KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA VỎ VÀ HẠT TRÁI QUÁCH (Limonia acidissima L.)

Kết quả hoạt tính kháng nấm của các cao methanol vỏ Quách, cao ethanol vỏ Quách, cao methanol hạt Quách, cao nước vỏ Quách, cao nước hạt Quách đối với nấm Fusarium oxysporum có giá trị I

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hoà Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập-Tự do-Hạnh phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Nguyễn Trọng Tuân

2 Đề tài: “Khảo sát thành phần hoá học và hoạt tính kháng nấm của vỏ

và hạt trái quách (Limonia acidissima L.)”

3 Sinh viên thực hiện: Lâm Minh Trường MSSV: B1304124

Lớp: Hoá Học – khóa: 39

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị nghi chi tiết và đầy đủ):

► Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

► Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2017

Cán bộ hướng dẫn

Ts Nguyễn Trọng Tuân

ii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hoà Xã Hội Chủ Nghĩa Việt

Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập-Tự do-Hạnh phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện:

2 Đề tài: “Khảo sát thành phần hoá học và hoạt tính kháng nấm của vỏ

và hạt trái quách (Limonia acidissima L.)”

3 Sinh viên thực hiện: Lâm Minh Trường MSSV: B1304124

Lớp: Hoá Học – khoá: 39

4 Nội dung nhận xét:

b) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị nghi chi tiết và đầy đủ):

► Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

► Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2017

Cán bộ phản biện

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, em đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp

đỡ, dạy bảo to lớn từ các thầy, cô, bạn bè và gia đình Vì vậy, em xin gửi lời

cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến:

Quý thầy, cô Trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy, cô Bộ môn Hóa – Khoa Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt những kiến thức quý báu, những

kỹ năng bổ ích trong suốt bốn năm em học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trọng Tuân đã quan tâm, giúp

đỡ, theo dõi, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn thành tốt luận văn của mình

Em xin gửi lời cảm ơn đến anh Cao Văn Tín lớp Cao học Hóa Hữu

cơ K22 đã truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, hỗ trợ và góp ý để em có thể hoàn thành luận văn này

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong PTN Hóa sinh 1 đã luôn đồng hành, quan tâm, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến những thành viên trong gia đình đã luôn luôn ủng hộ, quan tâm, chăm sóc và tạo mọi điều kiện

để con hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2017

Lâm Minh Trường

iv

TÓM TẮT

Quách (Limonia acidissima L.) là loài cây ăn trái được trồng khá phổ

biến ở vùng nhiệt đới, trái Quách không chỉ dùng để chế biến nước giải khát

và rượu mà nó còn là vị thuốc phổ biến trong y học cổ truyền dân tộc có tác dụng chữa được táo bón, trái chưa chín làm săn da, bổ tiêu hóa Kết quả định tính thành phần hóa học cho thấy trong vỏ trái Quách có chứa các hợp chất alkaloid, flavonoid, triterpenoid-steroid, đường khử, tannin Còn trong hạt Quách thì có chứa các hợp chất alkaloid, flavonoid, triterpenoid-steroid, đường khử Kết quả hoạt tính kháng nấm của các cao methanol vỏ Quách, cao ethanol vỏ Quách, cao methanol hạt Quách, cao nước vỏ Quách, cao nước hạt

Quách đối với nấm Fusarium oxysporum có giá trị IC50 lần lượt là 196,06

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG

NẤM CỦA VỎ VÀ HẠT TRÁI QUÁCH

(Limonia acidissima L.)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả

nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất

cứ luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2017

Lâm Minh Trường

vi

MỤC LỤC

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN i

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

LỜI CAM ĐOAN v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH xi

DANH MỤC VIẾT TẮT xiii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2

2.1 Tổng quan về cây Quách 2

2.1.1 Tên gọi 2

2.1.2 Phân loại thực vật 2

2.1.3 Đặc điểm hình thái 2

2.1.4 Phân bố và sinh thái 3

2.1.5 Công dụng và dược lý 4

2.1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 4

2.1.7 Thành phần hóa học 5

2.2 Tổng quan về nhóm chức 6

2.2.1 Alkaloid 6

2.2.2 Flavonoid 7

2.2.3 Triterpenoid–steroid 8

2.2.4 Glycoside 10

2.2.5 Saponin 11

2.2.6 Tanin 11

2.3 Sơ lược về nấm Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp gây hại trên

cây trồng và nấm Achlya gây hại trên thủy sản 12

2.3.1 Giới thiệu nấm Fusarium oxysporum 12

2.3.2 Giới thiệu nấm Colletotrichum sp 13

2.3.3 Giới thiệu nấm Achlya 14

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện 16

3.1.1 Địa điểm và thời gian 16

3.1.2 Thu và xử lý mẫu 16

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 16

3.2 Điều chế các cao chiết 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Định tính thành phần hóa học các cao chiết 18

3.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum,

Colletotrichum sp và Achlya 20

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của các cao chiết 23

4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum của cao chiết vỏ và hạt trái Quách 25

4.2.1 Tác động ức chế nấm Fusarium oxysporum của cao methanol vỏ Quách 25

4.2.2 Tác động ức chế nấm Fusarium oxysporum của cao ethanol vỏ Quách 26

4.2.3 Tác động ức chế nấm Fusarium oxysporum của cao methanol hạt Quách 27

4.2.4 Tác động ức chế nấm Fusarium oxysporum của cao nước vỏ Quách 28

4.2.5 Tác động ức chế nấm Fusarium oxysporum của cao nước hạt Quách 29

4.2.6 Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các cao chiết vỏ và hạt trái Quách trên nấm Fusarium oxysporum 30

viii

4.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm Colletotrichum sp của các cao

chiết vỏ và hạt trái Quách 31

4.3.1 Tác động ức chế nấm Colletotrichum sp của cao methanol vỏ Quách 31

4.3.2 Tác động ức chế nấm Colletotrichum sp của cao ethanol vỏ Quách 32

4.3.3 Tác động ức chế nấm Colletotrichum sp của cao methanol hạt Quách 33

4.3.4 Tác động ức chế nấm Colletotrichum sp của cao nước vỏ Quách 34 4.3.5 Tác động ức chế nấm Colletotrichum sp của cao nước hạt Quách 35 4.3.6 Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các cao chiết vỏ và hạt trái Quách trên nấm Colletotrichum sp 36

4.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm Achlya của các cao chiết vỏ và hạt trái Quách 37

