Khảo sát thành phần hoá học cao Chloroform của lá cây Bàng biển (Calotropis gigantea L.), họ Thiên lý (Asclepiadaceace)

Các nhà hóa học đã tổng hợp được nhiều loại hợp chất chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau.. Nước ta thuộc vùng nhiệt đới gió mùa, có nguồn thực vật đa dạng và phong phú là một ưu thế rất l

Em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Trung Nhân,

TS Lê Việt Tiến, PGS TS Trần Lê Quan, PGS TS Nguyễn Ngọc Hạnh, PGS TS Trần Công Luận, TS Tôn Thất Quang và tất cả các Thầy Cô thuộc

Khoa Hóa-Đại học Khoa Học Tự Nhiên HCM-những người thầy, người cô đã hết lòng hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt luận văn này Cho em gửi lời cảm ơn đến các anh chị nghiên cứu sinh, các bạn học viên cao học đã chỉ bảo kinh nghiệm, giúp đỡ em nhiều trong quá trình làm việc ở phòng thí nghiệm Cảm ơn các em sinh viên đã phụ giúp chị trong thời gian qua

Và cuối cùng là lòng biết ơn sâu sắc đến Bố-Mẹ cũng như tất cả những người thân yêu trong gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất về tinh thần lẫn vật chất giúp con hoàn thành tốt luận văn này

Xin chân thành cảm ơn

Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 8 năm 2012

Đỗ Minh Hiền

  1.1 Giới thiệu về cây bàng biển 2

1.1.1 Tên gọi 2

1.1.2 Mô tả thực vật 2

1.1.3 Phân bố 4

1.2.2 Hoạt tính sinh học 6

1.3 Thành phần hoá học của cây 10

2.2 Biện luận và kết quả 21

3.2 Điều kiện thí nghiệm 50

3.2.1 Hóa chất 50 3.2.2 Thiết bị 51

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

Hình 2.4 Tương quan HMBC của hợp chất BH4 29

Hình 2.5 Tương quan HMBC chính của hợp chất BH5 33

Hình 2.6 Tương quan HMBC chính của hợp chất BH6 39

Hình 2.7 Hệ liên hợp 3-one-4,6-diene của hợp chất BH7 40

Hình 2.8 Tương quan HMBC chính của hợp chất BH7 41

Hình 2.9 Tương quan HMBC chính của hợp chất BH8 44

Hình 2.10 Hệ nối đôi liên hợp ngoài vòng của hợp chất BH9 48

Hình 2.11 Hệ nối đôi liên hợp trong vòng của hợp chất BH9 48

Hình 2.13 Tương quan HMBC chính của hợp chất BH9 49

Sơ đồ 3.1 Quy trình điều chế các loại cao 53

Phụ lục 2 Phổ C-NMR của hợp chất BH1

Phụ lục 3 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất BH1 Phụ lục 4 Phổ HSQC của hợp chất BH1

Phụ lục 27 Phổ HMBC của hợp chất BH6

Phụ lục 28 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất BH6

Phụ lục 39 Phổ 1H-NMR của hợp chất BH9

Phụ lục 40 Phổ 13C-NMR của hợp chất BH9

Phụ lục 41 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất BH9 Phụ lục 42 Phổ HSQC của hợp chất BH9

Phụ lục 43 Phổ HMBC của hợp chất BH9

Phụ lục 44 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất BH9

MỞ ĐẦU 

Ngày nay, cùng với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật là việc phát sinh ra nhiều bệnh tật nguy hiểm khác nhau Việc nghiên cứu sản xuất các loại dược phẩm để phục vụ nhu cầu sức khỏe của con người là rất cần thiết, và ngành hóa học cũng đã góp một phần không nhỏ vào sự phát triển ấy Các nhà hóa học đã tổng hợp được nhiều loại hợp chất chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau Tuy nhiên, những loại thuốc này thường rất đắt và một số chúng có tác dụng phụ, chính vì thế, con người

có khuynh hướng quay về với nền y học cổ truyền, sử dụng dược thảo làm thuốc trị bệnh Nước ta thuộc vùng nhiệt đới gió mùa, có nguồn thực vật đa dạng và phong phú là một ưu thế rất lớn đối với các nhà nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên

Việc chiết xuất, cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên trong cây cỏ là giai đoạn đầu tiên trong quá trình tìm kiếm và điều chế ra các loại thuốc từ nguồn gốc tự nhiên nhằm phục vụ sức khỏe của con người

Lá cây bàng biển (Calotropis gigantea L.) xuất hiện không ít trong thành phần

của các bài thuốc cổ truyền chữa nhiều bệnh thông thường và phổ biến như chữa mụn nhọt, rắn cắn, đau răng, đau miệng, bệnh đậu mùa, bệnh ngoài da, vết cắn, chữa lành vết thương Đặc biệt nó được các thầy lang địa phương dùng để chữa ung thư vú-một căn bệnh đang rất được quan tâm hiện nay khi mà số lượng bệnh nhân

tử vong vì các chứng bệnh ngày càng tăng cao

Với mong muốn tìm hiểu thành phần hoạt chất trong lá cây bàng biển trong luận văn này, chúng tôi đã bước đầu khảo sát thành phần hoá học của lá cây bàng biển thu hái ở thành phố Phan Thiết, tỉnh Bình Thuận

tên gọi khác như: arka, alarka (Sanskrit), giantic swallow wort, mudar

(Anh), madar (Hindi), ekkemale (Canada), mandaramu, ekke, jilledu, arka

(Telugu), errikka (Malaysia), koreng susu, biduri (Indonesia)

¾ Phân loại khoa học: được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1: Phân loại khoa học

Thân cây mọc thành bụi, cao 5-7 m, có thể cao hơn nếu để mọc tự nhiên

Cành nhỏ, có lông trắng Vỏ thân lúc non có rãnh, màu vàng nhạt; vỏ già màu xám

trắng như phấn

Hình 1.

hùm, nhiều

ặc đốm hồnhấn của mỗ

u thượng đầ

1.1: Cây bà

h tim, đầu thấn, gần nh

đều có màugốc lá mặt

ng kính kho

h xe Bao puôi và gót đ

u lục trên

oảng phấn đính

ùng đồng bđoạn cành

ng du Cây

m cây cảnh

hạt có chùm

ơi ở nước tSri Lanka, M

g rào Mùa

g

Bắc rung hưng trồng

a hoa

1.2 NGHIÊN CỨU DƯỢC TÍNH

1.2.1 Công dụng dân gian [1],[3],[5]

¾ Công dụng của lá

Dùng trị ho và hen suyễn

Hái lá mang về, dùng khăn ướt lau sạch lông, thái nhỏ, sao qua cho héo Mỗi ngày dùng 10 lá sắc với 1,5 bát nước, cô lại còn 1 bát, thêm đường và uống làm 3-4 lần trong ngày Nên uống sau bữa ăn Nước sắc có vị đắng tanh, uống vào có thể mỏi chân tay, đau mình mẩy, đi cầu lỏng (rất hiếm) Uống nhiều một lúc có thể gây nôn Hiệu quả sau 2-3 ngày Có khi có kết quả sau 10 phút Thường được phối hợp với nhiều vị thuốc khác

Chữa mụn nhọt, rắn cắn, đau răng, đau miệng, bệnh đậu mùa, bệnh ngoài da, vết cắn, chữa lành vết thương

