KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO DICHLOROMETHANE CỦA CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.)

[±]-trans-Dihydrodiconiferyl alcolhol 2.3.2 Các nghiên cứu ở trong nước Năm 2016, một nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây An Xoa Helicteres hirsuta Lour.: Ha

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO

DICHLOROMETHANE CỦA CÂY AN XOA

(HELICTERES HIRSUTA LOUR.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa dược

2017

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO

DICHLOROMETHANE CỦA CÂY AN XOA

(HELICTERES HIRSUTA LOUR.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa dược

Mã ngành: 52440112

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Tiến sĩ: LÊ THANH PHƯỚC

LỜI CẢM ƠN

Đề tài nghiên cứu khoa học này được thực hiện tại phòng Hóa Dược, khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ và động viên từ quý thầy cô và bạn bè Tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc:

Ts Lê Thanh Phước đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

và hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn anh Võ Đức Duy, anh Nguyễn Hữu Duyên và các bạn đã quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Nghiên cứu này tập trung vào cao dichloromethane Từ cao dichloromethane (6.82 g) phân lập được các hợp chất: betulin C30H50O2);

(3β)-3-Hydroxy-lup-20(29)-en-28-methyl ketone (C31H50O2); α-p-Hydroxy

truxillic acid (C18H16O6)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu có nguồn gốc rõ ràng, kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu là trung thực

và chưa từng được dùng trong bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày 07 tháng 04 năm 2017.

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xiv CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.2.1 Đối tượng nghiên cứu 1

1.2.2 Phạm vi nghiên cứu 1

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về cây An Xoa 3

2.1.1 Tên khoa học và phân loại 3

2.2 Các nghiên cứu về dược tính của cây An Xoa……… 4

2.3.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài 4

2.3.2 Các nghiên cứu ở trong nước 7

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 Phương tiện nghiên cứu 10

3.1.1 Hóa chất 10

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ……… 10

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu………… ………… … 10

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 10

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 10

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phuơng pháp lý thuyết 11

3.3.2 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây…… ….11

3.3.3 Các phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ 11

3.3.4 Các phương pháp phân tích cấu trúc……… … …… 11

3.4 THỰC NGHIỆM 3.4.1 Chuẩn bị nguyên liệu 12

3.4.2 Điều chế các loại cao 12

3.4.2.1 Điều chế cao ethanol 12

3.4.2.2 Điều chế cao petroleum ether 13

3.4.2.3 Điều chế cao dichloromethane 13

3.4.2.4 Điều chế cao ethyl acetate 13

3.4.2.5 Điều chế cao methanol 13

3.5 Phân lập, tinh chế các hợp chất từ cây An Xoa 3.5.1 Khảo sát phân đoạn DC2 16

3.5.2 Khảo sát phân đoạn DC4 17

3.5.3 Khảo sát phân đoạn DC5 18

3.5.4 Khảo sát phân đoạn DC6 19

3.5.5 Khảo sát phân đoạn DC7 20

3.5.6 Khảo sát phân đoạn DC10 21

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định cấu trúc và định danh hợp chất PHUOC-KY13 ……… 23

4.2 Xác định cấu trúc và định danh hợp chất PHUOC-KYHD03 ……… 27

4.3 Xác định cấu trúc và định danh hợp chất PHUOC-KY06

……… 34 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả sắc ký cột cao DC………15

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC2……….16

Bảng 3.3 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC4……….17

Bảng 3.4 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC5 ……… 18

Bảng 3.5 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC6……… ….19

Bảng 3.6 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC7……… … 20

Bảng 3.7 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC10……… … 22

Bảng 4.1 Số liệu phổ 1D-NMR của hợp chất PHUOC-KY13 23

Bảng 4.2 So sánh dữ liệu phổ của hợp chất PHUOC-KY13 và

BETULIN……….……… …24

Bảng 4.3 Thể hiện sự tương tác giữa proton với carbon trong phổ

HSQC của hợp chất PHUOC-KY13… ….……….24

Bảng 4.4 thể hiện sự tương tác giữa proton với carbon trong phổ HMBC của hợp chất PHUOC-KY13… ……… 26