4.4.1 Tác động ức chế nấm Achlya của cao methanol vỏ Quách 37

4.4.2 Tác động ức chế nấm Achlya của cao ethanol vỏ Quách 38

4.4.3 Tác động ức chế nấm Achlya của cao methanol hạt Quách 39

4.4.4 Tác động ức chế nấm Achlya của cao nước vỏ Quách 40

4.4.5 Tác động ức chế nấm Achlya của cao nước hạt Quách 41

4.4.6 Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các cao chiết vỏ và hạt trái Quách trên nấm Achlya 42

4.5 Kết luận về hoạt tính kháng nấm 43

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 48

Bảng 4.3: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Fusarium

oxysporum của cao methanol vỏ Quách 25

Bảng 4.4: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Fusarium

oxysporum của cao ethanol vỏ Quách 26

Bảng 4.5: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Fusarium

oxysporum của cao methanol hạt Quách 27

Bảng 4.6: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Fusarium

oxysporum của cao nước vỏ Quách 28

Bảng 4.7: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Fusarium

oxysporum của cao nước hạt Quách 29

Colletotrichum sp của cao nước hạt Quách 35

Bảng 4.13: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Achlya của

cao methanol vỏ Quách 37

Bảng 4.14: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Achlya của

cao ethanol vỏ Quách 38

x

Bảng 4.15: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Achlya của

cao methanol hạt Quách 39

Bảng 4.16: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Achlya của

cao nước vỏ Quách 40

Bảng 4.17: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Achlya của

cao nước hạt Quách 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Trái và ruột Quách 3

Hình 2.2: Vỏ và hạt trái Quách 3

Hình 2.3: Khung sườn flavonoid 7

Hình 2.4: Nấm Fusarium oxysporum 12

Hình 2.5: Nấm Colletotrichum sp 14

Hình 2.6: Nấm Achlya 15

Hình 4.1: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Fusarium oxysporum theo nồng độ của cao methanol vỏ Quách 25

Hình 4.2: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Fusarium oxysporum theo nồng độ của cao ethanol vỏ Quách 26

Hình 4.3: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Fusarium oxysporum theo nồng độ của cao methanol hạt Quách 27

Hình 4.4: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Fusarium oxysporum theo nồng độ của cao nước vỏ Quách 28

Hình 4.5: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Fusarium oxysporum theo nồng độ của cao nước vỏ Quách 29

Hình 4.6: Đồ thị hoạt tính ức chế sinh trưởng trên nấm Fusarium oxysporum30 Hình 4.7: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Colletotrichum sp của cao methanol vỏ Quách 31

Hình 4.8: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Colletotrichum sp của cao ethanol vỏ Quách 32

Hình 4.9: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Colletotrichum sp của cao methanol hạt Quách 33

Hình 4.10: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Colletotrichum sp của cao nước vỏ Quách 34

Hình 4.11: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Colletotrichum sp của cao nước hạt Quách 35

Hình 4.12: Đồ thị hoạt tính ức chế sinh trưởng trên nấm Colletotrichum sp 36

Hình 4.13: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Achlya của cao methanol vỏ Quách 37

Hình 4.14: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Achlya của cao ethanol vỏ Quách 38

Hình 4.15: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Achlya của cao methanol hạt Quách 39

Hình 4.16: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Achlya của cao nước vỏ Quách 40

xii

Hình 4.17: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Achlya của cao nước hạt

Quách 41 Hình 4.18: Đồ thị hoạt tính ức chế sinh trưởng trên nấm Achlya 42

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Cây Quách là loài cây gần như gắn với đời sống đồng bào dân tộc Khmer Cây Quách cho trái ăn được, người dân thường dùng chế biến các món giải khát và rượu với hương vị đặc biệt, có giá trị dinh dưỡng tốt cho sức khỏe Ngoài ra theo kinh nghiệm dân gian, người ta có thể dùng trái Quách còn xanh làm thuốc chữa tiêu chảy, trái chín có tác dụng chống táo bón, lá cây Quách có thể chữa viêm phế quản

Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu hướng tới phục vụ y học nhưng tại Việt Nam việc sử dụng trái Quách chủ yếu dựa theo kinh nghiệm dân gian, các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học tiềm năng của cây Quách còn hạn chế Do đó, việc đánh giá thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của vỏ và hạt trái Quách, làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng dược liệu và làm sáng tỏ thêm các hoạt tính sinh học tiềm năng, góp phần nâng cao giá trị và kiến nghị bảo tồn loài cây này như một dược liệu tại Việt Nam

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Trên cở sở các nghiên cứu ở ngoài nước cũng như ở hạn chế của các nghiên cứu trong nước Đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính

kháng nấm của vỏ và hạt trái Quách (Limonia acidissima L.)” mong muốn đạt

được các mục tiêu sau:

- Khảo sát thành phần hóa học trong vỏ và hạt trái Quách

- Đánh giá hoạt tính ức chế sinh trưởng trên nấm Fusarium oxysporum,

Colletotrichum sp gây hại trên cây trồng và nấm Achlya gây hại trên thủy sản

của các cao chiết

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Thu hái, xử lý nguyên liệu: Thu hái những trái Quách ở thời điểm già

và chín, sau đó rửa sạch, rồi bổ ra lấy vỏ và hạt, phơi khô rồi nghiền thành bột

- Điều chế các cao methanol vỏ Quách, cao ethanol vỏ Quách, cao methanol hạt Quách bằng phương pháp ngâm dầm chiết kiệt

- Điều chế các cao nước vỏ Quách, cao nước hạt Quách bằng phương pháp đun hoàn lưu và chưng cất lôi cuốn hơi nước

- Định tính thành phần hóa học của các cao chiết

- Khảo sát hoạt tính kháng nấm, tìm ra giá trị IC50

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về cây Quách

2.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Limonia acidissima L

Tên đồng nghĩa: Feronia limonia (L.) Swingle

Tên Việt Nam: cây Quách, cây Cần thăng, cây Gáo…

Tên nước ngoài: Wood Apple, Elephant Apple, Monkey Fruit or Curd Fruit (Anh); Bal, Bael (Assamese); Koth Bael (Bengali); Kothu (Gujarati) Kaitha, Kath Bel (Hindi); Kvet (Khmer ); Balulada hanu (Kanada); Belingai (Malaysia); Vilam Kai (Malayalam); KavaTh (Marathi); Kaitha hoặc Kaintha (Oriya); Kapittha (Sanskrit); Divul (Sinhalese); Vilam Palam (Tamil); Vellaga Pandu (Telugu) [1,2]

