khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của bạch đầu ông vernonia cinerea

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA ­­­­­­­­­­ MAI VĂN HIẾU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA BẠCH ĐẦU ÔNG VERNONIA CINEREA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC Cần Thơ, 2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA ­­­­­­­­­­ MAI VĂN HIẾU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA BẠCH ĐẦU ÔNG VERNONIA CINEREA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS NGUYỄN TRỌNG TUÂN Cần Thơ, 2015 LỜI CẢM ƠN  Trong suốt trình thực luận văn tốt nghiệp trình học tập làm việc trường, để có kết này, xin gửi lời cảm ơn chân thành lời tri ân đến Thầy, Cô môn Hóa Học - khoa Khoa Học Tự Nhiên - trường Đại học Cần Thơ tận tình bảo, động viên suốt năm học vừa qua Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn đến: - - TS Nguyễn Trọng Tuân tận tình bảo, khuyến khích tạo điều kiện cho hoàn thành luận văn, giúp định hướng đường nghiên cứu khoa học riêng ThS Nguyễn Thế Duy, người anh, người Thầy khuyến khích, bảo cho từ ngày đầu bước chân vào nhiên cứu khoa học, giúp có tảng vững để hoàn thành tốt luận văn Bên cạnh đó, xin gửi lời cảm ơn đến TS Đái Thị Xuân Trang, môn Sinh Học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên có đóng góp quí báo để giúp hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cám ơn đến tập thể lớp Hóa Dược K37 đồng hành năm qua Con xin cám ơn gia đình tin tưởng, ủng hộ suốt quãng thời gian học Đại học Cuối cùng, xin cảm ơn tổ chức phi lợi nhuận “Góp phần đào tạo nhân tài Việt Nam” hỗ trợ tài cho suốt năm học Song song đó, gửi lời cám ơn đến “Hội cựu học sinh trường Trung học Thoại Ngọc Hầu” giúp đỡ, tạo điều kiện cho học tập tốt Xin cảm ơn! i Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Bộ Môn Hóa Học Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc ­­­­­­­­­­­­ NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Cán hướng dẫn: TS Nguyễn Trọng Tuân Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính kháng oxy hóa bạch đầu ông Vernonia cinerea Sinh viên thực hiện: Mai Văn Hiếu MSSV: 2112023 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37 Nội dung nhận xét: a) Nhận xét hình thức LVTN: b) Nhận xét nội dung LVTN (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài:  Những vấn đề hạn chế: c) Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d) Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015 Cán hướng dẫn TS Nguyễn Trọng Tuân ii Trường Đại Học Cần Thơ Khoa Khoa Học Tự Nhiên Bộ Môn Hóa Học Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc Lập ­ Tự Do ­ Hạnh Phúc ­­­­­­­­­­­­ NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Cán phản biện: …………………………………………………………… Đề tài: Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính kháng oxy hóa bạch đầu ông Vernonia cinerea Sinh viên thực hiện: Mai Văn Hiếu MSSV: 2112023 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37 Nội dung nhận xét: a) Nhận xét hình thức LVTN: b) Nhận xét nội dung LVTN (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài:  Những vấn đề hạn chế: c) Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d) Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015 Cán phản biện iii TÓM TẮT Bạch đầu ông (Vernonia cinerea) loại cỏ mọc hoang sử dụng từ lâu vị thuốc y học cổ truyền Từ cao chiết Bạch đầu ông, phương pháp sử dụng gốc tự DPPH, xác định hoạt tính kháng oxy