Ở Ấn Độ, người ta còn dùng cao chiết từ lá để điều trị bênh sốt rét cơn

Ở Trung Quốc, người ta dùng lá trị hen suyễn, ho gà, viêm khí quản

¾ Công dụng của nhựa mủ

Dùng với liều thấp làm thuốc gây nôn, liều cao sẽ gây độc Thường dùng chữa kiết lỵ nhẹ Dùng ngoài đắp trị viêm khớp, đắp lên các ghẻ mụn, các vết loét, lậu, giang mai Trộn với mật ong dùng để đắp lên các mụn loét trong miệng Tẩm vào bông rồi vò viên nhét vào lỗ răng đau sẽ làm ngưng đau nhức Nhựa cây phối hợp với nhựa xương rồng làm thuốc xổ, cũng dùng gây nôn với liều cao và còn dùng để đều trị bệnh phong hủi, kiết lỵ và dùng đắp trị bệnh sưng chân voi

Nhựa Calotropis gigantea là một chất kích thích mạnh đối với da và niêm

bệnh phong cùi, giang mai giai đoạn hai và bệnh lậu Hoa còn được dùng để chữa hen phế quản

1.2.2 Hoạt tính sinh học [3],[5-18]

Calotropis gigantea là loại cây có hoạt tính rất cao và có khả năng chữa được

nhiều bệnh khác nhau Một trong những khả năng đó nổi trội nhất là độc tính của nó với vi khuẩn, nấm và tế bào ung thư…

Năm 2004, Chitme HR và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu dịch trích

nước, methanol, ethanol, petroleum ether của lá cây Calotropis gigantea Kết quả

cho thấy chúng có hoạt tính chống lại nấm gây bệnh Candida Kháng khuẩn

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus ceceus, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus, Klebsiella pneumonia Dịch trích nước từ mủ cây

này hạn chế hoạt động đối với Staphylococcus aureus, Bacillus ceceus, Escherichia

coli và Candida krurei

Năm 2008, Alam et al.và các đồng sự đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính sinh

học của các hợp chất có ích trong việc kháng khuẩn Họ đã tiến hành chiết bằng

dung môi methanol, chloroform, petroleum ethertừ vỏ rễ của Calotropis

giganteacho thấyhoạt tính chống lạiSarcina lutea, Bacillus megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Shigella sonnei, Escherichia coli

Tháng 10 năm 2010, tại Ấn Độ, Kotaki Venkata Bhaskara Rao cùng các cộng

khuẩn: Staphylococcus, Escherichia coli, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa,

Micrococcus luteus và Klebsiella pneumonia Trong đó, hoạt tính ức chế cực đại

đối với dòng vi khuẩn E.coli và thấp nhất đối với dòng vi khuẩn K.pneumoniae

Năm 2010, tại Bangladesh, Muhammad Rowshanul và các cộng sự đã nghiên

cứu cho thấy dịch trích cao chiết ethyl acetate từ hoa của cây Calotropis gigantea

L (thu hái vào tháng 3 năm 2008 tại Meherchandi, Bangladesh) Kết quả cho thấy

có hoạt tính chống u bướu, chống tế bào ung thư biểu mô cổ trướng đối với loài chuột bạch Thuỵ Sĩ Tiến hành tiêm vào cơ thể chuột bạch tạng Thuỵ Sĩ tế bào EAC (tế bào gây ung thư) Chúng có thời gian sống sót trong vòng 21,5 ngày Nếu tiêm

vào cơ thể chúng dịch trích cao ethyl acetate của hoa cây Calotropis gigantea với

hàm lượng 50, 100 và 200 mg/kg thì thời gian sống của chúng được kéo dài thêm lần lượt là 25,2 ± 0,47; 27,7 ± 0,63; và 35,5 ± 0,86 ngày

Năm 2011, tại Ấn Độ, Rahul Mayee cùng các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu

dịch chiết cao methanol của rễ cây Calotropis gigantea L đối với bệnh hen suyễn

Nguyên liệu được thu hái ở Maharashtra(Ấn Độ) Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch

chiết cao methanol của rễ cây Calotropis gigantea L có tác dụng ức chế amin

histamine, là nguyên nhân gây ra các chứng co thắt, ức chế haloperidol là nguyên nhân dẫn đến cơn tê dại trong bệnh hen suyễn (hàm lượng sử dụng 300 mg/kg)