Chi: Limonia L Loài: Limonia acidissima L

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cây thân gỗ cao tới 6-8 m, thân cây nứt dọc sâu màu xám và có vỏ xù xì Lúc cây còn non thân cây nhẵn màu trắng xanh, phân cành dài gãy khúc nhưng dễ uốn, có gai ở nách lá và có lông thưa

Lá cây Quách là dạng lá kép lông chim một lần lẻ, mang bảy lá phụ dạng thuôn bầu dục, mọc đối, không có cuống phụ và lá có màu xanh lục

Hoa nhỏ xếp dày dạng chùm đơn ở nách lá hay ở đầu cành, màu trắng

Quả mọng hình cầu (đường kính khoảng 5-10 cm), màu xanh xám Vỏ quả dày hóa gỗ, nhẵn, cứng và giòn Bên trong vỏ chứa thịt quả, hạt và các sợi gân

Thịt quả của trái còn non có màu trắng, vị rất chát Trái vừa chín rụng thịt quả có màu vàng nhạt, mùi thơm dịu, có vị chua chua và ngọt nhẹ nhưng vẫn còn hơi chát Đặc biệt khi quả chín rục, vỏ quả có màu bạc trắng, mềm và thịt quả chuyển sang màu nâu đen (như màu me chín), mùi thơm nồng, có vị ngọt dịu gần như không còn vị chát [3]

Hình 2.1: Trái và ruột Quách

Hình 2.2: Vỏ và hạt trái Quách

2.1.4 Phân bố và sinh thái

Cây Quách phân bố chủ yếu ở các nước châu Á nhiệt đới như Ấn Độ, Srilanca, Myanma, Thái lan, Campuchia, Lào và Việt Nam

Ở Việt Nam cây mọc chủ yếu ở những vùng đất cát pha, khô cằn như các tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Vĩnh Long,… Cây

Quách hiện nay có nhiều ở Trà Vinh, nó được trồng chủ yếu để lấy bóng mát

2.1.5 Công dụng và dược lý

Trái Quách còn xanh làm thuốc chữa tiêu chảy, trái chín có tác dụng chống táo bón Thịt quả có tính kích thích ăn uống, giúp tiêu hóa dễ dàng, có lợi cho người bệnh thận và có tính kháng sinh

Ruột trái Quách được ngâm rượu dùng làm thuốc bổ, nếu dùng theo giờ giấc và liều lượng nhất định sẽ giúp cường gân cốt, bổ thận, thuận tràng, dễ tiêu…

2.1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Ngoài nước

- Năm 2014, Shipra Pandey và các cộng sự đã nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng có trong thịt trái Quách gồm có các protein, vitamin, acid

ascorbic, thiamine, riboflavin, β-caroten và các khoáng chất: photpho, magie,

canxi, sắt và kẽm Dịch chiết methanol trái Quách có khả năng kháng vi khuẩn

trên ba loại khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis, Bacillus subtilis) và 1 loại khuẩn Gram âm (Proteus mirabilis)

với nồng độ ức chế hoàn toàn là 500 mg/mL [6]

- Năm 2009, Ki Hyun Kim và các cộng sự công bố đã được phân lập được 5 hợp chất là limodissimin A ((R)-8-(2-hydroxy-3-methylbut-3-enyl)-7-

(2-methylene-2H-chromen-7-yloxy)-2H-chromen-2-one);

7-hydroxy-8-(3-methylbut-2-enyl)-2H-chromen-2-one;

(R)-7-hydroxyl-8-(-2-hydroxyl-3,3-dimethylbutyl)-2H-chromen-2-one; 2H-furo[2,3-h]chromen-2-one và 2,2-dimethylchromenocoumarin [7]

(S)-8-2-hydroxypropan-2-yl)-8,9-dihydro Năm 1986, Musa H Abu Zarga đã công bố phân lập đƣợc 15 hợp chất là umbelliferone, geranyl umbelliferone, marmesin, xanthotoxin, luvangetin, suberosin, epoxysuberosin, suberenol, dihydrosuberenol, crenulin,

crenulatin, -sitosterol, lupeol, limonoid limonin và quinolone [8]

4-methoxy-1-methyl-2-2.1.7 Thành phần hóa học

Vỏ trái Quách gồm các hợp chất: umbelliferone, dictamnine, xanthotoxol, xanthotoxin, scoparone, isopimpinellin, isoimperatorin, marmin, 2,6-dimethoxybenzoquinone, osthol, osthenol, psoralen…[9,10]

Hạt trái Quách có các hợp chất: feronia lactone, geranyl umbelliferone, bargapten, osthol, isopimpinellin, marmesin,…[10]

Trái Quách chín có các hợp chất coumarin, sterol và các acid béo [10] Trái Quách chƣa chín có chứa stigmasterol [10]

isoimperatorin osthol osthenol

Trong thực vật bậc thấp đã tìm thấy khoảng 250 alkaloid ở nấm, ở tảo

và các loài khác nhưng alkaloid phân bố nhiều nhất trong thực vật bật cao Trong cây một lá mầm đã tìm thấy khoảng 500 alkaloid trong khi đó ở cây hai

lá mầm đã tìm thấy khoảng 3600 chất Người ta cũng thấy alkaloid trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật, Trong cây, alkaloid thường tập trung ở một số bộ phận nhất định Ví dụ: alkaloid tập trung ở hạt như Mã tiền,

Cà phê, ở quả như Ớt, Hồ tiêu, Thuốc phiện, ở lá như Coca, Thuốc lá, Chè, ; ở củ như Ô dầu, Bình vôi, Bách bộ,

Đa số alkaloid không màu, ở dạng kết tinh rắn với điểm nóng chảy xác định hoặc có khoảng nhiệt độ phân hủy Một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng (nicotin, coniin) và một vài alkaloid có màu (berberin màu vàng, betanidin màu đỏ)

Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu (do sự có mặt của nguyên tử nitơ) Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R gắn trên nguyên tử nitơ Các alkaloid ở dạng base tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan tốt trong dung môi hữu cơ như chloroform, diethyl ether, alcol bật thấp Các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như chloroform, diethyl ether, benzene Phần lớn alkaloid có vị đắng, đặc biệt với một lượng nhỏ alkaloid cũng có thể cho phản ứng trầm hiện với thuốc thử đặc trưng của

nó

Alkaloid là hợp chất tương đối bền, tuy nhiên, một số hợp chất thuộc loại dẫn xuất của indol dễ bị phân hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng hoặc các tác nhân oxide hóa [11]