Bảng 4.5 Dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất PHUOC-KYHD03 ……….28

Bảng 4.8 Thể hiện sự tương tác giữa proton với carbon trong phổ HMBC của hợp chất PHUOC-KYHD03 …… ………30

Bảng 4.9 Dữ liệu phổ 1D-NMR của hớp chất PHUOC-HD7 … 32

Bảng 4.10 Thể hiện sự tương tác giữa proton với carbon trong phổ HSQC của hợp chất PHUOC-HD7 (thể hiện một bên của công thức đối xứng)……….…… 32

Bảng 4.11 Thể hiện sự tương tác giữa proton với carbon trong phổ HMBC của hợp chất PHUOC-HD7 (thể hiện một bên của công thức đối xứng)….……… 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Thân lá và hoa cây An Xoa……… ………….3 Hình 3.1 Bột khô và bình ngâm mẫu 12 Hình 3.2 SKLM các cao 14

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình điều chế các loại cao từ cây An Xoa 14 Hình 3.4 Cột cao DC 15 Hình 3.5 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-KY06 ……… 17 Hình 3.6 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-KYHD01….…… 18 Hình 3.7 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-KY13 … ……… 19 Hình 3.8 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-KY04… ………….20 Hình 3.9 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-KYHD03….…… 21 Hình 3.10 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-HD07 ……… 22 Hình 4.1 Công thức cấu tạo của betulin (PHUOC-KY13)… … 27

Hình 4.2 Công thức cấu tạo của hợp chất (3β)-3-Hydroxy-lup-20(29)

-en- 28-methyl ketone……….……… …31

PHỤ LỤC 16: PHỔ HSQC CỦA PHUOC-KY13 81

PHỤ LỤC 17: PHỔ HMBC CỦA PHUOC-KY13 84

PHỤ LỤC 18: PHỔ 1H-NMR CỦA PHUOC-KYHD01 89

PHỤ LỤC 19: PHỔ 13C-NMR CỦA PHUOC-KYHD01 92

PHỤ LỤC 20: PHỔ DEPT CỦA PHUOC-KYHD01 95

PHỤ LỤC 21: PHỔ HSQC CỦA PHUOC-KYHD01 97

PHỤ LỤC 22: PHỔ HMBC CỦA PHUOC-KYHD01 99

PHỤ LỤC 23: PHỔ ESI-MS CỦA PHUOC-KYHD01 104

PHỤ LỤC 24: PHỔ 1H-NMR CỦA PHUOC-KY04 105

PHỤ LỤC 25: PHỔ 13C-NMR CỦA PHUOC-KY04 108

PHỤ LỤC 26: PHỔ DEPT CỦA PHUOC-KY04 112

PHỤ LỤC 27: PHỔ HSQC CỦA PHUOC-KY04 114

PHỤ LỤC 28: PHỔ HMBC CỦA PHUOC-KY04 118

PHỤ LỤC 29: PHỔ ESI-MS CỦA PHUOC-KY04 122

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

1(2)

D-NMR 1 (2) Direction Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan

Hz Hertz (đơn vị đo tần số)

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

IC50 Half-maximal Inhibitory Concentration

J Hằng số ghép spin

m Multiplet (mũi đa)

M Khối lượng phân tử

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1 Lý do chọn đề tài

Gần đây có nhiều thông tin trên các trang mạng đã đề cập đến cây An

Xoa có tên khoa học là Helicteres hirsuta Lour., loại cây này được cho là

một “thần dược” dùng để chữa khỏi các bệnh về gan Cây An xoa nổi lên nhờ truyền miệng tác dụng chữa trị bệnh gan hiệu quả Loại cây này còn được coi là khắc tinh của bệnh gan, chống viêm gan, giảm tích tụ mỡ trong gan, loại bỏ chất độc, tiêu diệt cũng như ngăn chặn sự phân đôi của các tế bào ung thư gan, tăng cường bài tiết dịch mật, tăng cường tuần hoàn, giải nhiệt, giảm đau, chống viêm An Xoa có thể chữa được cả bệnh ung thư gan, chữa được cả bệnh viêm gan

