mỗi erlen 10g bột dược liệu và 50ml các dung môi lần lượt là dichloromethan, ethyl acetat, nước.
Tiến hành chiết nóng 3 lần. Lọc qua giấy lọc, cô thu hồi dung môi của các dịch chiết, thu được các cao tương ứng: cao DCM, cao EA 2 và cao nước. Các cao này sẽ được đem thử trên mô hình DPPH.
Hàm lượng của các cao chiết tiến hành trong thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình DPPH được thể hiện ở bảng 3.8
Bảng 3.8 Hàm lượng các cao chiết (%) với các hệ dung môi khác nhau
Lượng dược liệu
10 g
3.4.2. Kết quả thử tác dụng chống oxy hoá của các cao chiết, các phân đoạn chiết và các chất phân lập được chiết và các chất phân lập được
Nồng độ mẫu thử: mẫu thử được hòa trong MeOH ở nồng độ 1mg/ml.
Nồng độ chất đối chứng (vitamin C): 1mg /ml hòa trong MeOH.
Mẫu được đo 3 lần lấy kết quả trung bình. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.9 và 3.10
Bảng 3. 9 Độ hấp thu của các cao chiết tại λ = 517nm trên mô hình DPPH. Mẫu DPPH Abs Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB AO (%)
Bảng 3. 10 Độ hấp thu của các chất phân lập tại λ = 517nm trên mô hình DPPH. Mẫu Abs Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB AO (%) 56,51
Nh
ậ n xét: Kết quả trên cho thấy khả năng chống oxy hoá của các phân đoạn và của
các chất phân lập từ Sắn dây đều đạt từ mức trung bình trở lên ( 50,37-74,5%) khi so với chất đối chiếu là vitamin C. Trong đó, cao DE có khả năng chống oxy hoá cao nhất (AO = 74,52%) và thấp nhất là P3 (AO = 50,37%). Nói chung tất cả các mẫu thử đều không chênh lệch nhau nhiều về AO (Biểu đồ 3.1)
Biểu đồ 3.1 Kết quả hoạt tính chống oxy hoá các phân đoạn trên mô hình DPPH
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
1. Về mặt thực vật học, chúng tôi đã thu thập mẫu, mô tả và khảo sát đặc điểm vi học của rễ và bột củ Sắn dây ở Việt Nam.
2. Đã xác định độ tinh khiết của dược liệu bao gồm độ ẩm và độ tro. Kết quả cho thấy độ ẩm là 10,32%, độ tro toàn phần là 4,69% và độ tro không tan trong acid là 0,84%.
3. Về chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các isoflavononoid trong Sắn dây: - Đã thăm dò và chọn lựa phương pháp chiết các thành phần của Sắn dây bằng
phương pháp ngấm kiệt với cồn 96% kết hợp phân bố lỏng – lỏng để chiết các thành phần phân cực và kém phân cực khác, tạo thuận lợi cho quá trình phân lập các chất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đã khảo sát được phương pháp tinh chế bằng cách rửa kết tinh với cồn 96%.