KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA, KHÁNG NẤM CỦA TINH DẦU QUÝT HỒNG (Citrus nobilis var. chrysocarpa. Launk)

Tên đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa, kháng nấm của tinh dầu quýt hồng Citrus nobilis var.. Tên đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

QUÝT HỒNG (Citrus nobilis var chrysocarpa Launk)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

QUÝT HỒNG (Citrus nobilis var chrysocarpa Launk)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS NGUYỄN TRỌNG TUÂN

2017

LỜI CẢM ƠN

Để đạt được kết quả như hôm nay, em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý Thầy cô bộ môn Hóa – Khoa Khoa học Tự nhiên Các Thầy cô đã nhiệt tình truyền đạt những kiến thức chuyên ngành, cũng như những kinh nghiệm thực tế Đó là hành trang vô cùng quý báu không chỉ để em hoàn thành luận văn tốt nghiệp mà còn hỗ trợ em rất nhiều trên con đường sự nghiệp của

em sau này

Với lòng biết ơn sâu sắc, em chân thành cảm ơn Thầy Nguyễn Trọng Tuân

đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Quốc Châu Thanh và anh Mai Văn Hiếu đã chia sẻ những kinh nghiệm quý báu, anh Cao Văn Tính lớp Cao học Hóa Hữu cơ K22 đã hỗ trợ và góp ý để em có thể hoàn thành luận văn

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong PTN Hóa sinh 1 và tập thể lớp Hóa dược 2 K39 đã luôn đồng hành, quan tâm, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến cha mẹ và gia đình đã luôn ủng hộ, quan tâm, chăm sóc và tạo mọi điều kiện để con hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2017

Bùi Thị Hạnh

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa khoa học tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn Hóa học ••••••••••••

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Nguyễn Trọng Tuân

2 Tên đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa, kháng

nấm của tinh dầu quýt hồng (Citrus nobilis var chrysocarpa Launk)”

3 Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Hạnh MSSV: B1304040

Lớp: Hóa dược 2 Khóa: 39

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

d Kết luận, kiến nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2017

Cán bộ hướng dẫn

Ts Nguyễn Trọng Tuân

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa khoa học tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn Hóa học ••••••••••••

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện:

2 Tên đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa, kháng

nấm của tinh dầu quýt hồng (Citrus nobilis var chrysocarpa Launk)”

3 Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Hạnh MSSV: B1304040

Lớp: Hóa dược 2 Khóa: 39

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

d Kết luận, kiến nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2017

Cán bộ phản biện

TÓM TẮT

Quýt hồng (Citrus nobilis var chrysocarpa Launk) là loài cây ăn quả có

giá trị kinh tế cao Tuy nhiên vẫn còn ít các nghiên cứu chuyên sâu về chúng Mục đích của luận văn này là khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa, kháng nấm của tinh dầu được chiết từ vỏ và lá quýt hồng Thành phần hóa học của tinh dầu được phân tích bằng hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ

(GC – MS) Cho thấy, trong tinh dầu vỏ quýt hồng có thành phần chính là

α–Limonen chiếm tới 87,08% Ngoài ra, trong tinh dầu vỏ còn có chứa

–Myrcene (4,28%) và α–Pinene (1,44%),… Trong khi đó, các thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá quýt hồng là –Linalool chiếm 26,71%, Germacrene

A chiếm 11,07%, (–)––Elemen chiếm 6,45%, 1–Terpinen–4–ol chiếm 7,19%,

–Ocimene chiếm 5,52% và α–Limonene chiếm 4,7%,… Hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu được xác định bằng phương pháp DPPH Kết quả nghiên cứu cho thấy, tinh dầu lá quýt hồng (IC50 = 6,63 µg/mL) có khả năng kháng oxy hóa hiệu quả hơn tinh dầu vỏ quýt hồng (IC50 = 11,49 µg/mL) Nghiên cứu về khả năng kháng nấm cho thấy, tinh dầu vỏ và lá quýt hồng có khả năng ức chế hai

loài nấm gây hại trên cây trồng là Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp và nấm Achlya gây hại trên thủy sản ở nhiều mức độ khác nhau Trong đó, tinh dầu

lá có khả năng kháng nấm hiệu quả hơn tinh dầu vỏ

Từ khóa: Quýt hồng, Citrus nobilis var chrysocarpa Launk,

Colletotrichum sp., DPPH, Fusarium oxysporum, Achlya, GC – MS, kháng nấm, kháng oxy hóa, tinh dầu

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa khoa học tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn Hóa học ••••••••••••

Năm học 2016 – 2017

Đề tài:

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

KHÁNG OXY HÓA, KHÁNG NẤM CỦA TINH DẦU

QUÝT HỒNG (Citrus nobilis var.chrysocarpa Launk)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi Các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2017

Bùi Thị Hạnh

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ii

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN iii

TÓM TẮT iv

LỜI CAM ĐOAN v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về cây quýt hồng 4

2.1.1 Giới thiệu cây quýt hồng 4

2.1.2 Phân loại học thực vật 5

2.1.3 Công dụng và dược tính 5

2.2 Tổng quan về tinh dầu 5

2.2.1 Giới thiệu về tinh dầu 5

2.2.2 Sự tạo thành và tích lũy tinh dầu trong cây 6

2.2.3 Tinh dầu quýt 7

2.3 Tình hình nghiên cứu tinh dầu quýt 8

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 8

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 8

2.4 Các phương pháp ly trích tinh dầu 9

2.4.1 Phân loại các phương pháp ly trích tinh dầu 9

2.4.2 Tách tinh dầu bằng phương pháp chưng cất 9

2.5 Hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH 11

2.5.1 Giới thiệu về gốc tự do và chất kháng oxi hóa 11

2.5.2 Nguyên tắc của phương pháp DPPH 13

2.6 Giới thiệu về nấm Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp gây hại trên cây trồng và nấm Achlya gây hại trên thủy sản 14

2.6.1 Nấm Fusarium oxysporum 14

2.6.2 Nấm Colletotrichum sp 15

2.6.3 Nấm Achlya 16

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Phương tiện nghiên cứu 17

3.2.1 Dụng cụ và thiết bị 17

3.2.2 Dung môi và hóa chất 17

3.3 Quá trình thực nghiệm 18

3.3.1 Xử lý nguyên liệu 18

3.3.2 Ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 18 3.3.3 Xác định một số chỉ tiêu lý – hóa của tinh dầu quýt hồng 20

3.3.4 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu quýt hồng bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) 22

3.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH 23

3.3.6 Khảo hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp và Achlya của tinh dầu quýt hồng 25

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 28

4.1 Hiệu suất ly trích 28

4.2 Xác định các chỉ tiêu lý – hóa của tinh dầu quýt hồng 28

4.2.1 Đánh giá cảm quan 28

4.2.2 Xác định khối lượng riêng 29

4.2.3 Xác định các chỉ số acid, xà phòng hóa và ester 29

4.3 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu quýt hồng bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC – MS) 30

4.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu quýt hồng 31

4.4.1 Đường chuẩn vitamin C 31

4.4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu vỏ quýt hồng 32

4.4.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu lá quýt hồng 33

4.4.4 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu quýt hồng 34

4.5 Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp và Achlya của tinh dầu quýt hồng 35