Theo kinh nghiệm dân gian rễ và lá được sử dụng làm thuốc Rễ chữa

lỵ, sởi, cảm mạo và làm thuốc tiêu độc, còn dùng chữa đái dắt Lá dùng ngoài trị mụn nhọt sưng lở [1,2]

Theo nghiên cứu của một nhóm nghiên cứu Indonesia thì cây An Xoa

(Helicteres hirsuta Lour.) có khả năng chống lại các tế bào ung thư [4]

Vì vậy, đề tài “TIẾP TỤC KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.)” Được tiến hành với mục

đích tìm hiểu về các hợp chất có khả năng trị bệnh trong cây An Xoa để có

cơ sở giải thích cho các bài thuốc dân gian, đồng thời góp phần vào quá trình tìm kiếm các hoạt chất mới phục vụ cho y học sau này

1.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Việc khảo sát chỉ tiến hành với nguồn nguyên liệu tươi ban đầu là thân,

lá và hoa cây An Xoa (Helicteres hirsuta Lour.) được thu hái ở Hòn Sơn, xã

Lại Sơn, huyện Kiên Hải, tỉnh Kiên Giang

1.2.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu trong quy mô phòng thí nghiệm

Nghiên cứu phân lập, tinh chế các hợp chất hữu cơ từ các cao chiết có hoạt tính kháng ung thư gan của cây An Xoa

Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đề tài góp phần xác định thành phần hóa học có trong thân, lá và hoa cây An Xoa, xác định hoạt tính các cao chiết hoặc chất Tìm hiểu những cấu trúc đặc trưng các hợp chất có hoạt tính và khả năng biến đổi cấu trúc để các hợp chất có hoạt tính tốt hơn Từ đó, tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn dược liệu của Việt Nam một cách hiệu quả

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về cây An Xoa

2.1.1 Tên khoa học và phân loại

Tên khoa học: Helicteres hirsuta Lour

Tên Việt Nam: An Xoa, Dó lông, Tổ kén cái, Con chuột, Tổ kén lông, Phân loại:

Giới: Plantae (Thực vật) Ngành: Magnoliphyta (Hạt kín) Lớp: Magnoliopsida (Hai lá mầm) Bộ: Malvales (Cẩm quỳ) Họ: Sterculiaceae (Trôm) Chi: Helicteres

Loài: Helicteres hirsuta Lour [3]

2.1.2 Mô tả thực vật

Đây là cây bụi cao 1-3 m, nhánh hình trụ, có lông, lá hình trái xoan dài 5-17 cm, rộng 2.5-7.5 cm, gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn, mép có răng không đều, mặt dưới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông, cuống

lá dài 0.8-4 cm, có lông, dễ rụng Cụm hoa là những bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá Hoa màu hồng hay đỏ, cuống hoa có khớp và có lá bắc dễ rụng, đài hình ống phủ lông hình sao, màu đỏ, chia 5 răng, cuốn bộ nhị có vân đỏ [1]

Hình 2.1 Thân lá và hoa cây An Xoa

2.1.3 Nguồn gốc, sinh thái và phân bố thực vật

Cây phân bố ở Ấn Ðộ, Việt Nam, Nam Trung Quốc, Campuchia, Indonesia và Philippines

Ở nước ta cây mọc phổ biến ở nhiều nơi Thường gặp trên các đồi cây bụi hoặc các savan cỏ Ra hoa kết quả từ tháng 7 đến tháng 11 [1]

2.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH CÂY AN XOA

Theo kinh nghiệm dân gian rễ và lá được sử dụng lam thuốc Rễ chữa

lỵ, sởi, cảm mạo và làm thuốc tiêu độc, còn dùng chữa đái dắt Lá dùng ngoài mụn nhọt sưng lở [1-2]