hóa cao ethanol tổng với giá trị IC50 là: 127 g/mL Kết định tính cho thấy toàn Bạch đầu ông có chứa flavonoid, triterpenenoid, steroid, glycoside, phenol, tannin Từ cao chiết hexane phân lập xác định cấu trúc hai hợp chất stigmasterol dẫn xuất acid béo phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân Một vài sterol triterpene khác như: -Sitosterol, campesterol, lupeol, -amyrin xác nhận diện cao hexane kĩ thuật GC-MS, campesterol lần đầu xác nhận diện Bạch đầu ông Các kết góp phần làm phong phú thêm vốn hiểu biết loài Bạch đầu ông mọc Việt Nam iv ABSTRACT Vernonia cinerea is widely distributed and has many traditionally medical applications From the various extracts of Vernonia cinerea, using the free radical DPPH, have determined the antioxidant activity of ethanol extract with IC50 = 127 (g/mL) The qualitative of phytochemical showed the present of many phytochemical groups such as flavonoid, triterpenoid, steroid, glycoside, phenol, tannin From the hexane extract, two compounds namely: stigmasterol and a fatty acid derivative have isolated and elucidated their structure by NMR Some phytosterols and triterpenes including -sitosterol, campesterol, lupeol, -amyrin have also identified by GC-MS and campesterol is the first time were reported in Vernonia cinerea These results have contributed to our knowledge about Vietnamese Vernonia cinerea v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ii NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN iii TÓM TẮT iv ABSTRACT v MỤC LỤC vi DANH SÁCH BẢNG viii DANH SÁCH HÌNH ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu 1 1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Bạch đầu ông 2.1.1 Tên gọi 2.1.2 Đặc điểm 2.1.3 Công dụng 2.1.4 Tình hình nghiên cứu nước 2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp DPPH 2.2.1 Sơ lược gốc tự tác hại 2.2.2 Các phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa 2.2.3 Nguyên tắc phương pháp DPPH 2.2.4 Cơ chế kháng oxy hóa hợp chất phenolic 2.2.5 Phương pháp TLC-DPPH 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu 2 2 6 9 10 10 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm, thời gian phương tiện 3.1.1 Địa điểm 3.1.2 Thu xử lý mẫu 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 13 13 13 13 13 vi 3.1.4 Hóa chất 3.2 Điều chế cao chiết 3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa DPPH 3.3.1 Lựa chọn điều kiện phản ứng 3.3.2 Khả kháng oxy hóa vitamin C 3.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết 3.3.4 Tính toán biểu diễn kết 3.3.5 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa TLC-DPPH 3.4 Định tính thành phần hóa học cao chiết 3.4.1 Alkaloid 3.4.2 Flavonoid 3.4.3 Triterpenoid – steroid 3.4.4 Glycoside 3.4.5 Phenol 3.4.6 Saponin 3.4.7 Tannin 3.5 Phân lập chất từ cao hexane 3.6 Phương pháp xác định cấu trúc chất 13 13 14 15 16 17 17 18 18 19 19 19 20 20 20 20 20 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết phân lập cao chiết 4.2 Kết thử hoạt tính kháng oxy hóa 4.2.1 Nồng độ DPPH tối ưu 4.2.2 Đường chuẩn Vitamin C 4.2.1 Kết hoạt tính kháng oxy hóa 4.2.2 Kết hoạt tính kháng oxy hóa TLC-DPPH 4.3 Kết định tính thành phần hóa học 4.4 Kết phân lập chất từ cao hexane 4.4.1 Hợp chất VC1 4.4.2 Hợp chất VC2 4.5 Kết phân tích thành phần triterpenoid-steroid 23 23 24 24 25 25 27 27 28 28 30 31 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.2 Kiến nghị 33 33 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 