4.5.1 Hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum của tinh dầu quýt hồng 35

4.5.2 Hoạt tính kháng nấm Colletotrichum sp của tinh dầu quýt hồng 37

4.5.3 Hoạt tính kháng nấm Achlya của tinh dầu quýt hồng 39

4.5.4 Đánh giá hoạt tính kháng nấm của tinh dầu quýt hồng 41

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 47

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn vitamin C 24

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu vỏ quýt hồng 24

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu lá quýt hồng 25

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm của tinh dầu quýt hồng 27

Bảng 4.1 Kết quả xác định khối lượng riêng của tinh dầu vỏ và lá quýt hồng 29 Bảng 4.2 Kết quả xác định chỉ số acid của tinh dầu vỏ và lá quýt hồng 29

Bảng 4.3 Kết quả xác định chỉ số xà phòng hóa của tinh dầu vỏ và lá quýt hồng 29

Bảng 4.4 Thành phần hóa học của tinh dầu vỏ quýt hồng 30

Bảng 4.5 Thành phần hóa học của tinh dầu lá quýt hồng 30

Bảng 4.6 Kết quả kháng oxy hóa của vitamin C 31

Bảng 4.7 Kết quả kháng oxy hóa của tinh dầu vỏ quýt hồng 32

Bảng 4.8 Kết quả kháng oxy hóa của tinh dầu lá quýt hồng 33

Bảng 4.9 Kết quả khả năng kháng nấm Fusarium oxysporum của tinh dầu vỏ quýt hồng 35

Bảng 4.10 Kết quả khả năng kháng nấm Fusarium oxysporum của tinh dầu lá quýt hồng 36

Bảng 4.11 Kết quả khả năng kháng nấm Colletotrichum sp của tinh dầu vỏ quýt hồng 37

Bảng 4.12 Kết quả khả năng kháng nấm Colletotrichum sp của tinh dầu lá quýt hồng 38

Bảng 4.13 Kết quả khả năng kháng nấm Achlya của tinh dầu vỏ quýt hồng 39

Bảng 4.14 Kết quả khả năng kháng nấm Achlya của tinh dầu lá quýt hồng 40

Bảng 4.15 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tinh dầu vỏ quýt hồng, lá quýt hồng và chất đối chứng dương trên 3 loài nấm Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp và Achlya 41

DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Quả quýt hồng (trái) và lá quýt hồng (phải) 4

Hình 2.2 Tinh dầu quýt thương mại 7

Hình 2.3 Phản ứng loại bỏ gốc tự do DPPH 13

Hình 2.4 Đĩa nấm Fusarium oxysporum 14

Hình 2.5 Đĩa nấm Colletotrichum sp 15

Hình 2.6 Đĩa nấm Achlya 16

Hình 3.1 Quy trình ly trích tinh dầu quýt bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 19

Hình 4.1 Tinh dầu lá (trái) và vỏ (phải) của quýt hồng 28

Hình 4.2 Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ của vitamin C 31

Hình 4.3 Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ của tinh dầu vỏ quýt hồng 32

Hình 4.4 Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH theo nồng độ của tinh dầu lá quýt hồng 33

Hình 4.5 Giá trị IC50 của vitamin C và tinh dầu vỏ quýt hồng, lá quýt hồng 34 Hình 4.6 Phần trăm ức chế nấm Fusarium oxysporum theo nồng độ của tinh dầu vỏ quýt hồng 36

Hình 4.7 Phần trăm ức chế nấm Fusarium oxysporum theo nồng độ của tinh dầu lá quýt hồng 37

Hình 4.8 Phần trăm ức chế nấm Colletotrichum sp theo nồng độ của tinh dầu vỏ quýt hồng 38

Hình 4.9 Phần trăm ức chế nấm Colletotrichum sp theo nồng độ của tinh dầu lá quýt hồng 39

Hình 4.10 Phần trăm ức chế nấm Achlya theo nồng độ của tinh dầu vỏ quýt hồng 40

Hình 4.11 Phần trăm ức chế nấm Achlya theo nồng độ của tinh dầu lá quýt hồng 41

tự do tấn công mỗi ngày Mặc dù, cơ thể có những chất kháng oxy hóa nội sinh nhưng vẫn không đủ khả năng duy trì sự cân bằng các gốc tự do trong cơ thể

Do vậy, việc cung cấp thêm các chất kháng gốc tự do từ bên ngoài vào cơ thể

là cần thiết Hiện nay, trên thị trường, có nhiều sản phẩm thương mại có hiệu quả cao trong việc kháng gốc tự do như butylated hydroxytoluene (BHT) và butylated hydroxyanisole (BHA) Tuy nhiên, các sản phẩm này đều là những sản phẩm hóa tổng hợp trong công nghiệp Mặc dù, các sản phẩm này đều có hiệu quả cao nhưng lại gây ra nhiều tác dụng phụ và có thể dẫn đến ung thư [1] Thêm vào đó, càng ngày càng có nhiều mối quan tâm về việc sử dụng các hoạt chất sinh học để ngăn chặn sự tàn phá của nấm hại trong những năm gần đây, nhằm giảm tác động tiêu cực tiềm ẩn của thuốc diệt nấm hóa học có thể gây ra đối với môi trường Nấm bệnh gây thiệt hại nặng nề cho cây trồng và các loại trái cây sau thu hoạch trên toàn thế giới [2] Nhiều loại hóa chất độc hại đã được sử dụng để ngăn chặn và diệt nấm trong các môi trường khác nhau Tuy nhiên, biện pháp hóa học đôi khi không còn hiệu quả do mầm bệnh nảy sinh nòi kháng thuốc, gây ô nhiễm môi trường, gây hại cho cây trồng và các loài sinh vật khác Cụ thể như: các loại thuốc vô cơ có chứa gốc đồng có thể gây hại cho cá

và con người, các loại thuốc có nguồn gốc tổng hợp như kitazin, hexaconazole,

và các dẫn xuất halogeno benzene,… gây độc cho các loài sinh vật và tích lũy lâu dài trong môi trường [3] Một số loại thuốc trừ nấm hóa học quan trọng như: anilinopyrimidine, benzimidazoles, thuốc ức chế demethylation, dicarboximide, phenylpyrrole và strobilurin đã bị mất hiệu quả trong việc chống lại các loài nấm gây hại [4] Chính vì vậy, để giảm nguy cơ mắc bệnh, tăng năng suất cây trồng cũng như đảm bảo sự an toàn của thực phẩm và môi trường thì việc nghiên cứu, tìm ra một phương pháp vừa có khả năng loại bỏ gốc tự do và diệt nấm an toàn hơn cần được quan tâm tìm hiểu

Quýt là loài cây ăn quả được trồng phổ biến ở Việt Nam Từ xa xưa, quýt được xem là một dược liệu được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian dùng chữa ho, tức ngực, lợi tiểu, viêm gan, sốt rét,…[5] Quýt chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể, nhất là vitamin C Với hàm lượng vitamin C cao, quýt có khả năng chống oxi hóa mạnh, đẩy nhanh quá trình làm lành vết

thương và tổng hợp collagen trong da, tăng khả năng hấp thu chất sắt trong thực phẩm, đồng thời giúp cải thiện sức khỏe, hỗ trợ giảm cân Tinh dầu quýt

có chứa: Limonene (60,74%), γ−Terpinene (10,04%), β−Myrcene (7,43%),

α−Pinene (3,93%), β−Pinene (2,16%), Terpinolene (1,30%), α−Thujene

(1,07%), β−Phellandrene (1,00%), 2−Carene (0,96%), β−Ocimene (0,33%),… Nghiên cứu cho thấy tinh dầu quýt có thể tạo ra độc tố trong tế bào Penicillium

italicum và Penicillium digitatum Từ đó, tinh dầu quýt có thể là chất kháng

nấm tự nhiên trong việc bảo quản cam quýt sau thu hoạch [6] Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa cho thấy tinh dầu quýt có khả năng kháng oxy hóa mạnh