2.3 CÁC NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY AN XOA

2.3.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài

Theo nghiên cứu về chi Helicteres thì thành phần hóa học gồm flavonoid, quinon [5-8], cucurbitacin B, isocucurbitacin B [9]

Năm 2008, có công trình nghiên cứu đã phân lập được một số

tritecpenoid từ rễ của cây Helicteres angustifolia như: cinnamoyloxy]lup-20(29)-en-28-oic acid methyl ester, 3β-acetoxy-27-[(4- hydroxybenzoyl)oxy]lup-20(29)-en-28-oic acid, and 3β-acetoxy-27-[(4-

3β-acetoxy-27-[(E)-hydroxybenzoyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid methyl ester [10]

Hiện nay có công trình nghiên cứu về cây An Xoa ở Indonesia và đã phân lập được một số hợp chất [4]:

[±]-Pinoresinol

[±]-Medioresinol

[±]-Syringaresinol

[-]-Boehmenan H

[±]-trans-Dihydrodiconiferyl alcolhol

2.3.2 Các nghiên cứu ở trong nước

Năm 2016, một nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của cây An Xoa (Helicteres hirsuta Lour.): Hai cao PE và DC chiết từ

cây An Xoa được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư gan dòng Hep-G2 cho kết quả dương tính với giá trị IC50 lần lượt là 28.29 (µg/mL) và 30.30 (µg/mL) và phân lập được các hợp chất sau [19]:

Stigmasterol Stigmasterol được sử dụng trong phòng ngừa khối u và kháng oxy hóa Ngoài ra, stigmasterol còn có tiềm năng chữa viêm xương khớp (Tirtha

Ghosh et al., 2011)

Apigenin Apigenin có khả năng chống viêm, chống oxy hóa và ngăn ngừa ung

thư (Deendayal Patel et al., 2006)

7,4'-O-Methyl-8-O-sulphate isoscutellarein

Lupeol Lupeol có thể tiêu diệt và ngăn chặn sự lan truyền của tế bào ung thư Hợp chất lupeol có khả năng gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư gan

(Hep-G2) (El Deel K.S et al., 2003)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Hóa chất

- Methanol (ME) Chemsol

- Ethanol (EtOH) Chemsol

- Petroleum ether (PE) Chemsol

- Dichloromethane (DC) Chemsol

- Ethyl acetate (EA) Chemsol

- Bản mỏng silica gel 60 F254, Merck tráng sẵn

- Máy cô quay

- Silica gel 230-400 mesh (40-63 µm) Ấn Độ

- Bản silica gel 60 F524, Merck tráng sẵn

- Một số loại dụng cụ thủy tinh dùng để ly trích:

+ Bình cô quay loại 250 mL, 500 mL

+ Bình lóng 250 mL, 500 mL

+ Becher 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL

+ Ống đong 5 mL, 10 mL, 100 mL

+ Phễu, đũa thủy tinh, giấy lọc

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp lý thuyết

- Nghiên cứu trên internet, sách, giáo trình, báo,

- Tổng quan tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật cây An Xoa

- Tìm hiểu tình hình sử dụng của cây trong thực tế

- Tham khảo công trình nghiên cứu có liên quan

- Nghiên cứu các phương pháp định tính các hợp chất tự nhiên

- Nghiên cứu phương pháp chiết rắn-lỏng, lỏng-lỏng, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột

- Dự kiến quy trình thực hiện

3.3.2 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng được áp dụng nhiều hơn bao gồm sự ngâm dầm, sự trích hệ thống chiết Soxhlet,… Ngoài ra, còn có thể chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (lưu chất siêu tới hạn) [10]