37 vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Các sesquiterpene hoạt tính sinh học chúng Bảng 2.2: Các phương pháp xác định khả chống oxy hóa Bảng 2.3: Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học [22] 12 Bảng 4.1: Độ hấp thu dung dịch DPPH 24 Bảng 4.2: Phần trăm ức chế gốc tự DPPH Vitamin C 25 Bảng 4.3: Phần trăm ức chế gốc tự DPPH cao chiết 26 Bảng 4.4: Kết định tính nhóm hợp chất 27 Bảng 4.5: Độ dịch chuyển hóa học VC1 so với ­stigmasterol ( ppm) 29 Bảng 4.6: Kết GC-MS hhVC1 31 Bảng 4.7: Kết GC-MS hhVC2 32 viii [13] I Laher (ed) (2014) Systems Biology of Free Radicals and Antioxydants Springer Berlin Heidelberg [14] Z Q Liu (2010) Chemical Methods to Evaluate Antioxydant Ability Chemical Reviews, 110: 5675-5691 [15] A M Pisoschi and G P Negulescu (2012) Methods for Total Antioxydant Activity Determination A Review Biochemistry and Analytical Biochemistry 1(1): 106 [16] M N Alam, N J Bristi and M Rafiquzzaman (2013) Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxydant activity Saudi Pharmceutical Journal, 21 (2): 143-152 [17] H D Bhattarai, B Paudel, S G Hong, H K Lee and J H Yim (2008) Thin layer chromatography analysis of antioxydant constituents of lichens from Antarctica Journal of Natural Medicines, 62 (4): 481484 [18] M Olech, L Komsta, R Nowak, L Ciesla and M WaksmundzkaHajnos (2012) Investigation of antiradical activity of plant material by thin-layer chromatography with image processing Food Chemistry, 132 (1): 549-553 [19] T Yrjönena, L Peiwub, J Summanena, A.Hopiab and H Vuorelaa (2003) Free radical-scavening activity of phenolics by reversed-phase TLC JAOCS, 80 (1): 9-14 [20] Lihua Gu, Tao Wu and Zhengtao Wang (2009) TLC bioautographyguided isolation of antioxydants from fruit of Perilla frutescens var acuta LWT - Food Science and Technology, 42 (1): 131-136 [21] D L Pavia (2009) Introduction to Spectroscopy, Cengage Learning [22] P Crews, J Rodriguez and M Jaspars (1998) Organic Structure Analysis, Oxford University Press, [23] Om P Sharma and Tej K Bhat (2009) DPPH antioxydant assay revisited Food Chemistry, 113 (4): 1202-1205 [24] T Jerman Klen and B Mozetič Vodopivec (2011) DPPH Solution (In)stability during Kinetic UV/Vis Spectrometry Measurements of Phenols Antioxydant Potential Food Analytical Methods, (4): 781783 [25] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, [26] Yi Sheng and Xiao-Bin Chen (2009) Isolation and identification of an isomer of β-sitosterol by HPLC and GC-MS Health, 01 (03): 203-206 [27] K S Suslick (1990) Sonochemistry Science, 247: 1439-1445 35 [28] T N Misra, R S Singh, J Upahyday and R Srivastara (1984) Isolation of a natural sterol and an aliphatic acid from Vernonia cinerea Phytochemistry, 23 (2): 415-417 [29] J C Cayme and C Y Ragasa (2004) Structure elucidation of βstigmasterol and β-sitosterol from Sesbania grandifora [Linn.] Pers and β-carotene from Heliotropium indicum Linn by NMR spectroscopy Kimika, 20: 5-12 36 PHỤ LỤC Phụ lục A.1: Phổ 1H-NMR VC1 37 Phụ lục A.2: Phổ 1H-NMR giãn rộng (0,6 - 1,8 ppm) VC1 38 Phụ lục A.3: Phổ 1H-NMR giãn rộng (3,4 - 5,5 ppm) VC1 39 Phụ lục A.4: Phổ 13C-NMR VC1 40 Phụ lục A.5: Phổ DEPT VC1 41 Phụ lục A.6: Phổ DEPT giãn rộng VC1 42 Phụ lục B.1: Phổ IR hợp chất VC2 43 Phụ lục B.2: Phổ 1H-NMR hợp chất VC2 44 Phụ lục B.2: Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất VC2 45 Phụ lục C.1: Sắc kí đồ GC-MS hhVC1 RT: 0.00 - 15.00 SM: 