Ngoài ra, tinh dầu quýt còn có khả năng kháng khuẩn Microcococus roseus,

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,… và kháng nấm Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Saccharomyces cerevisae,… khá tốt Nghiên cứu còn

cho thấy tinh dầu quýt có hiệu quả trong việc giảm nồng độ glucose trong máu

ở thỏ trong điều trị bệnh đái tháo đường [7] Tuy nhiên, ở Việt Nam vẫn còn rất

ít các nghiên cứu chuyên sâu về quýt, đặc biệt là quýt hồng (Citrus nobilis var

chrysocarpa Launk) Một số nghiên cứu gần đây cho thấy tinh dầu quýt hồng

có khả năng kháng khuẩn mạnh [8] Tuy nhiên, những nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa, kháng nấm của tinh dầu quýt hồng vẫn còn rất hạn chế Vì vậy,

đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa, kháng

nấm của tinh dầu quýt hồng (Citrus nobilis var chrysocarpa Launk)” sẽ góp

phần làm rõ hơn về quýt hồng Từ đó, đóng góp vào việc nghiên cứu và sử dụng hiệu quả cây quýt hồng, góp phần làm tăng giá trị kinh tế của loài cây này

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa, kháng

nấm của tinh dầu quýt hồng (Citrus nobilis var chrysocarpa Launk)” bao gồm:

- Ly trích tinh dầu vỏ và lá quýt bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

- Xác định chỉ số lý – hóa của tinh dầu vỏ và lá quýt

- Khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu vỏ và lá quýt bằng hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GC–MS)

- Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa ở mức độ in vitro của tinh dầu vỏ và

lá quýt bằng phương pháp DPPH

- Đánh giá hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp gây hại trên cây trồng và nấm Achlya gây hại trên thủy sản của tinh dầu vỏ và

lá quýt

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Tìm hiểu về quýt hồng (Citrus nobilis var chrysocarpa Launk)

- Tiến hành thu hái, xử lý nguyên liệu vỏ và lá quýt

- Tiến hành ly trích tinh dầu vỏ và lá quýt bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

- Xác định các chỉ số lý – hóa của tinh dầu vỏ và lá quýt bao gồm: đánh giá cảm quan, khối lượng riêng, chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số ester

- Xác định thành phần hóa học của tinh dầu vỏ và lá quýt bằng hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu vỏ và lá quýt bằng phương pháp DPPH

- Khảo sát hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp gây hại trên cây trồng và nấm Achlya gây hại trên thủy sản của tinh dầu vỏ và

lá quýt

- Tổng hợp đánh giá kết quả và viết báo cáo

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây quýt hồng

2.1.1 Giới thiệu cây quýt hồng

Quýt hồng hay còn gọi là quýt tiều là loại trái cây đặc sản của đồng bằng sông Cửu Long Huyện Lai Vung (Đồng Tháp) nằm ven sông Hậu được phù sa bồi đắp, đất đai màu mỡ cộng với khí hậu mưa thuận gió hòa thích hợp để chuyên canh cây quýt hồng

Quýt hồng thuộc loại rễ trụ, có rễ nhánh rất phát triển, rễ thường tập trung gần lớp đất mặt, thích hợp với đất có sa cấu sét nhẹ, thoáng khí, không bị phân

rã khi gặp mưa Quýt hồng thuộc loại cây gỗ, dạng bán bụi, cành phân tán mạnh, cao khoảng 2 – 8 m Thân và cành có gai, cành phát triển theo lối hợp trục Lá quýt thuộc dạng lá đơn, mọc xen, thắc ở giữa chia lá thành cánh lá và phiến lá,

lá có cuốn lá, gân lá hình lông chim, lá bóng dày có chứa tinh dầu Hoa thuộc dạng hoa chùm, có 6 cánh hoa xếp thành hai vòng, nhị hợp Bầu noãn có 6 – 10 ngăn Hoa có mùi thơm hấp dẫn côn trùng Trái có hình cầu dẹp ở hai đầu, đỉnh

và đáy trái lõm, có từ 6 – 10 múi, vỏ có quả màu vàng cam đặc trưng và không

có lớp vỏ trắng xốp Mặt ngoài vỏ có lớp sừng chứa nhiều túi tinh dầu [9]

Hình 2.1 Quả quýt hồng (trái) và lá quýt hồng (phải)

Chi: Citrus Loài: Citrus nobilis var chrysocarpa Launk [10]

2.1.3 Công dụng và dược tính

Theo Đông y, quýt có vị chua ngọt, tính mát, có tác dụng giải khát, bổ phổi, trừ đờm Vỏ quýt và lá quýt đều có tinh dầu, có tác dụng chữa ho đờm và giúp tiêu hoá Vỏ quả chín (trần bì) dùng chữa ho, tức ngực, cổ có đờm, trúng thực, đầy bụng, đau bụng, ợ hơi, nôn mửa, lợi tiểu,… Vỏ quả xanh (thanh bì) dùng để chữa viêm gan, tức ngực, sốt rét Hạt quýt có tác dụng chữa sa ruột, viêm tuyến vú, tắc tia sữa Lá dùng để chữa tức ngực, ho, đau bụng, sưng vú, núm vú nứt lở [5]

Quýt dùng để ăn tươi, vắt lấy nước và là thức uống bổ dưỡng đặc biệt đối với người bệnh, sức khoẻ suy nhược Quýt chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể, nhất là vitamin C Với hàm lượng vitamin C cao, quýt có khả năng kháng oxy hóa mạnh, đẩy nhanh quá trình làm lành vết thương và tổng hợp collagen trong da, tăng khả năng hấp thu chất sắt trong thực phẩm, giúp cải thiện sức khỏe, hỗ trợ giảm cân Tinh dầu quýt được sử dụng rộng rãi trong các công thức chăm sóc da, có khả năng sát trùng, giúp trẻ hóa da Với hương thơm, tinh dầu quýt tạo một cảm giác dễ chịu, do đó nó được dùng cho những người căng thẳng và mất ngủ [6]

2.2 Tổng quan về tinh dầu

2.2.1 Giới thiệu về tinh dầu

Tinh dầu là những chất có mùi, có nguồn gốc từ thực vật như tinh dầu hoa hồng, hoa lài, bạc hà, long não,… hay từ động vật như tinh dầu cà cuống, xạ hương,… Tinh dầu là hỗn hợp nhiều chất dễ bay hơi, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu Trong tự nhiên, tinh dầu thường