Đề tài sử dụng kỹ thuật chiết ngâm dầm để chiết mẫu cây và kỹ thuật chiết lỏng-lỏng để phân chia cao alcol thô ban đầu thành những phân đoạn

có tính phân cực khác nhau

3.3.3 Các phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ

Cô lập hợp chất hữu cơ chủ yếu dựa vào sắc ký Tùy vào mục đích và bản chất của mẫu chất cần sắc ký hoặc tùy vào trạng thái pha tĩnh và pha động,… Sắc ký được chia làm nhiều loại [11]

Đề tài sử dụng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký cột pha thường (SKC)

3.3.4 Các phương pháp phân tích cấu trúc

Phân tích cấu trúc dựa vào các phương pháp phổ như phổ khối lượng (MS), phổ 1H-NMR và 13C-NMR với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tùy theo chất cụ thể [12]

3.4 Thực nghiệm 3.4.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu được thu ở Hòn Sơn, xã Lại Sơn, huyện Kiên Hải, tỉnh Kiên Giang

Sau khi thu hái về, loại bỏ phần vàng úa, rửa sạch, để ráo nước, bào mỏng, phơi khô, khối lượng mẫu tươi là 36.7 kg

3.4.2 Điều chế các loại cao 3.4.2.1 Điều chế cao ethanol

Hình 3.1 Bột khô và bình ngâm mẫu

Toàn bộ 13.7 kg bột nguyên liệu được cho vào các túi vải, buộc kín miệng và ngâm dầm trong bình thủy tinh lớn bằng dung môi ethanol 96% Ngâm bột nguyên liệu ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, sau đó lọc dịch chiết bằng giấy lọc và cô quay thu hồi dung môi Lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi có được cao tổng (cao ethanol) có khối lượng m1 = 200 g Hòa tan cao tổng với một lượng nước xấp xỉ 1:1, sau đó tiến hành chiết lỏng-lỏng với các

3.4.2.2 Điều chế cao petroleum ether

Lấy 200 g cao ethanol đã hòa với nước cho vào bình lóng 1000 mL, rót thêm vào bình lóng khoảng 200 mL dung môi ether dầu hỏa Lắc đều và để yên bình lóng trên giá đỡ cho đến khi hỗn hợp trong bình lóng tách thành 2 lớp Mở khóa lấy dịch chiết PE ở lớp trên, lớp dưới tiếp tục chiết với PE cho đến khi màu của lớp PE phía trên nhạt dần và được kiểm tra bằng SKLM, vừa chiết vừa cô quay thu hồi dung môi thu được cao PE (m2 = 106.8 g)

3.4.2.3 Điều chế cao dichloromethane

Lấy phần cao ethanol đã chiết PE cho vào bình lóng cùng với dung môi

DC, mỗi lần cũng chiết khoảng 200 mL Lắc nhẹ đều và để yên bình lóng trên giá đỡ, sau đó tách lấy dịch chiết DC ở phía dưới Thực hiện lặp đi lặp lại nhiều lần, kiểm tra dịch chiết DC bằng SKLM, vừa chiết vừa cô quay thu hồi dung môi cuối cùng thu được cao DC (m3= 21.2 g)

3.4.2.4 Điều chế cao ethyl acetate

Tiếp tục lấy phần cao ethanol đã chiết DC cho vào bình lóng, rót thêm vào 200 mL dung môi EA Lắc đều và để yên, tách lấy dịch chiết EA ở trên, chiết nhiều lần và kiểm tra bằng SKLM, vừa chiết vừa cô quay thu hồi dung môi cuối cùng thu được cao EA (m4= 18.5 g)

3.4.2.5 Điều chế cao methanol

Tiếp tục lấy phần cao ethanol đã chiết EA cho vào bình lóng, rót thêm vào 200 mL dung môi ME Lắc đều và để yên, tách lấy dịch chiết ME ở trên, chiết nhiều lần và kiểm tra bằng SKLM, vừa chiết vừa cô quay thu hồi dung môi cuối cùng thu được cao ME (m5= 16.6 g)