Năm 2011, Gaurav Kumar và các cộng sự tiến hành nghiên cứu hoạt tính sinh

học của các hợp chất trong cây Calotropis gigantea đã thu được các kết quả sau:

• Trị ung thư và gây độc tế bào: các chất cardenolide glycoside (đại diện

là calotropin, frugoside, 4’-O-β-D-glucopyransyfrugoside) trong cây

mang hoạt tính gây độc tế bào đối với vài dòng tế bào ung thư ở người

và chuột Theo nghiên cứu này thì calotropin, frugoside trích từ dịch ethanol của rễ có tác dụng ức chế hoạt động của dòng tế bào K562 (gây bệnh bạch cầu mãn tính ở người) và dòng tế bào SGC-7901 (gây ung thư dạ dày ở người) Dịch trích từ ethyl acetate của hoa có khả năng ức chế ung thư biểu mô cổ trướng ở chuột

Bảng 1.2: Tóm tắt hoạt tính sinh học

Methanol, nước, petroleum ether, choloroform

   

Isorhamnetin-3-O-rutinoside Glu –Orha OGal

Isorhamnetin 3-O-glucoside Glucose

Isorhamnetin rhamnoglucoside Glucose-O-Rhamnose

1.3.2 Nhóm Steroid

               

 

 

O O H

CH 3

O O H OCH 3

CH 3

OH H O

O O H OCH 3

CH 3

O H

O

O

Calotroposide C

   

 

   

 

1.3.3 Nhóm Triterpenoid

O O Anhydrosophoradiol-3-acetat H

CHƯƠNG 2 NGHIÊN CỨU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao

chloroform của lá cây bàng biển Calotropis gigantea được thu hái tại Phan Thiết

vào tháng 8/2011 Lá cây được phơi khô, xay nhỏ rồi trích kiệt với methanol theo phương pháp đun hoàn lưu, lọc, cô quay thu hồi dung môi thu được cao methanol thô Hòa tan cao methanol vào nước rồi trích lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi

petroleum ether, chloroform, ethyl acetate và n-butanol thu được các phân đoạn cao

tương ứng

Sử dụng các kĩ thuật sắc ký cột, sắc ký bản mỏng và sắc ký điều chế trên cao chloroform với nhiều hệ dung môi giải ly khác nhau, chúng tôi đã cô lập được chín hợp chất: BH1-BH9

Sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân1 chiều (1H-NMR, 13NMR, DEPT), 2 chiều (HSQC, HMBC) và khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS, chúng tôi xác định được cấu trúc của các hợp chất trên lần lượt là:acid vanillic (BH1), 4-hydroxybenzaldehyde (BH2), 2-formyl-5-hydroxymethylfuran (BH3),

C-methyl β-carboline-1-carboxylate (BH4), (+)-pinoresinol (BH5),(+)-syringaresinol

(BH6), 14α-hydroxydione (BH7),

pregna-4,6-diene-3,20-dione (BH8) và (BH9)

2.2 BIỆN LUẬN VÀ KẾT QUẢ

2.2.1 Khảo sát cấu trúc hoá học hợp chất BH1

Hợp chất BH1 có màu trắng, dạng vô định hình, tan tốt trong dung môi

methanol Sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-hexane:ethyl acetate (6:4), hấp thu

UV cho vết tròn có Rf = 0,5, không hiện màu với dung dịch H2SO4 20% hơ nóng Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) (phụ lục 1) của hợp chất BH1 cho ba tín

hiệu proton của vòng benzene thế tại vị trí 1,3,4 [δH 6,86 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5);

[δH 7,56 (1H, d, J=2,0 Hz; H-2); [7,58 (1H, dd, J=8,5; 2,0 Hz; H-6)] và một tín hiệu

proton của nhóm methoxyl [δH 3,91 (3H, s, -OCH3)]

(δC 148,6) chứng tỏ nhóm hydroxyl gắn tại C-4 của vòng benzene.