ở trạng thái tự do và chỉ một số ít ở trạng thái tiềm tàng Tinh dầu có nhiều trong

họ long não, họ hoa môi, họ cam, họ sim, họ hoa tán Tinh dầu có trong các bộ phận khác nhau của cây như ở hoa (hồng, nhài, cam, chanh,…), ở lá (bạch đàn,

bạc hà, hương nhu, ), ở vỏ cây (quế), ở thân cây (hương đàn), ở rễ (gừng, nghệ, xuyên khung,…) Tinh dầu chứa trong các bộ máy tiết khác nhau, như tế bào tiết (họ long não, họ gừng), biểu bì tiết (họ hoa hồng), ống tiết (họ thông), túi tiết (họ sim) Hàm lượng tinh dầu trong những cây khác nhau cũng rất khác nhau, hoa hồng hàm lượng tinh dầu khoảng 0,25%, bạc hà hàm lượng tinh dầu khoảng 1%, quả hồi và nụ đinh hương hàm lượng tinh dầu có thể đạt giá trị lần lượt là 5% và 15% [11]

Thành phần của tinh dầu là hỗn hợp các chất hữu cơ thuộc loại mạch thẳng, mạch vòng Những mạch này có thể là terpene, dẫn xuất của terpene, dẫn xuất của benzene,… Những cấu tử của tinh dầu thường là hydrocacbon, alcohol, keton, aldehyde, ether và ester,…[11]

Ở nhiệt độ thường, tinh dầu ở thể lỏng trừ một số trường hợp như menthol, camphor,… ở thể rắn Tinh dầu dễ bay hơi, ít tan trong nước, tan tốt trong cồn

và các dung môi hữu cơ, có thể tan một phần trong dung dịch kiềm Đa số tinh dầu không có màu hoặc màu vàng nhạt, một số ít có màu như tinh dầu quế có màu nâu sẫm Tinh dầu có vị cay và hắc Tỷ trọng của tinh dầu thường vào khoảng 0,85 – 0,95, một số tinh dầu nặng hơn nước như tinh dầu đinh hương, tinh dầu quế Tinh dầu có chỉ số khúc xạ vào khoảng 1,45 – 1,56 Nếu thành phần hóa học của tinh dầu có nhiều nối đôi thì có chỉ số khúc xạ cao hơn Vì tinh dầu là hỗn hợp nên không có nhiệt độ sôi xác định, điểm sôi của tinh dầu thay đổi tùy theo thành phần của hợp chất Khi hạ nhiệt độ một số tinh dầu có thể kết tinh như tinh dầu hồi, tinh dầu bạc hà,… Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng, không khí, nước,… tinh dầu dễ bị oxy hóa và nhựa hóa một phần [11]

2.2.2 Sự tạo thành và tích lũy tinh dầu trong cây

Sự tạo thành tinh dầu trong cây cho đến ngày nay vẫn chưa có một lý thuyết nào chứng minh bằng thực nghiệm thật đầy đủ Một số giả thuyết cho rằng đầu tiên protid và glucid được tạo thành và sau đó từ những chất này tạo

ra tinh dầu Tinh dầu tạo thành luôn thay đổi tùy thuộc vào mức độ phát triển của cây, kết hợp với chức năng của chúng ở từng giai đoạn (ra hoa, kết quả hoặc mất đi các chất dinh dưỡng dự trữ,…) Sự thay đổi tinh dầu trong cây có xu huớng tích lũy dần những hợp chất oxy nhiều hơn các hợp chất khác [12] Tinh dầu trong cây đuợc tạo ra và tích trữ trong các mô Ở các cây khác nhau, tinh dầu chứa trong các bộ máy tiết khác nhau [12]:

- Tế bào tiết: tinh dầu được tiết ra rồi giữ trong các tế bào (mô tiết), ví dụ trong cánh hoa hồng, trong củ gừng,…

- Ống tiết: cách tạo ra tinh dầu giống như túi tiết nhưng nằm sâu trong phần gỗ và chạy dài sẹo sớ gỗ

2.2.3 Tinh dầu quýt

Thành phần chính của tinh dầu là các hợp chất hydrocacbon, monoterpenic

(Limonene và γ–Terpinene), các hợp chất tạo mùi thơm đặc biệt như các

aldehyde và các alcohol (<1%) Hàm lượng các thành phần trong tinh dầu sẽ thay đổi tùy thuộc vào bộ phận thu tinh dầu cũng như cũng như đất đai, khí hậu của từng vùng trồng [11]

Hình 2.2 Tinh dầu vỏ quýt thương mại

Nguồn: http://lifeshop.vn/sp/tinh-dau-vo-quyt-mandarin.html

Tinh dầu quýt được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm, dùng để pha chế thức uống, bánh kẹo Ngoài ra, tinh dầu quýt còn được dùng trong công nghệ nước hoa và các hợp hương của các sản phẩm chăm sóc cá nhân Đặc biệt, tinh dầu quýt còn được dùng như một dược liệu quý: giúp ngăn ngừa bệnh đái tháo đường, chống co thắt gây ra các cơn ho hay bệnh đường ruột, dễ tiêu hóa, chống đầy hơi, giảm đau, kháng khuẩn, an thần,…[6]

2.3 Tình hình nghiên cứu tinh dầu quýt

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nhiều nghiên cứu cho thấy, cho thấy thành phần của tinh dầu vỏ quýt là

Limonen (96,66%), β–Myrcene (2,11%), β–Pinen (0,20%), Sabinen (0,11%)

Tinh dầu lá quýt thì chủ yếu là Linalool (56,41%), ngoài ra còn chứa Sabinen

(3,38%), β–Pinen (14,19%), β–Elemene (6,27%), Limonen (1,31%) và

(E)–β–Ocimen (3,64%),… Nghiên cứu cho thấy tinh dầu quýt có khả năng

kháng khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633 và vi nấm Candida albicans ATCC

1023 khá tốt [8]

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá từ 6 loài quýt (Citrus reticulata

Blanco) trồng ở Nigeria đã được thực hiện Cho thấy, trong lá của 6 loại quýt

có 57 thành phần được xác định, trong đó tinh dầu chiếm 88,2 – 96,7% Thành

phần chính trong tinh dầu là Sabinene, γ–Terpinene, p–Xymen, δ–3–Carene và

β–Ocimene Ngoài ra còn có Linalool, Myrcene, Terpinen–4–ol và cis–

Sabinenehydrate,…[13]

Nghiên cứu năm 2014, đã công bố thành phần hóa học và hoạt tính kháng nấm của tinh dầu quýt Thành phần hóa học trong tinh dầu bao gồm: Limonene

(60,74%), γ–Terpinene (10,04%), β–Myrcene (7,43%), α–Pinene (3,93%),

β−Pinene (2,16%), Terpinolene (1,30%), α–Thujene (1,07%), β–Phellandrene

(1,00%), 2–Carene (0,96%), β–Ocimene (0,33%),… Tinh dầu quýt có thể tạo ra độc tố trong tế bào Penicillium italicum và Penicillium digitatum Từ đó, tinh

dầu quýt có thể là chất kháng nấm tự nhiên trong việc bảo quản cam quýt sau thu hoạch [6]