2.2.2 Flavonoid

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phân bố rộng nhất trong thiên nhiên, hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid Cho đến nay

có khoảng 4000 flavonoid đã biết rõ cấu trúc

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa, Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối nhau qua một dây có 3 carbon nên thường được gọi là C6-C3-C6 Cách đánh số tùy theo dây C3 đóng hay hở Nếu dây C3 đóng, thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A

Hình 2.3: Khung sườn flavonoid

Thường các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5

và 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycoside Do có nhiều nhóm –OH phenol nên các flavonoid có thể liên kết với nhau để tạo thành chất phức tạp hơn hoặc tạo với các hợp chất khác trong cây, ví dụ kết hợp với đường để tạo thành glycoside

Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu Phần lớn flavonoid

có màu vàng; flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam, flavonol có màu vàng đến vàng nhạt, chalcon có màu vàng đến cam đỏ Các isoflavon, flavonon, flavanonol, leucoantocyanidin, catechin kết tinh không màu Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycoside ví dụ như pelargonidin, cyanidin, delphinidin, tạo màu xanh dương, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái Các flavonoid có độ hòa tan khác nhau tùy theo số nhóm hydroxy (–OH) và các nhóm thế khác có trúc hóa học Ví dụ: flavonoid mang nhiều nhóm –OCH3 và

ít nhóm –OH, có tính phân cực yếu nên tan tốt trong dung môi ít phân cực như benzen, chloroform, ethyl acetate Flavonoid mang nhiều nhóm –OH, có tính phân cực mạnh sẽ hòa tan trong các dung môi phân cực như acetone, ethanol, methanol, buthanol, nước,

Để phân lập từng chất flavonoid, người ta áp dụng phương pháp sắc ký cột, chất hấp phụ thông dụng là bột polyamid dùng để tách tất cả các loại flavonoid Có thể dùng các chất khác như silicagel, bột cellulose, Trong đó, silicagel dùng để tách các flavanon, isoflavon, flavonol Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần hoặc sắc ký lớp mỏng điều chế

[11]

2.2.3 Triterpenoid–steroid

Terpenoid là nhóm hợp chất tự nhiên mà cấu trúc hóa học dựa trên cơ

sở các phân tử isoprene liên kết lại với nhau, có công thức tổng quát (C5H8)nvới n ≥ 2 Tuy là dẫn xuất của isoprene nhưng isoprene lại không phải là tiền chất của quá trình sinh tổng hợp terpenoid Chất liệu cơ bản để sinh tổng hợp terpenoid là pharnesyl pyrophosphate

Dựa vào số đơn vị isoprene, người ta phân chia thành: monoterpene (C10H16), sesquiterpene (C15H24), diterpene (C20H32), sesterterpene (C25H40), triterpene (C30H48), tetraterpene (C40H64), polyterpene (C5H8)n

Monoterpene (C10H16) là thành phần chính của tinh dầu, hiện diện trong

khoảng 60 họ thực vật, nhưng chủ yếu trong 10 họ Hàm lượng tinh dầu trong

cây thường thấp, khoảng 1%, ngoại trừ nụ hoa cây Đinh hương Syzygium

aromaticum (L.) có hàm lượng tinh dầu chiếm 15-20% Cấu trúc hóa học của

các monoterpene có thể là mạch hở 1, 2 hoặc 3 vòng với khoảng 10 khung sườn carbon cơ bản chính

Sesquiterpene (C15H24): tinh dầu cũng chứa những hợp chất loại

sesquiterpene, thường gặp các sesquiterpene lactone trong các cây họ Cúc Cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên sesquiterpene có thể là mạch hở, 1,

2, 3 hoặc 4 vòng với khung sườn carbon cơ bản chính

Diterpene (C20H32): trong tự nhiên, diterpene không vòng là hợp chất

phytol, diterpene đơn vòng là vitamin A Diterpene bốn vòng có khung cơ bản

là gibberelan với ví dụ là gibberilin, chất tăng trưởng thực vật Cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên diterpene có thể là mạch hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng với 70 khung sườn carbon cơ bản chính

Sesterterpene (C25H40): trong tự nhiên, các hợp chất loại sesterterpene

hiện diện với số lượng nhỏ Cấu trúc hóa học của các sesterterpene có thể là mạch hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng với 6 khung sườn carbon cơ bản chính

Triterpene (C30H48) được phân bố rộng rãi trong giới động vật và thực

vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycoside Cấu trúc hóa học của các triterpene

có thề là mạch hở, 3, 4, hoặc 5 vòng với 33 khung sườn carbon cơ bản chính

Tetraterpene (C40H64) còn được gọi là carotenoid Các hợp chất này

thường có cấu trúc hóa học gồm hệ thống các nối đôi liên hợp, nên hợp chất

có màu từ vàng, cam đến đỏ tạo nên màu sắc cho hoa và trái cây Cấu trúc hóa

họ của các tetraterpene có thể là mạch hở, 1 hoặc 2 vòng

Polyterpene (C5H8)n các polyterpene luôn có cấu trúc mạch hở, thẳng

Các polyterpene tự nhiên với độ polymer hóa cao (từ 500 đến 5000 đơn vị isoprene) là những hợp chất nhựa cây hiện diện trong khoảng 300 loài thực vật

Hầu hết hợp chất terpenoid có cấu trúc vòng với một số nhóm chức như –OH, >CO, –CHO, –O– Đặc tính chung của chúng là ít tan trong nước, tan trong chất béo ngoại trừ các glycoside (tạo thành khi chúng kết hợp với oza) thì tan trong nước

Steroid là nhóm hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong giới động vật

và thực vật, với cấu trúc tổng quát là hệ thống vòng cyclopentanoperhydrophenantren hoặc trong một vài trường hợp hiếm gặp là

sự biến đổi của hệ thống vòng nói trên

Steroid có nhiều trong thiên nhiên như: các sterol, các nội tiết tố (hormon) như nội tiết tố sinh dục, acid mật, hormon tuyến thượng thận, các glycoside, đặc biệt là glycoside, các sapogenin,

Steroid phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid Các steroid nguồn gốc thực vật gọi là phytosterol, nguồn gốc động vật gọi là zoosterol Người ta thấy chúng ở thể tự do hoặc ở thể hóa hợp như ester, glycoside

