khảo sát thành phần hóa học của cao ethyl acetate cây bảy lá một hoa paris polyphylla sm

Theo thời gian, cùng với sự phát triền của khoa học, kĩ thuật, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về các loài thực vật, các cây thuốc ra đời nhằm bổ sung và phục vụ cho việc tìm hiểu

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA

Thành ph ố Hồ Chí Minh 2013

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 3

Chương 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Phân loại 5

1.2 Cây bảy lá một hoa 5

1.2.1 Khái quát 5

1.2.2 Mô tả thực vật 6

1.3 Phân bố và sinh thái 6

1.4 Các nghiên cứu về cây bảy lá một hoa 7

1.5 Tác dụng dược lý 21

1.6 Tính vị, công năng 22

Chương 2 THỰC NGHIỆM 24

2.1 Nguyên liệu 24

2.2 Điều kiện thực nghiệm 24

2.2.1 Hóa chất 24

2.2.2 Trang thiết bị 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Chiết xuất 25

2.3.2 Lắc phân đoạn 25

2.3.3 Sắc kí cột silica gel pha thuận 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Kết quả quá trình chiết 28

3.2 Kết quả lắc phân đoạn 28

3.3 Kết quả cô lập 30

3.4 Biện giải cấu trúc hợp chất thu được 31

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

4.1 Kết luận 36

4.2 Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 37 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 37

LỜI MỞ ĐẦU

Nước ta được thiên nhiên ưu ái ban tặng cho thảm thực vật phong phú, trong đó có rất nhiều loài cây có khả năng chữa nhiều loại bệnh Theo thống kê chưa đầy đủ của Viện Dược liệu (Bộ Y tế) cho thấy, hiện nước ta có khoảng 3.800 loài thực vật có thể làm thuốc Trong đó có những loại quý mà nền y học thế giới rất cần như: hoàng liên, lan kim tuyến, thạch tùng răng cưa, sâm ngọc linh, thất diệp nhất chi hoa,

Từ xưa, dân gian đã biết dùng các loại cây cỏ kết hợp với nhau để chữa bệnh Theo thời gian, cùng với sự phát triền của khoa học, kĩ thuật, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về các loài thực vật, các cây thuốc ra đời nhằm bổ sung và phục vụ cho việc tìm hiểu nghiên cứu các cây thuốc, bên cạnh đó các nhà nghiên cứu dược liệu đã tạo ra các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên có lợi và an toàn cho sức khỏe con người, chữa được một số bệnh

Cây bảy lá một hoa hay còn gọi là thất diệp nhất chi hoa là một loại thảo dược đang nhận được rất nhiều sự quan tâm Kết quả nghiên cứu hiện đại cho thấy cây bảy lá một hoa có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn như trực khuẩn lỵ, trực khuẩn coli, liên cầu khuẩn, ; kháng virut cúm; chống co thắt, trừ đờm và giảm ho; trấn tĩnh giảm đau; chống viêm và cầm máu; làm giảm mỡ máu; và đặc biệt là có tác dụng ức chế trực tiếp sự phát triển của tế bào ung thư Nhiều nghiên cứu của các tác giả Trung Quốc cho thấy, dịch chiết thất diệp nhất chi hoa đã góp phần kéo dài thời gian sống của những bệnh nhân bị ung thư dạ dày và ung thư phổi

Tuy nhiên, cây thuốc này còn chưa được nhiều người biết đến và cũng chưa được di thực và trồng hái nhiều ở nước ta Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học cũng như nghiên cứu tác dụng dược lý của loài cây này tại Việt Nam còn rất hiếm Bên cạnh đó, việc khai thác bừa bãi hiện nay của người dân cũng đang làm nguy hại đến nguồn dược liệu quý hiếm này

Vì những lí do trên , chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “ Khảo sát

thành phần hóa học của cao ethyl acetate cây bảy lá một hoa Paris

Polyphylla Sm.” với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào việc tìm hiểu thành

phần hóa học của loài cây này

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Phân lo ại [4]