Năm 2013, nghiên cứu hoạt tính của tinh dầu vỏ và lá quýt Citrus

reticulata Blanco cv Murcot loại quả quan trọng và phổ biến ở Pakistan Nghiên

cứu hoạt tính kháng oxy hóa ở in vitro bằng phương pháp DPPH và ABTS cho

thấy tinh dầu vỏ và lá đều có khả năng kháng oxy hóa mạnh, nhưng lá kháng tốt hơn vỏ Nghiên cứu còn cho thấy tinh dầu vỏ và lá có khả năng kháng khuẩn

Microcococus roseus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,… và kháng

nấm Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Saccharomyces cerevisae,…

khá tốt Nghiên cứu cho thấy tinh dầu vỏ và lá quýt có hiệu quả trong việc giảm nồng độ glucose trong máu ở thỏ trong điều trị bệnh tiểu đường [7]

2.4 Các phương pháp ly trích tinh dầu

2.4.1 Phân loại các phương pháp ly trích tinh dầu

Phương pháp ly trích phụ thuộc vào từng loại tinh dầu, giá trị thương mại, khả năng tách, độ bền nhiệt và dạng nguyên liệu ban đầu Nhìn chung, các phương pháp ly trích tinh dầu cần phải thỏa mãn những yêu cầu sau [11]:

- Giữ cho tinh dầu thu được có mùi vị tự nhiên ban đầu

- Qui trình chế biến phải phù hợp, thuận lợi và nhanh chóng

- Phải tách triệt để tinh dầu trong nguyên liệu, lượng tinh dầu mất đi trong quá trình chế biến và hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu sau khi chế biến (bã) càng thấp càng tốt

- Phương pháp lên men

2.4.2 Tách tinh dầu bằng phương pháp chưng cất

Trong quá trình chưng cất, cùng với sự thay đổi thành phần của hỗn hợp lỏng có thể làm thay đổi thành phần của hỗn hợp hơi Trong điều kiện áp suất không đổi, dung dịch lỏng mà thu được bằng cách ngưng tụ hỗn hợp hơi bay ra

sẽ có thành phần cấu tử dễ bay hơi cao hơn so với chất lỏng ban đầu, nếu tiếp tục chưng cất thì thành phần dễ bay hơi trong chất lỏng ban đầu càng ít và trong chất lỏng sau ngưng tụ càng nhiều Nếu ngưng tụ theo thời gian thì có thể thay đổi thành phần của tinh dầu sau ngưng tụ so với thành phần của tinh dầu có trong nguyên liệu Nhằm mục đích nâng cao chất lượng tinh dầu [11]

2.4.2.1 Chưng cất với nước

Nguyên liệu và nước cùng cho vào một thiết bị Khi đun sôi, hơi nước bay

ra sẽ cuốn theo tinh dầu, ngưng tụ hơi bay ra sẽ thu được hỗn hợp gồm nước và tinh dầu, hai thành phần này không tan vào nhau nên dễ dàng tách [11]

Phương pháp này đơn giản, thiết bị rẻ tiền và dễ chế tạo, phù hợp với những cơ sở sản xuất nhỏ, vốn đầu tư ít Tuy nhiên, phương pháp này có hiệu

suất thấp, chất lượng tinh dầu không cao do nguyên liệu tiếp xúc trực tiếp với thiết bị nên dễ bị cháy khét, khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật như tốc độ và nhiệt độ chưng cất [11]

2.4.2.2 Chưng cất bằng hơi nước không có nồi hơi riêng

Nguyên liệu và nước dùng cho vào một thiết bị nhưng cách nhau bởi một

vỉ nồi Khi đun sôi, hơi nước bốc lên qua khối nguyên liệu kéo theo tinh dầu đi

ra thiết bị ngưng tụ Để nguyên liệu khỏi rơi vào phần có nước ta có thể lót trên

vỉ một hay nhiều lớp bao tải tùy theo từng loại nguyên liệu [11]

Phương pháp này phù hợp với những cơ sở sản xuất có qui mô trung bình

So với phương pháp trên, phương pháp này có ưu điểm hơn, nguyên liệu ít bị cháy khét vì không tiếp xúc trực tiếp với đáy thiết bị, các nhược điểm khác vẫn chưa khắc phục được Phương pháp này thích hợp cho những loại nguyên liệu không chịu được nhiệt độ cao [11]

2.4.2.3 Chưng cất bằng hơi nước có nồi hơi riêng

Phương pháp này phù hợp với những cơ sở sản xuất lớn, hơi nước được tạo ra từ một nồi hơi riêng và được dẫn vào các thiết bị chưng cất Phương pháp này cùng một lúc có thể phục vụ được cho nhiều thiết bị chưng cất, điều kiện làm việc của công nhân nhẹ nhàng hơn, dễ cơ khí hóa và tự động hóa các công đoạn sản xuất, khống chế tốt hơn các thông số công nghệ, rút ngắn được thời gian sản xuất Ngoài ra, phương pháp này đã khắc phục được tình trạng nguyên liệu bị khét Tuy nhiên, một số tinh dầu chưng cất ở nhiệt độ và áp suất cao sẽ

bị phân hủy làm giảm chất lượng Hơn nữa, các thiết bị sử dụng trong phương pháp này khá phức tạp và đắt tiền [11]

2.4.2.4 Những ưu, nhược điểm chung của phương pháp chưng cất

Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước sử dụng thiết bị khá gọn, dễ chế tạo, qui trình sản xuất đơn giản Trong quá trình chưng cất, có thể phân chia các cấu tử trong hỗn hợp bằng cách ngưng tụ từng phần theo thời gian Thời gian chưng cất tương đối nhanh, nếu thực hiện gián đoạn chỉ cần 5 – 10 giờ, nếu liên tục thì 30 phút đến 1 giờ Tuy nhiên, không áp dụng phương pháp chưng cất với

những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp vì thời gian chưng cất sẽ kéo dài

Tinh dầu thu được có thể bị giảm chất lượng nếu có chứa các cấu tử dễ bị thủy

phân Không có khả năng tách các thành phần khó bay hơi hoặc không bay hơi trong nguyên liệu ban đầu như sáp, nhựa thơm, Hàm lương tinh dầu còn lại

trong nước chưng (nước sau phân ly) tương đối lớn Tiêu tốn một lượng nước khá lớn để làm ngưng tụ hỗn hợp hơi [11]

2.5 Hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH

2.5.1 Giới thiệu về gốc tự do và chất kháng oxi hóa

2.5.1.1 Gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử mà ở lớp ngoài cùng có những electron chưa ghép đôi Vì có năng lượng cao và kém bền nên các gốc tự do dễ dàng tham gia vào các phản ứng oxy hóa – khử, polymer hóa, phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, ADN,… gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể Đồng thời, khi một phân tử bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, sau đó lại tiếp tục tấn công các phân tử khác, tạo nên một phản ứng dây chuyền gây ra các biến đổi có hại cho cơ thể Gốc tự do cũng có thể tồn tại độc lập, nhưng chỉ trong khoảng thời gian rất ngắn Chúng cũng có thể kết hợp với nhau tạo nên một phân tử mới [14]