Steroid là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo; tan nhiều trong dung môi không phân cực như petroleum ether, benzene, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kết hợp với lipid, caroten, lecitin Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn Các steroid có tác động đặc biệt đối với cơ tim thường tồn tại dưới dạng glycoside trong tự nhiên gọi là glycoside trợ tim Các sapogenin steroid phân lập chủ yếu từ sự thủy phân glycoside thực vật gọi là saponinn [11]

 Cardenoid: vòng lactone 5 cạnh, có 1 nối đôi

 Bufadienolid: vòng lactone 6 cạnh, có 2 nối đôi

Phần đường được gắn vào C3 trên khung steroid Cho đến nay, người ta biết khoảng 40 loại đường khác nhau Ngoài những đường thông thường như glucose, rhamnose, xylose, fucose còn có những đường là 2,6-desoxy

Các glycoside có tính phân cực khá mạnh nên không tan trong petroleum ether, hexane, benzene nhưng tan được trong chloroform, diethyl ether, tan tốt trong alcol, nước [11]

2.2.5 Saponin

Saponin là một glycoside phân bố khá rộng trong thực vật Người ta

đã tìm thấy khoảng 500 loài thuộc 80 họ thực vật có chứa saponin, ngoài ra saponin còn được tìm thấy ở một số động vật như: Hải sâm, Cá sao,

Người ta dựa theo cấu trúc hóa học mà chia hợp chất saponin ra thành hai loại: saponin steroid và saponin triterpenoid

Saponin triterpenoid: phần genin loại này có 30C, gồm saponin triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic

Saponin steroid: phần genin của saponin steroid có 27C, là dẫn xuất của khung cholestan, gồm có 3 nhóm: spirostan, furostan và nhóm saponin steroid alkaloid

Saponin là các chất phân cực mạnh nên tan nhiều trong nước và các alcol bậc thấp, rất ít tan trong acetone, không tan trong ether và hexane Do đó, có thể dùng 3 dung môi này để tủa saponin trong quá trình chiết xuất

Saponin có thể được tủa bởi (CH3COO)2Pb, Ba(OH)2, (NH4)2SO4 Có thể dùng tính tạo tủa này để phân lập saponin [11]

2.2.6 Tanin

Tanin là loại hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong họ thực vật Tannin có trong lá trà, rượu vang đỏ, nhiều loại trái cây, nhất là trong vỏ trái măng cụt, Các tanin có trọng lượng phân tử khoảng 500-3000

Tanin được phân thành hai nhóm lớn tùy theo tùy theo cấu trúc hóa học của nó Tùy theo việc tanin đó có hoặc không bị thủy giải bởi men hoặc môi trường acid hay base mà phân thành “tanin thủy giải được” hoặc “tanin hóa đặc”

Tanin thủy giải được là polyester khi bị thủy phân cho ra phần aglycol là polyphenol gồm acid galic hoặc hexahydroxydiphenic

Tanin hóa đặc là sự polymer của một vài flavanol ví dụ như catechol hoặc epicatechol Loại này khác với tanin thủy giải được vì nó không bị thủy giải dưới tác dụng của acid vô cơ loãng

Các tanin do mang nhiều nhóm –OH nên ít nhiều bị hòa tan trong nước tạo nên dung dịch nhớt

Khi nếm tanin có cảm giác chát, se lưỡi, do tanin làm kết tủa các enzyme

có trong nước bọt, làm cho nước bọt mất đi tính chất của nó, làm bề mặt trong của lưỡi trơn láng

Tanin hiện diện với trọng lượng cao trong thực vật, muốn chiết lấy tannin có thể sử dụng dung môi là nước Làm tủa tanin bằng gelatin mặn, bằng cách rót dung dịch gelatin mặn vào dịch chiết, khuấy nhẹ, đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng, tanin sẽ tủa Do dung dịch gelatin mặn có độ nhớt cao nên có thể thay thế bằng dung dịch polyvinylpyrolidon [11]

2.3 Sơ lược về nấm Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp gây hại trên cây trồng và nấm Achlya gây hại trên thủy sản

2.3.1 Giới thiệu nấm Fusarium oxysporum

Nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng trên cây trồng, là một

trong những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn về kinh tế Chúng có mặt hầu hết các nơi, gây bệnh héo rũ trên nhiều loại cây trồng họ đậu, họ cà, họ dưa,

bầu bí,… Ở Việt Nam nấm Fusarium oxysporum gây thiệt hại lớn trên chuối,

khoai tây, cà chua và một số cây trồng khác

Hình 2.4: Nấm Fusarium oxysporum Các loài nấm Fusarium oxysporum đã được nghiên cứu từ khoảng đầu thế kỷ XIX Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về nấm Fusarium

oxysporum đã được công bố và có ý nghĩa lớn trong sự phát triển của khoa học

kỹ thuật Nấm Fusarium oxysporum thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes),

họ Tubercularia, bộ nấm bông (Hyphomycetables), đây là loại nấm có thành phần rất phong phú và đa dạng, trong đó sự biến động của một số loài phụ thuộc cơ bản vào đặc điểm khí hậu ở các vùng khác nhau trên thế giới Loài nấm này gây hại nhiều loại cây trồng trên tất cả các bộ phận đặc biệt là bộ phận gốc, rễ của cây

Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium oxysporum rất rõ rệt, sợi nấm phát

triển mạnh, màu sắc biến đổi từ màu trắng đến tím, tản nấm thường sinh sắc tố màu hồng đến màu tím đậm trên môi trường PDA Đa số chúng sống hoại sinh trên các cơ chất khác nhau như cellulose, lignins, pectins và một số chất phức

tạp khác Chúng có khả năng thích nghi và lưu tồn trong đất, nấm này có khả

năng định vị trong mạch dẫn của cây và làm cây chết Fusarium oxysporum

thích nghi tốt trong môi trường đất khô Bào tử hiện diện nhiều trong không khí hoặc những đại bào tử sống trên một số bộ phận của cây trồng trong điều kiện thoáng khí

Nấm Fusarium oxysporum tồn tại trong đất dưới dạng bào tử áo trong

thời gian dài (từ 15 đến 20 năm) Bào tử áo có hình tròn, là các bào tử một tế bào, với vách tế bào dày và có sức chống chịu cao được hình thành trong mô

bệnh Nấm Fusarium oxysporum có thể có mặt ở vỏ rễ một số cây trồng không

phải ký chủ, kể cả cỏ dại Bào tử áo hình thành trong vỏ rễ khi cây chết

Quá trình xâm nhiễm của nấm Fusarium oxysporum trên cây trồng bằng

nhiều cách khác nhau tùy theo loài nhưng chủ yếu bằng hai con đường: xâm nhiễm qua vết thương và xâm nhiễm vào cửa khẩu tự nhiên như đỉnh của rễ hoặc các rễ bên Khi cây trồng bị nhiễm bệnh, cây có thể không chết nhưng bị