Sau khi điều chế bốn cao tiến hành SKLM cao ethanol, cao petroleum ether, cao dichloromethane, cao ethyl acetace với hệ giải ly PE:EA = 4:1 được kết quả như hình:

Cao PE

Cao tổng

200 g

Cao DC Cao EA Cao ME

Rửa sạch, sấy khô ở 60oC

Ngâm dầm trong cồn 96%

Chiết lỏng-lỏng với các dung môi

3.5 Phân lập, tinh chế các hợp chất từ cây An Xoa

** Khảo sát phân đoạn cao chiết dichloromethane

Lấy 6.82 gam cao DC để chuẩn bị nạp cột với thông số cột như sau: Đường kính cột sắc ký: d = 4 cm

12 phân đoạn (DC1-DC12)

Bảng 3.1 Kết quả sắc ký cột cao DC

Các phân đoạn DC

Hệ dung môi giải ly cột

Kết quả SKLM Khối

lượng (miligam) DC1 PE = 100% Nhiều vết mờ 30

DC2 PE:EA = 15:1 Có vết tím rõ 50 DC3 PE:EA = 12:1 Có vết tím rõ 55 DC4 PE:EA = 10:1 Nhiều vết 57 DC5 PE:EA = 9:1 Có vết tím rõ 60

DC6 PE:EA = 9:1 Có vết tím rõ 55 DC7 PE:EA = 9:1 Có vết tím rõ 58 DC8 PE:EA = 7:1 Kéo vệt 75 DC9 PE:EA = 4:1 Kéo vệt 89 DC10 PE:EA = 2:1 Nhiều vết, có vết tím sen 105 DC11 EA = 100% Nhiều vết , kéo vệt 100 DC12 ME = 100% Nhiều vết, kéo vệt

Sau khi giải ly cột cao DC thu được 12 phân đoạn nhỏ và ký hiệu DC12) Chọn những phân đoạn có vết chính rõ đậm tiếp tục khảo sát để thu được chất sạch

(DC1-3.5.1 Khảo sát phân đoạn DC2

Sau khi SKLM tìm được hệ giải ly cột phù hợp tiến hành nạp mẫu và giải ly cột với hệ dung môi thay đổi tăng dần độ phân cực PE:EA (20:1, 15:1, 10:1) và cuối cùng là EA 100% Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ thủy tinh có thể tích từ 10-15 mL và sử dụng SKLM để theo dõi quá trình giải ly cột hiện vết bằng bằng thuốc thử vaniline trong MeOH và H2SO4 10% Các lọ thủy tinh có cùng kết quả SKLM thì gom thành một phân đoạn Kết quả ở hệ giải ly PE:EA = 15:1 (DC2.2) thu được 10 mg hợp chất kết tinh hình kim Sắc ký lớp mỏng cho vết màu tím trong thuốc thử vaniline trong MeOH và H2SO4 10% có Rf = 0.69 với dung môi giải ly PE:EA = 2:1 ký

hiệu hợp chất này là PHUOC-KY06

Thực hiện sắc ký cột phân đoạn DC2 với thông số cột:

- Đường kính cột sắc ký: d = 1 cm

- Chiều dài cột: l = 50 cm

- Khối lượng silica gel nhồi cột: 15 g

- Khối lượng DC2: 50 miligam

- Dung môi ổn định cột: PE:EA = 20:1

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC2

Hình 3.5 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-KY06

3.5.2 Khảo sát phân đoạn DC4

Tiến hành hòa tan và kết tinh lại phân đoạn DC4 lần lượt với các dung môi (PE = 100; EA = 100; ME = 100).Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ thủy tinh có thể tích từ 10-15 mL và sử dụng SKLM để theo dõi quá trình rửa hiện vết bằng bằng thuốc thử vaniline trong MeOH và H2SO4 10% Các lọ thủy tinh có cùng kết quả SKLM thì gom thành một phân đoạn Kết quả ở ME = 100 thu được phân đoạn DC4.3 được giải ly trong hệ PE:EA = 4:1 có vết màu tím đậm Rf= 0.4 với khối lượng 7 mg