2.5.1.2 Nguồn gốc phát sinh gốc tự do

a) Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh

Là những gốc tự do được hình thành do các quá trình chuyển hóa tự nhiên trong cơ thể Chẳng hạn như trong chuỗi truyền điện tử của quá trình hô hấp tế bào, một số điện tử có thể bị rò rỉ, sau đó chúng tương tác với oxy và hình thành nên gốc superoxide Khoảng 2 – 5% oxy sử dụng cho sự trao đổi chất hiếu khí trong ti thể chuyển hóa thành gốc tự do có nhóm oxy hoạt động (reactive oxygen species ROS) Bên cạnh đó, quá trình thực bào của các tế bào bạch cầu khi có sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể cũng sinh ra các gốc tự do, thông qua việc hoạt hóa enzyme NADPH – oxidase ở màng bạch cầu, enzyme này xúc tác cho phản ứng giữa oxy và NADPH tạo nên gốc tự do superoxide O2—, từ đó tạo ra nhiều gốc tự do khác nhằm tiêu diệt các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể [14]

b) Gốc tự do có nguồn gốc ngoại sinh

Gốc tự do ngoại sinh hình thành do các yếu tố bên ngoài như ô nhiễm môi trường, tác động của tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời, thuốc lá, rượu bia, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong thức ăn,… Việc sử dụng nhiều loại thuốc trị bệnh cũng có thể tạo ra các gốc tự do như các kháng sinh có nhóm quinoid, thuốc chống ung thư bleomycin và các loại thuốc cản trở sự phát triển của tế bào Hút thuốc cũng như hít phải khói thuốc lá gây ra những tổn thương cho đường hô hấp, mà nguyên nhân một phần là do lượng lớn các gốc tự do bền trong nhựa thuốc như semiquinon có dẫn xuất từ quinon và hydroquinon có trong khói thuốc lá gây ra những tổn thương cho phế nang [14]

2.5.1.3 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể

Khi số lượng gốc tự do nằm trong khả năng kiểm soát của cơ thể, chúng đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống của cơ thể Chẳng hạn như quá trình hô hấp tế bào có bản chất là chuỗi phản ứng oxy hóa – khử và các gốc

tự do là các sản phẩm trung gian của chuỗi phản ứng này Gốc tự do còn có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch của cơ thể, góp phần tiêu diệt các sinh vật có hại xâm nhập vào cơ thể; đồng thời loại bỏ các tế bào già, tế bào chết trong cơ thể, tạo điều kiện cho các tế bào mới khỏe mạnh sinh trưởng và phát triển Ngoài

ra, gốc tự do còn góp phần ức chế, tiêu diệt các tế bào bất thường như tế bào ung thư [14]

2.5.1.4 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể

Khi cơ thể ở trạng thái khỏe mạnh có khả năng sinh ra các chất kháng oxy hóa giúp trung hòa lượng gốc tự do sinh ra trong quá trình chuyển hóa của cơ thể cũng như các gốc tự do ngoại sinh Thế nhưng khi bước sang tuổi trung niên hay khi sức khỏe suy yếu, cân bằng vốn có giữa gốc tự do và chất kháng oxy hóa bị phá vỡ, kéo theo đó là hàng loạt chuỗi phản ứng bất lợi lên các phân tử lipid, protein, acid nucleic của tế bào Điều này dẫn đến hàng loạt các tổn thương

và kết quả là sự hoạt động bất thường của các cơ quan [14]

Các gốc tự do tấn công lên màng tế bào, làm màng tế bào mất dần chức năng sinh học, quá trình trao đổi chất từ đó bị cản trở, các mô dần bị thoái hóa

và sau cùng dẫn đến sự chết tế bào Hậu quả từ sự tấn công đó là hàng loạt các bệnh như Parkinson, Alzheimer, các bệnh về thần kinh, tim mạch, đái tháo đường, suy giảm hệ thống miễn dịch, ung thư,… Ngoài ra, khi cơ thể bị yếu đi, hiệu suất làm việc của hệ thống enzyme sửa sai với nhiệm vụ loại đi những điểm

bị hư hỏng ADN cũng giảm đi Khi đó, gốc tự do dễ dàng tấn công nhóm đường deoxyribose và base nitơ của nhóm purin, pirimidin của ADN, sinh ra các thể đột biến gây hại cho cơ thể [14]

ngăn cản sự hình thành của gốc tự do [14]

Phân loại chất kháng oxy hóa:

Chất kháng oxy hóa có bản chất enzyme: đây là một hệ thống các chất kháng oxy hóa nội sinh tồn tại chủ yếu ở tế bào, nhằm duy trì căn bằng giữa lượng gốc tự do và chất kháng oxy hóa trong cơ thể, giúp bảo vệ tế bào khỏi sự tấn công do gốc tự do gây ra trong các quá trình sinh lí và bệnh lí Hệ thống này gồm các enzyme: superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalate [14] Chất kháng oxy hóa không bản chất enzyme: bên cạnh các chất kháng oxy hóa có bản chất enzyme có nguồn gốc nội sinh, cơ thể còn có các chất kháng oxy hóa không mang bản chất enzyme cũng có nguồn gốc nội sinh như vitamin

A, glutathione, glycin, methionine,… và các chất kháng oxy hóa ngoại sinh có trong thực phẩm như vitamin C, vitamin E, flavonoid, lignan, alkaloid, courmarin, terpene, carotenoid,…[14]

2.5.2 Nguyên tắc của phương pháp DPPH

Phương pháp DPPH thường được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế

gốc tự do ở mức độ in vitro vì đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, nhanh

chóng và ổn định DPPH (1,1–Diphenyl–2–picrylhydrazyl) là gốc tự do ổn định, bền ở nhiệt độ thường, dạng bột màu đen và có màu tím đặc trưng trong dung môi (thường dùng methanol hoặc ethanol) Gốc tự do DPPH có bước sóng hấp thu cực đại ở 517 nm Phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH dựa trên sự chuyển electron trong dung môi Độ hấp thu của nó giảm khi nguyên tử N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hoặc hydro từ chất kháng oxy hóa (dung dịch DPPH

từ màu đen tím chuyển sang màu vàng) [15]

Diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl

Hình 2.3 Phản ứng loại bỏ gốc tự do DPPH

Kết quả kháng oxy hóa mạnh hay yếu của mẫu thử được đánh giá gián tiếp bằng cách đối chiếu với các chất đối chứng dương như trolox, tocopherol, gallic acid,… Tuy nhiên chất đối chứng dương được sử dụng phổ biến là vitamin C bởi vai trò sinh học quan trọng của nó trong cơ thể Hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH được biểu diễn bằng giá trị IC50 (Half Maximal Inhibitory Concentration) IC50 được định nghĩa là nồng độ của chất mà tại đó

nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme Do đó, IC50 được dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp [15]

2.6 Giới thiệu về nấm Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp gây hại trên cây trồng và nấm Achlya gây hại trên thủy sản

Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium oxysporum: sợi nấm có sắc tố biến

đổi từ trắng đến tím, tản nấm thường sinh sắc tố màu hồng đến tím đậm trên môi trường PDA Nấm sinh sản vô tính bằng tiểu bào tử đính và đại bào tử đính Tiểu bào tử có kích thước nhỏ, thường không có vách ngăn và được hình thành trong bọc giả gắn trên cành bào đài ngắn Đại bào tử có dạng hình thoi hoặc hình liềm có từ 3 – 5 vách ngăn Trong khối bào tử, đại bào tử thon hơn và có

có chiều dài trung bình Nấm tồn tại trong đất dưới dạng bào tử áo trong thời gian dài (từ 15 đến 20 năm) Bào tử áo có sức chống chịu cao, được hình thành trong mô bệnh [16]