Theo trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, cây bảy lá một hoa có vị trí phân loại như sau:

- Tên khoa học: Paris polyphylla Sm

- Tên đồng nghĩa: Daiswa polyphylla (Smith) Raf

- Thuộc chi Paris, họ Hành tỏi (Liliaceae)

- Tên khác: Thất diệp nhất chi hoa, tảo hưu, độc cước liên, thiết đăng đài, thảo hà sa, cúa dô (H’Mông)

- Tên nước ngoài: Parisette, Herbe – Paris (Pháp)

Hình 1.1: Cây bảy lá một hoa Hình 1.2: Thân rễ bảy lá một hoa

1.2.2 Mô tả thực vật [3]

Bảy lá một hoa là loại cây thảo, sống lâu năm, cao 0,5 – 0,7m Thân rễ mập, chia nhiều đốt, có những ngấn ngang và sẹo to Thân thẳng đứng, cao đến 1m, không phân nhánh, màu lục hoặc hơi tím, giữa thân có một tầng lá mọc vòng từ 6-

8 cái, thường là 7, lá hình trứng – bầu dục hoặc mác thuôn, dài 15 – 20cm, rộng 8 – 10cm, gốc tròn hoặc hình tim, đầu nhọn, mép nguyên, mặt dưới màu lục nhạt hoặc hơi tím đỏ; có 3 gân; cuống lá dài

Hoa mọc đơn độc ở ngọn thân, cách tầng lá khoảng 15 – 30cm; lá đài hình mác màu lục; rời từng cái một trông như lá; cánh tràng hình sợi màu vàng; bằng hơi ngắn hơn lá đài, nhị nhiều; mảnh, có bao phấn màu vàng nâu, bầu màu tím đỏ

có 3 ngăn Quả mọng, màu tím đen, hạt to màu vàng

Mùa hoa vào tháng 3 – 7, mùa quả: tháng 8 – 12

1.3 Phân bố và sinh thái [3]

Loài bảy lá một hoa, có tên khoa học là Paris polyphylla Sm., thực ra rất

hiếm gặp ở Việt Nam Các điểm đã thu được mẫu vật gồm có Mộc Châu ( Sơn La), Đồng Văn (Hà Giang), và một số điểm phân bố khác Trên thế giới, cây phân bố ở Trung Quốc (bao gồm An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Hà Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tô, Giang Tây, Tứ Xuyên ), Ấn Độ, Nê Pan và Myanma

Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều mùn Phần thân trên mặt đất lụi hàng năm vào cuối mùa thu Thân rễ mang 1 -2 chồi ngủ tồn tại qua đông và mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau Trong tự nhiên, thường chỉ

có những cây lớn với chiều dài thân rễ trên 5 cm mới thấy có hoa quả

O O

O O O

O

CH2OH RO

OH OH

HO HOH C

Bảy lá một hoa là cây thích nơi có khí hậu ẩm mát, ít gió, nhưng không chịu úng Cây chưa được trồng trên quy mô lớn mà chỉ ở phạm vi các vườn cây thuốc ở một số địa phương

Cây được nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân rễ Hằng năm, vào tháng 10 -11, thu lấy quả chín đem gieo trong vườn ươm hoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới gieo Mỗi cây chỉ có một hoa, mỗi hoa chỉ có ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao Thân rễ bảy lá một hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thế tách ra từng đoạn để trồng Thời vụ trồng chủ yếu là mùa xuân và mùa thu

Mùa thu hoạch thường vào tháng 6 -7 Khi thu, đào thân rễ rửa sạch, để nguyên đem phơi hoặc thái mỏng rồi phơi khô đều được

Bảy lá một hoa và những loài khác cùng chi là những cây thuốc thuộc diện quý hiếm ở Việt Nam Do nạn phá rừng làm thu hẹp môi trường sống, gần đây lại

bị thu gom bán qua biên giới, nguy cơ tuyệt chủng của chúng càng thêm gay gắt Bảo tồn các loài Bảy lá một hoa đang là một yêu cầu cấp thiết