ức chế sinh trưởng và giảm năng suất đáng kể Trong điều kiện mầm bệnh có mật số cao hoặc cây ký chủ dễ bị xâm nhiễm thì cả quần thể có thể bị héo và chết trong thời gian ngắn

Sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum chịu tác động nhiều bởi các

yếu tố khác nhau như nhiệt độ, độ pH và độ ẩm Chúng thường sinh trưởng tốt

ở nhiệt độ 28-33oC Tùy từng loại nấm khác nhau mà độ pH dao động trong khoảng khá rộng, thường thích hợp vào khoảng pH=6 Độ ẩm của đất cũng có thể ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự phát triển của mầm bệnh thông

qua tính nhiễm bệnh của cây ký chủ [12-13]

2.3.2 Giới thiệu nấm Colletotrichum sp

Nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây trồng, bệnh chủ yếu

gây hại trên lá của hầu hết các loại cây trồng, đặc biệt phổ biến ở vùng nhiệt đới và vùng cận nhiệt đới.

Nấm Colletotrichum sp thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), bộ

nấm đĩa đài (Melanconides) Nấm sinh trưởng phát triển và hình thành bào tử thuận lợi trên môi trường PDA và môi trường tổng hợp Trên môi trường PDA, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm Sợi nấm có vách ngăn và dịch trong suốt

Nấm Colletotrichum sp chỉ phát triển trên các vách tế bào ký chủ, trong

quá trình phát triển chúng tiết ra enzyme và độc tố để phân hủy vách tế bào và nguyên sinh chất của ký chủ Phạm vi ký chủ của nấm có khoảng 70 loại cây trồng khác nhau bao gồm các ký chủ chính như Đay, Đậu Lupins, Điều, Đu

đủ, Đông, Bơ, Bưởi, Cà chua, Cà phê, Cam chanh, Cao su, Phong lan và các

ký chủ phụ khác như các loại Đậu, Bí ngô, Dưa, Vải

Hình 2.5: Nấm Colletotrichum sp

Nấm thường xuyên xâm nhiễm trên những phần đã chết hay những bộ phận bị tổn thương của cây trồng và thường có mặt trong các mẫu bệnh quan sát bên ngoài những mô khỏe Trong điều kiện có ẩm độ và nhiệt độ cao, nấm gây hại rất nghiêm trọng Trên nhiều loại cây trồng nhiệt đới khi phân lập người ta thường bắt gặp nấm tồn tại dưới hai dạng nội ký sinh và ngoại ký sinh trên bề mặt mô cây

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của nấm Colletotrichum sp là từ

20-30oC và độ ẩm cao pH tối ưu cho nấm Colletotrichum sp phát triển từ 7-8 và

thích hợp cho bào tử nảy mầm là từ 5-6 Bên cạnh đó, khi có sự chiếu sáng trực tiếp của ánh nắng sẽ làm ức chế sự nẩy mầm của bào tử nấm

Lượng mưa và độ ẩm cao là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến cây trồng bị nhiễm bệnh cao và trong điều kiện này nấm gây hại nghiêm trọng nhất Tuy nhiên bệnh vẫn có thể xuất hiện trong điều kiện khô khi bào tử hoặc sợi nấm tiềm sinh xâm nhiễm vào mô bị tổn thương hoặc mô già, điều này cho thấy bệnh vẫn có thể gây thành dịch trên quả

Colletotrichum sp có thể tồn tại dưới nhiều dạng khác nhau như tồn tại

trong hạt, trên tàn dư của cây trồng và trên cây ký chủ Chúng phát tán nguồn bệnh nhờ mưa và nước tưới, có mối tương quan giữa lượng mưa, thời gian mưa với khả năng lây nhiễm của nấm, từ đó dẫn tới mức độ gây hại khác nhau

[12, 14-16]

2.3.3 Giới thiệu nấm Achlya

Nấm Achlya là nấm bậc thấp; thuộc ngành Heterokonta, lớp Oomycetea,

bộ Saprolegniales, họ Saprolegniaceae

Khuẩn lạc phát triển nhanh trên môi trường GY, sau 4 ngày nuôi cấy ở

28oC đường kính khuẩn lạc đạt 75 mm Sợi nấm không có vách ngăn, màu

trắng, dày đặc và dai trông giống như búi bông gòn Vòng đời của Achlya gồm

sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Các động bào tử được hình thành trên đầu mút của sợi nấm và túi động bào tử có kích thước tương đương hoặc lớn hơn so với sợi nấm Bên trong túi động bào tử, các động bào tử di chuyển rất nhanh lên đầu mút và phóng thích ra ngoài

Hình 2.6: Nấm Achlya Bệnh do nấm Achlya còn được gọi là bệnh nấm thủy mi Động vật thủy sản bị nhiễm nấm Achlya thường thấy sợi nấm màu trắng trên da, vây và

mang Bệnh thường xuất hiện khi cá bị xây xát, hoặc bị tổn thương vùng da, vây do vi khuẩn hay ký sinh trùng gây ra

Achlya có thể tồn tại ở độ mặn 10-25 ppt Nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt

là 30oC và 5 [17,18]

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện

3.1.1 Địa điểm và thời gian

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh 1, Bộ môn Hóa học

và phòng thí nghiệm Sinh học tế bào và phân tử, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện: từ 01/2017 đến 5/2017

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

3.1.3.1 Thiết bị và dụng cụ

Bảng 3.1: Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Nồi hấp vô trùng Autoclave

Tủ cấy, tủ sấy, tủ hút

Máy cô quay, máy siêu âm

Bếp đun hoàn lưu

Cân điện tử Satorrius

3.1.3.2 Hóa chất

Bảng 3.2: Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Các hóa chất cần thiết khác

3.2 Điều chế các cao chiết

 Điều chế cao methanol (MeOH) vỏ Quách

Cho 0,5 kg bột vỏ trái Quách vào túi vải, tiến hành ngâm dầm các túi vải này với methanol Sau 24 giờ lọc dịch chiết đem cô quay thu được cao methanol vỏ Quách Làm tương tự như thế với 3 lần tiếp theo Khối lượng cao methanol vỏ Quách thu được 80 g