Từ các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất BH1 kết hợp so sánh

với tài liệu tham khảo[22] (bảng 2.1) kết luận hợp chất BH1 chính là acid vanillic

Hình 2.1:Tương quan HMBC chính của hợp chất BH1

Bảng 2.1: Bảng dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất BH1 so sánh với tài liệu

tham khảo được ghi trong cùng loại dung môi CD3OD.[22]

2.2.2 Khảo sát cấu trúc hoá học hợp chất BH2

Hợp chất BH2 có màu trắng, dạng vô định hình, tan tốt trong dung môi

chloroform Sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-hexane:acetone (8:2), hấp thu UV,

hiện màu với dung dịch H2SO4 20% hơ nóng cho vết màu hồng (chuyển sang màu

xanh nếu để lâu) có Rf= 0,4

Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (phụ lục 6) cho một tín hiệu proton của

nhóm aldehyde [δH 9,86 (1H, s)] và hai tín hiệu proton của vòng benzene thế ở vị

trí 1, 4 [δH 6,96 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3, 5); 7,82 (2H, d, J=8,5 Hz, H-2, 6)]

Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (phụ lục 7) cho một tín hiệu carbon của

nhóm aldehyde [δC 190,8] và bốn tín hiệu carbon của vòng benzene trong vùng

115,0-162,0 ppm trong đó có một tín hiệu là của carbon vòng benzene mang oxygen

[δC 161,5] và một tín hiệu của carbon vòng benzene gắn nhóm formyl [δC 129,8]

Từ các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR kết hợp so sánh với tài liệu tham

khảo[23] (bảng 2.2) kết luận hợp chất BH2 là 4-hydroxybenzaldehyde

4-Hydroxybenzaldehyde Hình 2.2: Cấu trúc hợp chất BH2

Bảng 2.2 : Bảng dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất BH2 so sánh với tài liệu

tham khảo ghi trong cùng dung môi CDCl3 [23]

2.2.3 Khảo sát cấu trúc hoá học hợp chất BH3

Hợp chất BH3 thu được dưới dạng dầu màu vàng, tan tốt trong chloroform

Sắc ký bản mỏng trên silica gel pha thường với hệ dung ly petroleum ether:acetone (5:5), hấp thu UV, hiện hình bằng dung dịch H2SO4 20%, đun nóng, xuất hiện một vết tròn màu nâu đen, có Rf = 0,4

Phổ 1H-NMR (acetone-d 6 , 500 MHz) (phụ lục 8 )của hợp chất BH3 hiện

Phổ 13C-NMR (acetone-d 6 , 125 MHz) (phụ lục 9) kết hợp với DEPT-NMR

(phụ lục 10), cho thấy hợp chất BH3 có sáu carbon, trong đó có một carbon

carbonyl của aldehyde (δC 178,2), một carbon oxymethylene (δC 57,6), bốn carbon

của vòng furan, trong đó có hai carbon sp 2 tứ cấp [δC 162,9 (C-5); 153,5 (C-2)], hai carbon methine olefin >CH- [δC 123,6 (C-3); 110,2 (C-4)]

Từ các kết quả phổ nghiệm trên có thể dự đoán BH3 có khung furan mang

hai nhóm thế, trong đó một nhóm –CH2OH và một nhóm -CHO Để làm rõ thêm cấu trúc tiến hành ghi phổ HSQC, HMBC

Phổ HSQC (phụ lục 11) và HMBC (phụ lục 12) cho thấy proton aldehyde

[δH 9,60 (1H, s)] tương quan với carbon sp 2 mang oxygen C-2 (δC 153,5) chứng tỏ nhóm formyl gắn tại C-2 Bên cạnh đó, tương quan HMBC giữa proton của nhóm

oxymethylene tương quan với carbon sp 2 mang oxygen (δC 162,9) và carbon methine olefin (δC 110,2) chứng tỏ nhóm hydroxymethylene gắn tại C-5 của vòng furan