1.4 Các nghiên c ứu về cây bảy lá một hoa

Trên thế giới

Năm 1982, Sheo B.Singh và cộng sự đã cô lập được 4 hợp chất spirostanol

saponin gồm Polyphyllin C (1), D (2), E (3) và F (4) [12]

Polyphyllin C (1): R = H

O O Me

O O

O O

Me O

O

OH OH

OH

Me

O

OH OH OH

CH 2 OH O

Polyphyllin D (2): R =

Polyphyllin E (3): R =

Năm 2002, Hisashi Matsuda và cộng sự đã phân lập được 4 loại

spirostanol saponin steroid gồm pennogenin

rhamnopyranosyl(1→2)-[α-L-arabinofuranosyl(1→4)]-β-D-glucopyranoside (5), pennogenin

O OH

OH HO

O

CH3HO

OH OH

O

CH3HO

OH OH

H

CH3

OH OH HO

O O

H

HO

OH

O HO

CH3O

O

O HO

OH HO

OH H

O OH

O O

OH HO

OH

H H

O

O OH

O

OH HO

O

CH3HO

OH OH

O O

H

HO

O

O HO

CH3

OH OH H

O HO O

H

OH

HO OHHO

O

O HO

OH HO

OH H

O OH

O O

H

HO

OH

O HO

CH3

OH OH H

O HO

O

O HO

OH HO

OH H

O OH

Năm 2007, Xiu-feng Zhang và cộng sự đã phân lập được ba loại saponin

diosgenyl từ Paris polyphylla và khảo sát ảnh hưởng của 3 loại saponin này đến hệ

miễn dịch kích thích liên quan đến thực bào, hệ hô hấp và việc sản xuất nitric oxide trong tế bào bạch cầu của chuột Nhóm tác giả đã phân lập được ba loại

saponin diosgenyl là: diosgenin (12), diosgenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-

α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-[ α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]

-β-D-glucopyranoside (8), và diosgenin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)- α-L-arabino

furanosyl- β-D-glucopyranoside (13) [15]

O O

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

19 1112 13 14

18 17

15 16 20 21

22 23 24

27

Trigofoenoside A (10)

Protogracillin (11)

O O

O

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

19 1112 13 14

18 17

15 16 20 21

22 23 24

O H

OH H

H H

O HO

H

HO

H H

CH3

HO H

H

HO O

27

O

H H

O

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

12 13 14

18 17

15 16 20 21

22 23 24

27

O OH

HO O O

O

OH O

O OH

HO

O O

HO

HO OH

O

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

19 1112 13 14

18 17

15 16 20 21

25

27

O OH

HO O O

O OH

HO HO

Cũng năm này, Yu Wang và cộng sự cũng đã phân lập được 2

phenylpropanoid glycoside là parispolyside F (17) và parispolyside G (18) [16]

26-O- β- D-glucopyranosyl-(25R)-∆5(6),17(20)-dien-16,22-

dione-cholestan-3β,

26-diol-3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→4)-[ α-L-rha mnopyranosyl-(1→2)]-

β-D-glucopyranoside (16)

Parispolyside G (18)

Năm 2008, LuLu Yan và cộng sự đã phân lập được một hợp chất

phenylpropanoid glycoside từ rễ cây Paris polyphylla var yunnanensis Công thức của chất mới: 2-feruloyl-O-α-D-glucopyranoyl-(1’→2)]-3,6-O-feruloyl- β-D-

OH OH OH

OH

3''' 2'''

4'''

5''' 6''' 1''' 7'''

8''' 9'''

5 6

4 3

2 1

1'

6' 5'

4'

3' 2'

9'' 8'' 7'' 1'' 2''

6''

5'' 4''

3''

HO

O OH OH

O O O

OH

OH O

O O

OH OH O

COOH

H3C OH O

OCH3

HOOC

Parispolyside F (17)

O HO

RO

OH

O

OH OH

OH OH

OH

OH OH

Năm 2009, Ting Zhang và cộng sự đã phân tích định tính và định lượng

các hợp chất saponin steroid từ Paris polyphylla var yunnanensis và Paris polyphylla var chinensis bằng phương pháp sắc kí lỏng kết hợp với khối phổ [13]