Hình 2.4 Đĩa nấm Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum xâm nhiễm chủ yếu qua vết thương và qua cửa khẩu

tự nhiên như đỉnh của rễ hoặc các rễ bên Khi cây trồng bị nhiễm bệnh, cây có thể không chết nhưng bị ức chế sinh trưởng và giảm năng suất đáng kể Trong điều kiện mầm bệnh có mật số cao hoặc cây ký chủ dễ bị xâm nhiễm thì cả quần thể có thể bị héo và chết trong thời gian ngắn Nấm sinh trưởng tốt ở nhiệt độ khoảng 28 – 33°C, có phạm vi pH khá rộng, sinh trưởng tốt ở pH từ 6 – 7 [16]

2.6.2 Nấm Colletotrichum sp

Nấm Colletotrichum sp thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) bộ đĩa đài (Molanconiales) Colletotrichum sp thuộc nhóm bán ký sinh bắt buộc, tồn

tại dưới nhiều dạng khác nhau như tồn tại trong hạt, trên tàn dư của cây trồng

và trên cây ký chủ Colletotrichum sp phát triển ở giữa các vách tế bào ký chủ,

trong quá trình phát triển chúng tiết ra enzyme và độc tố để phân hủy vách tế

bào và nguyên sinh chất của ký chủ Colletotrichum sp sinh trưởng, phát triển

và hình thành bào tử thuận lợi trên môi trường PDA và môi trường tổng hợp Trên môi trường PDA, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm Sợi nấm có vách ngăn và dịch trong suốt [16]

Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây trồng, bệnh chủ yếu gây hại

trên lá của hầu hết các loại cây trồng, đặc biệt phổ biến ở vùng nhiệt đới và vùng

cận nhiệt đới Phạm vi ký chủ của Colletotrichum sp có khoảng 70 loại cây

trồng khác nhau bao gồm các ký chủ chính như: điều, đu đủ, bông, bơ, cà chua,

cà phê, cam, chanh, cao su, phong lan và các ký chủ phụ khác như các loại đậu,

bí ngô, dưa, vải,… Colletotrichum sp xâm nhiễm trên những phần đã chết hay

những bộ phận bị tổn thương của cây trồng Trong điều kiện có độ ẩm và nhiệt

độ cao nấm gây hại rất nghiêm trọng Colletotrichum sp phát triển tốt ở nhiệt

độ từ 20 – 30°C và độ ẩm cao, pH tối ưu cho nấm phát triển từ 7 – 8 và pH thích hợp cho bào tử nảy mầm là từ 5 – 6 Bên cạnh đó, khi có sự chiếu sáng trực tiếp của ánh nắng sẽ làm ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm [16]

Hình 2.5 Đĩa nấm Colletotrichum sp

2.6.3 Nấm Achlya

Nấm Achlya là nấm bậc thấp; thuộc ngành Heterokonta, lớp Oomycetea,

bộ Saprolegniales, họ Saprolegniaceae Đặc điểm sinh học của nấm Achlya là

sợi nấm không có vách ngăn, màu trắng, dày đặc và dai trông giống như búi

bông gòn Vòng đời của Achlya gồm sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Các

động bào tử được hình thành trên đầu mút của sợi nấm và túi động bào tử có kích thước tương đương hoặc lớn hơn so với sợi nấm Bên trong túi động bào

tử, các động bào tử di chuyển rất nhanh lên đầu mút và phóng thích ra ngoài

Động vật thủy sản bị nhiễm nấm Achlya thường thấy sợi nấm màu trắng trên da,

vây và mang Bệnh thường xuất hiện khi cá bị xây xát, hoặc bị tổn thương vùng

da, vây do vi khuẩn hay ký sinh trùng gây ra Nấm Achlya có thể tồn tại ở độ

mặn 10 – 25 ppt [12]

Hình 2.6 Đĩa nấm Achlya

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh 1, Bộ môn Hóa học

và phòng thí nghiệm Sinh học Tế bào và Phân tử, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên,Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện: từ 01/2017 đến 05/2017

3.2 Phương tiện nghiên cứu

3.2.1 Dụng cụ và thiết bị

- Bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger

- Bếp đun hoàn lưu Heating Green

- Cân điện tử Sartorrius 210 ± 0,0001 g

- Que cấy nấm, cây đục khoanh nấm đường kính 7 mm

- Đĩa petri thủy tinh 100 x 15 mm

- Eppendorf 2 mL

- Micropipette 0 – 10 µL, 10 – 100 µL, 100 – 1000 µL

- Ống đong 10 mL, 50 mL

3.2.2 Dung môi và hóa chất

- Cồn tuyệt đối, ethanol 96°, ethanol 70°, methanol

- Dung dịch KOH 0,1 N trong ethanol, dung dịch HCl 0,1 N trong ethanol

- Thu mua và xử lý nguyên liệu

- Ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

- Xác định các chỉ tiêu lý – hóa của tinh dầu

- Khảo sát thành phần hóa học trong tinh dầu bằng hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu vỏ và lá quýt bằng phương pháp DPPH

- Khảo sát hoạt tính kháng nấm của tinh dầu vỏ và lá quýt trên 3 loài nấm

là Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp và Achlya

3.3.2 Ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Quy trình ly trích vỏ và lá quýt dựa theo quy trình ly trích vỏ và lá chanh của Stavroula (2002) [17]

Cắt nhỏ và xoay nhuyễn 200 g quýt vỏ quýt (250 g lá quýt), cho vào bình cầu 1000 mL, rót nước cất vào bình sao cho thể tích nước trong bình không vượt quá 2/3 thể tích của bình cầu Nếu cho quá nhiều nước thì trong quá trình đun xác mẫu trong bình sẽ trào lên bộ phận hứng lấy tinh dầu Lắp bình cầu vào hệ thống gồm bếp đun hoàn lưu, ống hứng tinh dầu và ống sinh hàn; tiến hành ly trích trong 1,5 giờ Sau khi quá trình ly trích hoàn tất, hỗn hợp tinh dầu thu được gồm tinh dầu quýt và nước Loại bỏ nước, làm khan bằng Na2SO4 thu được tinh

dầu quýt Tiến hành xác định các chỉ số lý – hóa, khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, kháng nấm của mẫu tinh dầu thu được, đồng thời phân tích thành phần mẫu tinh dầu bằng GC – MS

LÝ – HÓA

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM

3.3.3 Xác định một số chỉ tiêu lý – hóa của tinh dầu quýt hồng

Mẫu tinh dầu thu được sau khi ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng để xác định các chỉ số đặc trưng của tinh dầu [8, 12]

- Mùi: nhỏ vài giọt tinh dầu lên giấy thấm khô, sạch, không có mùi lạ Dùng mũi xác định mùi của tinh dầu từ 4 đến 5 lần, cứ 15 phút xác định một lần

- Vị: cân 1 g đường kính cho vào chén thử khô, sạch, không có mùi vị lạ Nhỏ vài giọt tinh dầu vào chén, trộn đều, dùng lưỡi xác định vị của hỗn hợp đó

3.3.3.2 Khối lượng riêng

Khối lượng riêng (g/mL) của một chất ở nhiệt độ t (ρt) là khối lượng một đơn vị thể tích của chất đó, xác định ở nhiệt độ t