 Điều chế cao ethanol (EtOH) vỏ Quách

Cho 0,5 kg bột vỏ trái Quách vào túi vải, tiến hành ngâm dầm các túi vải này với ethanol 96 Sau 24 giờ lọc dịch chiết đem cô quay thu được cao ethanol vỏ Quách Làm tương tự như thế với 3 lần tiếp theo Khối lượng cao ethanol vỏ Quách thu được 86 g

 Điều chế cao methanol hạt Quách

Cho 0,2 kg bột hạt trái Quách vào túi vải, tiến hành ngâm dầm các túi vải này với methanol Sau 24 giờ lọc dịch chiết đem cô quay thu được cao methanol hạt Quách Làm tương tự như thế với 3 lần tiếp theo Khối lượng cao methanol hạt Quách thu được 32 g

 Điều chế cao nước vỏ Quách

Cho 30 g bột vỏ Quách vào bình cầu thủy tinh (dung tích 1000 mL) Tiếp tục cho vào bình cầu 600 mL nước cất và 3,4 g sodium carbonate (Na2CO3) rồi kết nối bình cầu vào hệ thống hoàn lưu để đun hoàn lưu (nhiệt độ khoảng

120C) trong 30 phút Sau đó để nguội xuống nhiệt độ phòng, dung dịch trong bình được lược qua giấy lọc Dung dịch qua giấy lọc được cho vào bình lóng cùng với 50 mL hexane, lắc đều rồi loại bỏ phần hexane Sau đó dung dịch được trung hòa vừa đủ với HCl 1 N Dung dịch thu được đem chưng cất lôi cuốn hơi nước thu được cao nước vỏ Quách Khối lượng cao nước vỏ Quách thu được 9,5 g [19]

 Điều chế cao hạt vỏ Quách

Cho 30 g bột hạt Quách vào bình cầu thủy tinh (dung tích 1000 mL) Tiếp tục cho vào bình cầu 600 mL nước cất và 3,4 g sodium carbonate (Na2CO3) rồi kết nối bình cầu vào hệ thống hoàn lưu để đun hoàn lưu (nhiệt độ khoảng 120C) trong 30 phút Sau đó để nguội xuống nhiệt độ phòng, dung dịch trong bình được lược qua giấy lọc Dung dịch qua giấy lọc được cho vào bình lóng cùng với 50 mL hexane, lắc đều rồi loại bỏ phần hexane Sau đó dung dịch được trung hòa vừa đủ với HCl 1 N Dung dịch thu được đem chưng cất lôi cuốn hơi nước thu được cao nước hạt Quách Khối lượng cao nước hạt Quách thu được 9 g [19]

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Định tính thành phần hóa học các cao chiết

3.3.1.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid

 Định tính bằng thuốc thử Wagner

Thuốc thử: hòa tan 1,27 g I2 và 2 g KI trong 20 mL nước cất, thêm nước vừa đủ 100 mL

Hiện tượng: nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu

Thực nghiệm: lấy 1 mL dung dịch cao cho vào ống nghiệm, sau đó nhỏ

Kết quả: xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt, phản ứng dương tính

3.3.1.2 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid

Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL cao ethanol, thêm vài giọt dung dịch H2SO4 đậm đặc

3.3.1.3 Khảo sát sự hiện diện triterpenoid - steroid

 Định tính bằng thuốc thử Liebermann-Burchard

Thực nghiệm: 1 mL anhydride acetic, 1 mL chloroform, làm lạnh, thêm

1 giọt H2SO4 đậm đặc Cho cao ở dạng rắn hoặc pha trong chloroform

Hiện tượng: Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu này bền không đổi

có chứa mẫu thử, thêm 5 giọt pyridine, 4 giọt thuốc thử mới pha

Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện gương bạc bám trên thành ống nghiệm hoặc có tủa màu đen Ag kim loại

 Định tính bằng thuốc thử Fehling

Felling A: CuSO4

Felling B: Kali natri tartrat

Cho vào ống nghiệm vài giọt Fehling A, vài giọt Felling B theo tỉ lệ 1:1 (V:V), lắc đều, ta thấy xuất hiện màu xanh thẫm, thêm mẫu thử rồi đem đun cách thủy Nếu có glycoside thì sau một thời gian đun sẽ xuất hiện kết tủa màu

đỏ gạch

3.3.1.5 Khảo sát sự hiện diện của saponin

 Dựa vào sự tạo bọt của saponin

Ống nghiệm 1: 5 mL HCl 0,1 N (pH=1) thêm 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử

Ống nghiệm 2: 5 mL NaOH 0,1 N (pH=13) thêm 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử

Bịt miệng 2 ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống, để yên 15 phút và quan sát cột bọt trong 2 ống nghiệm

Nếu trong 2 ống nghiệm có cột bọt bền thì mẫu thử có chứa saponin

3.3.1.6 Khảo sát sự hiện diện của tanin

 Dựa vào sự tạo kết tủa với gelatin mặn

Lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%

sẽ xuất hiện tủa bông trắng

 Thuốc thử Stiasny

Công thức: 20 mL formol 36%, thêm 10 mL HCl đậm đặc

Thực nghiệm: cho 2 mL dịch chiết vào ống nghiệm, thêm từ từ thuốc thử

vào

3.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum,

Colletotrichum sp và Achlya

Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của các cao chiết vỏ và hạt trái Quách

được thực hiện ở phòng thí nghiệm Sinh học tế bào và phân tử, Bộ môn Sinh

học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ Nấm sử dụng trong

thử nghiệm là nấm Fusarium oxysporum, Colletotrichum sp gây hại trên cây

trồng và nấm Achlya gây hại trên thủy sản

Phương pháp thực hiện

Nấm Fusarium oxysporum và Colletotrichum sp được cung cấp từ

Phòng Bệnh học cây trồng, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng,

Trường Đại học Cần Thơ Nấm Achlya được cung cấp từ Phòng vi nấm, Bộ

môn bệnh học Thủy sản, khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Các nấm

này được duy trì trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)

Nấm gốc được phân lập và nuôi cấy trên các đĩa petri vô trùng chứa môi

trường PDA Cấy tơ nấm ở giữa thạch, để ở nhiệt độ phòng cho nấm mọc lan

tỏa trên đĩa thạch từ 4 đến 6 ngày thì sử dụng để khảo sát hoạt tính

Môi trường nuôi cấy là PDA (thạch đường khoai tây):