Cấu trúc chung của các saponin steroid mà nhóm tác giả đã nghiên cứu:

14

7 9

5

17 16

24

1

20

Ký

6 Pennogenin -OH Rha(1→4)-Rha

(1→4)-[Rha(1→2)]-Glc-

Pennogenin

3-O-α-L-L-rhamnopyranosyl(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl (1→2)]-β-D-

5 Pennogenin -OH Rha(1→2)- [Ara

(1→4)]-Glc-

Pennogenin

3-O-α-L-L-arabinofuranosyl(1→4)]-β-D-glucopyranoside

rhamnopyranosyl(1→2)-[α-24 Pennogenin -OH Rha(1→2)-Glc- Pennogenin 3-O-α-L-

glucopyranosyl(1→3)]-β-D- glucopyranoside

7 Diosgenin -H Rha(1

→2)-[Ara(1→4)]-Glc-

Diosgenin

3-O-α-L-L-arabinofuranosyl(1→4)]-β-D-glucopyranoside

rhamnopyranosyl(1→2)-[α-27 Diosgenin -H Rha(1→2)-Glc- Diosgenin 3-O-α-L-

rhamnopyranosyl(1→2)-β-D- glucopyranoside

28 Diosgenin -H Ara(1→4)-Glc- Diosgenin 3-O-α-L-

rhamnopyranosyl(1→4)-β-D- glucopyranoside

O

O O

O HO

OH

O

O Me

O Me HO

HO OH

O O

HO

H3C

HO OH

Bảng 1 Các saponin steroid từ cây Paris polyphylla var yunnanensis và P

Polyphylla var chinensis nhóm tác giả phân tích

Cùng năm 2009, Liancai Zhu và cộng sự đã phân lập được hợp chất

β-ecdysterone (30) và 3 saponin steroid từ Paris polyphylla var yunnanensis gồm pennogenin 3-O-α-L- rhamnopyranosyl(1→2)-β-D- glucopyranoside (24),

Năm 2010, Wang G X và cộng sự đã nghiên cứu và nhận thấy 2 hợp chất

saponin steroid là dioscin (32) và polyphyllin D (2) có tiềm năng là tác nhân

chống lại ký sinh trùng Dactylogyrus [14]

29 Diosgenin -H Glc- Diosgenin 3-O-β-D- glucopyranoside

OH

OH

O OH

OH

OH OH

OH

O O

1 2 3 4 5 6 7 8 10

19 1112 13 14

18 17 15 16

20 22 24

26 2527 23

H2C

OR2H

Năm 2012, Li-Ping Kang và cộng sự đã phân lập bốn hợp chất saponin

steroid mới: parisyunnanosides G-J (33-36) và 3 hợp chất đã biết của Paris polyphylla var yunnanensis: padelaoside B (37), pinnatasterone (38), và 20-

hydroxyecdyson (39) Tất cả các hợp chất trên được đánh giá là có khả năng gây

độc chống lại tế bào ung thư bạch cầu CCRF của con người [7]

Parisyunnanoside G (33): R1=S1, R2=S2, R3=S3

Parisyunnanoside H (34): R1=S1, R2=H, R3=S3

O OH

HO OH

Dioscin (32)

S2

OR2H

Trong nước

Hiện nay chưa tìm thấy nghiên cứu nào về cây bảy lá một hoa hay chi Paris

tại Việt Nam

1.5 Tác d ụng dược lý

Glucosid α – paristyphnin chiết từ bảy lá một hoa gây một cảm giác râm ran, và có tác dụng ức chế trên huyết áp động mạch cảnh, cơ tim và cử động hô hấp Nó gây co mạch thận, nhưng lại gây giãn mạch lách và các chi và kích thích ruột động vật thí nghiệm Những tác dụng này không bị atropin hoặc ergotoxin làm thay đổi