15B NL: 3.03E8 TIC MS SterolMaiHi eu 7.59 100 95 90 85 80 75 70 Relative Abundance 65 60 55 50 45 40 35 8.35 30 25 7.15 20 15 10 9.22 6.42 2.26 2.36 2.90 3.48 3.78 4.36 4.98 5.41 9.52 9.89 10.52 11.32 12.32 13.04 13.76 14.26 0 PEAK LIST Apex RT %Area 7.59 73 8.35 16 7.15 8.82 Time (min) Name Stigmasterol β-Sitosterol Campesterol 46 10 11 12 13 14 15 Phụ lục C.2: Khối phổ stigmasterol 55 100 83 69 50 43 133 91 105 145 159 119 HO 412 255 173 271 300 213 351 185 199 229 285 314 369 327 397 40 60 (mainlib) Stigmasterol 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 Phụ lục C.3: Khối phổ -sitosterol 43 100 55 50 81 105 69 145 119 HO 414 133 159 213 173 231 199 30 255 329 241 80 100 120 140 160 180 200 220 240 381 354 367 315 40 60 (replib) β-Sitosterol 260 396 303 273 280 300 320 340 360 380 400 420 440 420 440 Phụ lục C.4: Khối phổ campesterol 43 100 55 50 81 95 107 71 HO 145 119 133 173 400 289 213 161 231 199 241 31 40 60 (mainlib) Campesterol 80 100 120 140 160 180 200 220 240 273 261 260 47 382 315 255 280 367 327 340 300 320 340 360 380 400 Phụ lục D.1: Sắc kí đồ GC-MS hhVC2 RT: 4.00 - 15.00 SM: 15B NL: 3.39E8 TIC MS hhVC2 8.45 100 95 90 9.19 85 80 75 70 Relative Abundance 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 4.23 5.17 5.34 6.30 6.87 7.23 10.79 7.62 8.07 11.39 11.87 12.40 13.30 14.35 14.60 10 Time (min) PEAK LIST Apex RT %Area Name 8,45 52,46 β-Amyrin 9,19 43,49 Lupeol 48 11 12 13 14 15 Phụ lục D.2: Khối phổ β-amyrin 218 100 OH 50 203 69 31 43 55 40 60 (mainlib) β-Amyrin 95 81 80 109 189 135 426 161 175 100 120 140 160 229 243 257 272 285 299 180 200 220 240 260 280 300 337 320 340 393 411 365 360 380 400 420 440 Phụ lục D.3: Khối phổ lupeol 100 43 68 55 81 95 109 121 207 135 189 50 218 HO 147 161 175 426 234 315 257 272 299 40 60 (mainlib) Lupeol 80 100 120 140 160 180 200 220 240 49 260 280 300 325 320 411 344 357 370 383 340 360 380 400 420 440 [...]... Thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của Bạch đầu ông Vernonia cinerea mong muốn đạt được các mục tiêu sau: - Định tính các nhóm hợp chất có trong Bạch đầu ông - Phân lập các hợp chất từ cao chiết Bạch đầu ông ở quy mô phòng thí nghiệm - Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa ở mức độ in vitro của cao chiết từ Bạch đầu ông 1.3 Nội dung nghiên cứu - Thu hái, và xử lý nguyên liệu: Bạch đầu ông sau... của nó Do đó, việc đánh giá thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, của Bạch đầu ông là cần thiết nhằm làm sáng tỏ thêm nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng, góp phần làm rõ hơn tác dụng trị liệu của nó từ đó định hướng sử dụng Bạch đầu ông vào lĩnh vực dược học hiệu quả hơn 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Trên cơ sở các nghiên cứu ở ngoài nước cũng như những hạn chế của các nghiên cứu trong nước Đề tài Thành. .. DPPH Các thành phần kháng oxy hóa sẽ chuyển sang màu vàng trên nền tím của DPPH tương tự như khi ủ dung dịch chất kháng oxy hóa với cao chiết [17, 18] Phương pháp này có thể sử dụng cho cả bản mỏng pha thường và cả pha đảo [19] Ưu điểm của phương pháp này là cho phép định tính nhanh các thành phần gây ra hoạt tính kháng oxy hóa nên cho phép sử dụng để sàng lọc các hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa từ... điện hóa học dựa vào sự khác biệt về điện trước và sau khi phản ứng Trong các phương pháp này, kĩ thuật quét thế vòng tuần hoàn và biamperometry được sử dụng phổ biến nhất Các