Từ các lập luận trên, cấu trúc của BH3 được đề nghị là hydroxymethylfuran

2-formyl-5-Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất BH3 cho bởi bảng 2.3

Tương quan HMBC của hợp chất BH3 cho bởi hình 2.3

Hình 2.3: Tương quan HMBC của hợp chất BH3

So sánh số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất BH3 với hợp chất

2-formyl-5-hydroxymethylfuran[24](bảng 2.4) cho thấy sự tương hợp, do đó chúng tôi đề nghị

cấu trúc của hợp chất BH3 là 2-formyl-5-hydroxymethylfuran

Bảng 2.4: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất BH3 so sánh với tài liệu tham

khảo được ghi trong cùng dung môi acetone-d 6 [24]

hydroxymethyl furan

2.2.4 Khảo sát cấu trúc hoá học hợp chất BH4

Hợp chất BH4 có màu vàng, dạng vô định hình, tan tốt trong acetone và

methanol Sắc ký bản mỏng hệ n-hexane:acetone (6:4), hấp thu UV, hiện màu với

dung dịch H2SO4 20% ( không cần hơ nóng) cho vết màu vàng có Rf=0,7

Phổ 1H-NMR (acetone-d 6 , 500 MHz) (phụ lục13) cho thấy hai tín hiệu

proton đặc trưng của vòng pyridine thế ở vị trí 2, 3, 4 [δH 8,51 (1H, d, J=5,0 Hz,

H-3); 8,34 (1H, d, J=5,0 Hz, H-4] và bốn tín hiệu proton của vòng benzene thế ở vị

trí 1, 2 [δH 8,29 (1H, d, J=8,5 Hz, H-8); 7,81 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5); 7,62 (1H, dt,

J=8,5; 1,5Hz, H-7); 7,30 (1H, dt, J=8,5; 1,5 Hz, H-6)] Ngoài ra, còn có một tín

hiệu proton của nhóm methoxyl [δH 4,02 (3H, s, -OCH3)] và tín hiệu proton của

nhóm amin nhị cấp –NH– [δH 10,90 (1H, s)]

Phổ 13C-NMR (acetone-d 6 , 125 MHz) (phụ lục 14), xuất hiện mười ba tín

hiệu carbon Một tín hiệu carbon methoxyl tại δC 52,4; một tín hiệu carbon carbonyl

của nhóm ester tại δC 167,4 Ngoài ra, còn có mười tín hiệu carbon hương phương

nằm trong vùng 113,0-142,0 ppm (trong đó có năm carbon loại =C< và sáu carbon

loại =CH-)

Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS cho mũi ion phân tử giả [M + H]+ ở m/z

227,0829 phù hợp với công thức phân tử C13H11N2O2 (sai lệch 1,4 mmass) Nên

công thức phân tử của BH4 là C13H10N2O2

Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất BH4 cho bởi bảng 2.5

Tương quan HMBC của hợp chất BH4 cho bởi hình2.4

Hình 2.4: Các tương quan HMBC chính của hợp chất BH4

Bảng 2.5: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất BH4

Với tất cả các dữ liệu trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo[25],[26]

(bảng 2.6) kết luận hợp chất BH4 là methyl β-carboline-1-carboxylate.

-2.2.5 Khảo sát cấu trúc hoá học hợp chất BH5

Hợp chất BH5 có màu trắng, dạng vô định, tan tốt trong dung môi methanol

Sắc ký bản mỏng n-hexane:ethyl acetate (6:4), hấp thu UV, hiện màu với dung dịch

H2SO4 20% hơ nóng cho vết màu tím có Rf =0,45