Bảy lá một hoa có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và có hoạt tính chống ung thư đối với những khối u thực nghiệm Những glucoside steroid chủ yếu là glucoside của diosgenin và pennogenin, được chứng minh có tác dụng cầm máu và làm tăng lực co cơ của tim

Thân rễ của P polyphylla và P fargesii thu hái ở một số địa phương của

Trung Quốc, được thử nghiệm về tác dụng trên những tế bào cơ tim được nuôi cấy Trong môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn, cao chiết với methanol với nồng độ 0,2 mg/ml đã làm ngừng sự đập tự phát của những khối tế bào cơ tim, nhưng cao này làm tăng nhịp đập khi giảm nồng độ xuống một nửa

Trong môi trường nuôi cấy có nồng độ calci thấp, 0,5 mM, nhịp đập của những tế bào cơ tim giảm xuống khoảng 60% nhịp đập của đối chứng trong môi trường tiêu chuẩn Việc cho thêm cao chiết vào môi trường có nồng độ calci thấp với nồng độ 0,1 mg/ml gây nên sự ngừng đập của tế bào, nhưng những cao khác làm tăng nhịp đập ít nhất 10 % [3]

Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Paris polyphylla đã được sử dụng để trị

bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô, … Nhiều disgenin và

pennogenin, cũng như các glycoside liên quan đã được cô lập từ Paris polyphylla

Các thí nghiệm dược lý cho thấy Flacarindiol và một số hợp chất saponin trong

Paris polyphylla có hoạt tính chống ung thư Số lượng lớn glycoside và vị trí cầu

nối của chúng trong cấu trúc của saponin ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính chống ung thư của chúng Trong số các saponin, polyphyllin D được nghiên cứu rộng rãi và được đánh giá là một tác nhân chống ung thư mạnh. [15]

Dawei Deng và cộng sự đã cô lập được 3 saponin (22), (23), (24) và thử

hoạt tính kháng nấm lên loài Cladosporium cladosporioides và Candida Kết quả cho thấy cả 3 saponin này có hoạt tính kháng nấm Hoạt tính này được đem so sánh với một số thuốc thương mại, từ đó đưa ra một giải pháp thay thế hữu ích cho các loại thuốc tổng hợp [5]

Hisashi Matsuda và cộng sự đã làm thí nghiệm với dẫn xuất methanol từ

thân rễ Paris polyphylla var yunnanensis và đã phát hiện về khả năng ức chế tổn

thương dạ dày do ethanol gây ra ở chuột Thông qua các xét nghiệm sinh học,

chứng tỏ các hợp chất (5) – (8) có tác dụng mạnh trong việc ức chế tổn thương dạ

dày gây ra bởi ethanol và indomethacin [6]

1.6 Tính v ị, công năng

Thân rễ bảy lá một hoa có vị đắng, hới cay, tính hơi lạnh, hơi độc, vào kinh can, có tác dụng xổ hạ, lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc Ngoài ra, thân rễ của cây còn chữa sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc; nhất là khi bị rắn độc cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét, ho lao, ho lâu ngày, hen suyễn

Ở Trung Quốc, thân rễ cây bảy lá một hoa mọc ở miền Tây Nam Trung Quốc được dùng chủ yếu làm thuốc chữa sốt, giải độc và chữa ho

Ở Ấn Độ và Nê Pan, thân rễ bảy lá một hoa trị giun sán bằng cách uống bột thân rễ mỗi lần một thìa cà phê, ngày một lần, liền trong 2 ngày Để trị mụn nhọt

và nhọt độc, hằng ngày bôi bột nhão chế từ thân rễ bảy lá một hoa một cách đều đặn [3]

Thân rễ của Paris polyphylla được sử dụng rộng rãi ở Nepal như chống giun sán, chống co thắt, dễ tiêu hóa dạ dày, thuốc long đờm, và thuốc giun Thuốc bột từ thân rễ dùng trị sốt và ngộ độc thực phẩm Bột rễ nhão được ứng dụng làm thuốc giải độc rắn cắn và độc do côn trùng cắn và cũng làm giảm ảnh hưởng của thuốc mê [10]