phương pháp sắc kí cũng cho phép xác định khả năng kháng oxy hóa toàn phần nhưng có ưu điểm là cho phép tách riêng các thành phần kháng oxy hóa từ đó có thể định lượng được chính xác các thành phần có hoạt tính kháng oxy hóa Bảng... giấy rồi để trong bóng tối 30 phút [17] Tiến hành ghi nhận kết quả, các thành phần kháng oxy hóa sẽ chuyển sang màu vàng sáng trên nền tím [Hình 3.3] Hình 3.3: Quy trình thử nghiệm TLC-DPPH 3.4 Định tính thành phần hóa học của các cao chiết Nhằm đánh giá sơ bộ thành phần hóa học của các cao chiết từ Bạch đầu ông, các phương pháp định tính các nhóm hợp chất tự nhiên đã được tiến hành Các nhóm hợp chất được... 200-800 nm 185-600 nm Không Mẫu  1mg  5mg < 1mg < 1mg < 1mg < 1mg Đơn tinh thể CTPT Một phần Một phần Được Không Không Không Được Được Được Hạn chế Được Rất hạn chế Rất hạn chế Được Một phần Hạn chế Một phần Hạn chế Không Không Được Khung carbon Được Được Không Không Không Không Được Vị trí nhóm thế Được Được Không Hạn chế Không Không Được Lập thể Được Được Không Hạn chế Không Không Được Phân tích hỗn... với điều kiện có sẵn trong phòng thí nghiệm nên hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết Bạch đầu ông sẽ được đánh giá bằng phương pháp DPPH Do đây là một phương pháp sử dụng gốc tự do hóa học, không thể đánh giá trực tiếp hoạt tính trên cơ thể sống nên cần có một chất chống oxy hóa đối chứng, gọi là chất đối chứng dương Kết quả kháng oxy hóa mạnh hay yếu của các cao chiết sẽ được đánh giá gián tiếp... do DPPH Khả năng kháng oxy hóa của một chất được biểu hiện bằng giá trị IC50, nồng độ chất chống oxy hóa để có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH Giá trị IC50 càng nhỏ, hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh 2.2.4 Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenolic Các hợp chất phenolic là thành phần chủ yếu trong cao chiết thực vật có vai trò như là các chất chống oxy hóa tự nhiên Cơ chế phản ứng của các hợp chất... chương trình của tế bào Vì thế, sự điều hòa các chất chống oxy hóa không đúng cách có thể gây ra các tác động tiêu cực đến cơ thể sống [13] 6 Chất chống oxy hóa là những phân tử có thể ức chế quá trình oxy hóa của các phân tử khác 2.2.2 Các phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa Ở mức độ in vitro, có nhiều phương pháp khác nhau để đánh giá khả năng kháng oxy hóa nhưng nhìn chung rơi vào ba nhóm phương... kinh: Bạch đầu ông, Hy thiêm mỗi vị 15g, Chua me đất, Rau bợ mỗi vị 12g, Sẹ (Alpinia oxyphylla) 6g, sắc uống - Huyết áp cao: Bạch đầu ông, Chua me đất, Hy thiêm mỗi vị 15g, đun sôi lấy nước uống 2.1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước a) Ngoài nước Đã có nhiều công trình nghiên cứu ngoài nước về hoạt tính sinh học của các cao chiết từ Bạch đầu ông Nghiên cứu cho thấy cao methanol có khả năng kháng ... ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA ­­­­­­­­­­ MAI VĂN HIẾU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA BẠCH ĐẦU ÔNG VERNONIA CINEREA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC... nhiều hoạt tính sinh học tiềm thành phần hóa học Do đó, việc đánh giá thành phần hóa học hoạt tính sinh học, Bạch đầu ông cần thiết nhằm làm sáng tỏ thêm nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng, góp phần. .. nước thành phần kháng oxy hóa [Hình 4.5] 4.3 Kết định tính thành phần hóa học Các cao chiết phân đoạn từ Bạch đầu ông tiến hành định tính nhóm chất hóa học Kết định tính sơ cho thấy Bạch đầu ông