Cách tiến hành: Cân chính xác khối lượng của eppendorf 2 mL rỗng và khô ở nhiệt độ 20°C , dùng micropipette hút chính xác 1 mL tinh dầu cho vào eppendorf trên và tiến hành cân khối lượng của eppendorf có chứa tinh dầu ở cùng nhiệt độ Khối lượng riêng của tinh dầu được tính toán theo công thức sau:

ρ20 = m1−m0

VTrong đó:

ρ20: Khối lượng riêng của một chất ở nhiệt độ 20°C (g/mL)

m0: Khối lượng của eppendorf 2 mL rỗng và khô ở nhiệt độ 20°C (g) m1: Khối lượng của eppendorf có chứa tinh dầu ở nhiệt độ 20°C (g) V: Thể tích tinh dầu ở nhiệt độ 20°C (mL)

3.3.3.3 Chỉ số acid

Chỉ số acid là số miligam KOH cần để trung hòa các acid tự do chứa trong

1 gam tinh dầu Chỉ số acid phụ thuộc vào mức độ tươi và thời gian bảo quản của tinh dầu Khi bảo quản lâu, chỉ số acid sẽ tăng lên do bị oxy hóa và ester trong tinh dầu bị phân giải

Các xác định

Xác định dựa vào phản ứng trung hòa:

RCOOH + KOH → RCOOK + H2O

Từ lượng KOH dùng để trung hòa acid tự do, tính được chỉ số acid

Để xác định chỉ số acid, cân khoảng 1 g tinh dầu cho vào bình tam giác, hòa tan bằng 5 mL ethanol, thêm 1 giọt phenolphthalein Tiến hành chuẩn độ dung dịch KOH 0,1 N trong ethanol đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, bền trong

30 giây Thực hiện phép đo 3 lần, ghi khối lượng tinh dầu mtd và thể tích của dung dịch KOH 0,1 N đã được sử dụng

Chỉ số acid được tính bằng công thức:

AI = 5,611×V

mtdTrong đó:

AI: chỉ số acid

5,611: lượng KOH chứa trong 1 mL dung dịch KOH 0,1 N (mg)

V: thể tích dung dịch KOH 0,1 N đã dùng để chuẩn độ mẫu (mL)

mtd: khối lượng tinh dầu dùng trong thí nghiệm (g)

Chỉ số xà phòng hóa được tính theo công thức:

SI = 5,611×(V0−V1)

mtdTrong đó:

SI: chỉ số xà phòng hóa

5,611: lượng KOH chứa trong 1 mL dung dịch KOH 0,1 N (mg)

V0: thể tích dung dịch HCl 0,1 N đã dùng để chuẩn độ mẫu trắng (mL) V1: thể tích dung dịch HCl 0,1 N đã dùng để chuẩn độ mẫu thử (mL) mtd: khối lượng tinh dầu dùng trong thí nghiệm (g)

Tinh dầu quýt hồng được phân tích thành phần hóa học bằng hệ thống sắc

ký khí ghép khối phổ (GC – MS) Thermo Scientific tại phòng Sắc ký – Quang phổ, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ Cột

sử dụng trong phân tích là cột có ký hiệu TB – SQC (15 m  0,25 mm  0,25

m), khí mang là Heli

3.3.4.1 Điều kiện của sắc ký khí

Chương trình nhiệt độ cho máy sắc ký khí được thiết lập như sau:

- Initial: Nhiệt độ đầu ở 50°C, giữ 1 phút

- Ram 1: Tăng lên 70°C với tốc độ 2°C/phút, giữ 1 phút

- Ram 2: Tăng lên 150°C với tốc độ 5°C/phút, giữ 2 phút

- Ram 3: Tăng lên 230°C với tốc độ 10°C/phút, giữ 1 phút

3.3.4.2 Điều kiện của khối phổ

Nguồn ion hóa EI:

3.3.4.3 Xác định thành phần hóa học của tinh dầu quýt hồng

Thành phần hóa học của tinh dầu được xác định như sau:

- Xác định thời gian lưu của các chất trên sắc ký đồ giống với thời gian lưu của những chất đã biết trước

- Đối chiếu khối phổ thu được với phổ gốc trong thư viện phổ NIST, từ đó định danh các cấu tử trong tinh dầu quýt hồng, đồng thời dựa trên tỉ lệ diện tích peak của các cấu tử xác định tỉ lệ % các chất trong mẫu phân tích

3.3.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH 3.3.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của vitamin C

Pha dung dịch DPPH: Cân chính xác 5 mg DPPH, hòa tan trong 5 mL methanol Trộn điều thu được dung dich DPPH có nồng độ 1000 g/mL Bảo quản trong tủ lạnh và pha mới mỗi ngày

Cân chính xác 10 mg vitamin C rồi định mức đến 10 mL bằng methanol Lắc đều đến khi tan hoàn toàn thu được dung dịch vitamin C nồng độ 1000

g/mL Dùng micropipette rút 1 mL dung dịch vừa pha cho vào bình rồi định mức đến 10 mL bằng methanol thu được dung dịch gốc vitamin C nồng độ 100

g/mL được dùng cho các thí nghiệm kế tiếp và được pha mới hằng ngày Hút thể tích vitamin C theo Bảng 3.1 cho vào eppendorf 2 mL rồi thêm một lượng methanol cho vừa đủ 960 µL Thêm 40 µL dung dịch DPPH ở trên cho vừa đủ 1 mL Ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi tiến hành

đo UV – Vis ở bước sóng 517 nm Từ giá trị OD đo được, tính được phần trăm

ức chế

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn vitamin C

3.3.5.2 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu vỏ quýt hồng

Dùng micropipette rút 150 L tinh dầu dầu vỏ quýt rồi định mức đến

5 mL bằng methanol Lắc đều đến khi dung dịch đồng nhất thu được dung dịch tinh dầu có nồng độ 30 L/mL

Dung dịch tinh dầu vỏ quýt được pha bằng cách rút một thể tích theo Bảng 3.2 cho vào eppendorf 2 mL rồi thêm một lượng methanol cho vừa đủ 960 µL Thêm 40 mL dung dịch DPPH ở trên cho vừa đủ 1 mL Ủ trong bóng tối ở nhiệt

độ phòng trong 30 phút rồi tiến hành đo UV – Vis ở bước sóng 517 nm Từ giá trị OD đo được, tính được phần trăm ức chế

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu vỏ

Methanol (L)

3.3.5.3 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu lá quýt hồng

Dùng micropipette rút 50 L tinh dầu dầu lá quýt rồi định mức đến 5 mL bằng methanol Lắc đều đến khi dung dịch đồng nhất thu được dung dịch tinh dầu lá quýt có nồng độ 10 L/mL

Dung dịch tinh dầu lá quýt được pha bằng cách rút một thể tích theo Bảng 3.3 cho vào eppendorf 2 mL rồi thêm một lượng methanol cho vừa đủ 960 µL Thêm 40 µL dung dịch DPPH ở trên cho vừa đủ 1 mL Ủ trong bóng tối ở nhiệt

độ phòng trong 30 phút rồi tiến hành đo UV – Vis ở bước sóng 517 nm Từ giá trị OD đo được, tính được phần trăm ức chế