 Khoai tây: 200 g

 D-Glucose: 20 g

 Agar: 20 g

 Nước cất: 1 L

Chuẩn bị môi trường

Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt nhỏ Cho khoai tây vào nồi thêm nước cất

vừa đủ 500 mL, đun sôi khoảng 45 phút Lọc lấy dịch trong, thêm nước cất

vừa đủ 1 lít Tiến hành đo pH và điều chỉnh pH trong khoảng 6,8-7 Cho lượng

agar và glucose vào dịch khoai tây khuấy cho tan hết Hấp khử trùng bằng nồi

hấp Autoclave ở 121C trong 30 phút Đĩa petri được khử trùng nhiệt khô bằng tủ sấy ở 160C trong 2,5 giờ

Đối với cao nước: pha cao nước tương ứng từng nồng độ xác định rồi phân phối vào môi trường PDA chưa đông (để nguội khoảng 450 C) Mẫu không có cao nước là mẫu đối chứng

Dùng khoang đường kính lỗ 7 mm đục lỗ giữa các đám tơ nấm sinh trưởng trên môi trường PDA trong các đĩa petri (giống gốc), sau đó dùng kẹp mũi nhọn lấy tơ nấm cấy vào giữa các đĩa môi trường chứa mẫu thử ở nồng độ cần khảo sát Mẫu đối chứng là mẫu không có cao chiết

Ủ các đĩa đã cấy nấm ở nhiệt độ phòng Theo dõi bán kính sinh trưởng

của tơ nấm từ 4-6 ngày, đến khi tơ nấm ở lô đối chứng mọc tỏa hết đĩa thạch

Đo bán kính phát triển của tơ nấm, ghi nhận kết quả Lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy giá trị trung bình

Giá trị phần trăm (%) ức chế sinh trưởng của nấm được tính theo công

thức:

BK1

BK2 BK1





Trong đó:

BK1: bán kính tơ nấm trung bình ở lô đối chứng

BK2: bán kính tơ nấm trung bình ở lô thí nghiệm

Từ % ức chế sinh trưởng nấm của ngày cuối cùng tương ứng với lô đối chứng đã tỏa đầy đĩa, xây dựng phương trình tuyến tính giữa giá trị của nồng

độ đã xử lý (x) và phần trăm ức chế (y) đối với từng loại mẫu thử, phương trình này có dạng y=ax+b Dựa vào phương trình tính được nồng độ mẫu thử nghiệm để ức chế 50% sự sinh trưởng của nấm, tức giá trị IC50

Bảng 3.3: Nồng độ các mẫu thử tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế nấm

Fusarium oxysporum

Cao methanol vỏ Quách 0 30 60 120 240 480

Cao ethanol vỏ Quách 0 35 70 140 280 560

Cao methanol hạt Quách 0 20 40 80 160 320

Cao nước vỏ Quách 0 50 100 300 700 1200 1600

Cao nước hạt Quách 0 50 100 200 400 800 1200

Bảng 3.4: Nồng độ các mẫu thử tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế nấm

Colletotrichum sp

Cao methanol vỏ Quách 0 80 160 320 640 1280

Cao ethanol vỏ Quách 0 90 180 360 720 1440

Cao methanol hạt Quách 0 50 100 200 400 800

Cao nước vỏ Quách 0 70 140 280 560 1120 2240 Cao nước hạt Quách 0 60 120 240 480 960 1920

Bảng 3.5: Nồng độ các mẫu thử tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế nấm

Achlya

Cao methanol vỏ Quách 0 20 40 80 160 320

Cao ethanol vỏ Quách 0 40 80 160 320 480

Cao methanol hạt Quách 0 15 30 60 120 240

Cao nước vỏ Quách 0 50 100 300 500 1000

Cao nước hạt Quách 0 50 100 200 400 800

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của các cao chiết

Bảng 4.1: Kết quả định tính thành phần hóa học có trong cao methanol và ethanol của vỏ và hạt trái Quách

Nhóm chức Thuốc thử Hiện tượng

Kết quả Cao

MeOH

vỏ Quách

Cao EtOH

vỏ Quách

Cao MeOH hạt Quách

Flavonoid FeCl3 Kết tủa màu xanh

đen, nâu đỏ

H2SO4 đậm đặc

Kết tủa đỏ, vàng hay cam

Triterpenoid

- steroid

Burchard

Liebermann-Lục, đỏ, xanh dương

+ Dương tính

- Âm tính

Bảng 4.2: Kết quả định tính thành phần hóa học có trong cao nước của vỏ và hạt trái Quách

Nhóm chức Thuốc thử Hiện tượng

Kết quả Cao nước

vỏ Quách

Cao nước hạt Quách

Flavonoid FeCl3 Kết tủa màu xanh

đen, nâu đỏ

H2SO4 đậm đặc

Triterpenoid

- steroid

Burchard

Liebermann-Lục, đỏ, xanh dương

+ Dương tính

- Âm tính

4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum của

cao chiết vỏ và hạt trái Quách

4.2.1 Tác động ức chế nấm Fusarium oxysporum của cao methanol

vỏ Quách

Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum của cao

methanol vỏ Quách như phương pháp ở Chương 3, mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình bán kính tơ nấm Từ bán kính trung bình tơ nấm ở mỗi nồng độ khác nhau suy ra được phần trăm ức chế theo bảng sau:

Bảng 4.3: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Fusarium

oxysporum của cao methanol vỏ Quách

Hình 4.1: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Fusarium oxysporum theo

nồng độ của cao methanol vỏ Quách

Từ phương trình tuyến tính y = 0,2064x + 9,5323 suy ra được IC50 của cao methanol vỏ Quách là 196,06 g/mL và nồng độ ức chế 100% là 480 g/mL

y = 0.2064x + 9.5323 R² = 0.9357 0

4.2.2 Tác động ức chế nấm Fusarium oxysporum của cao ethanol vỏ

Quách

Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum của cao

ethanol vỏ Quách như phương pháp ở Chương 3, mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình bán kính tơ nấm Từ bán kính trung bình tơ nấm ở mỗi nồng độ khác nhau suy ra được phần trăm ức chế theo bảng sau:

Bảng 4.4: Nồng độ, bán kính phát triển và phần trăm ức chế nấm Fusarium

oxysporum của cao ethanol vỏ Quách

Hình 4.2: Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế nấm Fusarium oxysporum theo

nồng độ của cao ethanol vỏ Quách

Từ phương trình tuyến tính y = 0,1705x + 13,52 suy ra được IC50 của cao ethanol vỏ Quách là 213,96 g/mL và nồng độ ức chế 100% là 560 g/mL

y = 0.1705x + 13.52 R² = 0.9162