Bảng 3.3 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC4

Hình 3.6 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-KYHD01

3.5.3 Khảo sát phân đoạn DC5

Tiến hành hòa tan và kết tinh lại phân đoạn DC4 lần lượt với các dung môi (PE = 100%; EA = 100%; ME = 100%) Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ thủy tinh có thể tích từ 10-15 mL và sử dụng SKLM để theo dõi quá trình rửa hiện vết bằng bằng thuốc thử vaniline trong MeOH và H2SO410% Các lọ thủy tinh có cùng kết quả SKLM thì gom thành một phân đoạn Kết quả ở ME = 100 thu được phân đoạn DC5.3 được giải ly trong hệ dung môi PE:EA = 4:1 có vết màu tím đậm Rf = 0.37 với khối lượng 7 mg

Bảng 3.4 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC5

Hình 3.7 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-KY13

3.5.4 Khảo sát phân đoạn DC6

Tiến hành hòa tan và kết tinh lại phân đoạn DC6 lần lượt với các dung môi (PE = 100%; EA = 100%; ME = 100%) Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ thủy tinh có thể tích từ 10-15 mL và sử dụng SKLM để theo dõi quá trình rửa hiện vết bằng bằng thuốc thử vaniline trong MeOH và H2SO410% Các lọ thủy tinh có cùng kết quả SKLM thì gom thành một phân đoạn Kết quả ở ME = 100 thu được phân đoạn DC6.3 được giải ly trong hệ dung môi PE:EA = 1:1 có vết màu tím đậm có Rf = 0.74 khối lượng 9 mg

Bảng 3.5 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC6

Hình 3.8 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-KY04

3.5.5 Khảo sát phân đoạn DC7

Tiến hành hòa tan và kết tinh lại phân đoạn DC7 lần lượt với các dung môi (PE = 100%; EA = 100%; ME = 100%).Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ thủy tinh có thể tích từ 10-15 mL và sử dụng SKLM để theo dõi quá trình rửa hiện vết bằng bằng thuốc thử vaniline trong MeOH và H2SO410% Các lọ thủy tinh có cùng kết quả SKLM thì gom thành một phân đoạn Kết quả ở ME = 100 thu được phân đoạn DC7.3 được giải ly trong hệ dung môi PE:EA = 4:1 có vết màu tím đậm có Rf = 0.33 có vết màu tím đậm với khối lượng 8 mg

Bảng 3.6 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC7

Hình 3.9 SKLM và mẫu hợp chất PHUOC-KYHD03

3.5.6 Khảo sát phân đoạn DC10

Sau khi SKLM tìm được hệ giải ly cột phù hợp tiến hành nạp mẫu và giải ly cột với hệ dung môi thay đổi tăng dần độ phân cực PE:EA (7:1; 4:1; 2:1; 1:1; 1:2) và cuối cùng là ME 100% Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ thủy tinh có thể tích từ 10-15 mL và sử dụng SKLM để theo dõi quá trình giải ly cột hiện vết bằng bằng thuốc thử vaniline trong MeOH và H2SO4

10% Các lọ thủy tinh có cùng kết quả SKLM thì gom thành một phân đoạn Kết quả ở hệ giải ly PE:EA = 1:2 thu được phân đoạn DC10.5 được giải ly trong hệ dung môi PE:EA = 1:4 (vài giọt acetic acid) có vết màu tím sen có

Rf = 0.44 với khối lượng là 12 mg

Thực hiện sắc ký cột phân đoạn DC10 với thông số cột:

Bảng 3.7 Kết quả sắc ký cột cao phân đoạn DC10

Các phân đoạn DC10

Hệ dung môi giải ly cột SKLM

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định cấu trúc và định danh hợp chất PHUOC-KY13

Kết quả ở ME = 100 thu được phân đoạn DC4.3 được giải ly trong hệ dung môi PE:EA = 4:1 có vết màu tím đậm Rf = 0.37 với khối lượng 7 mg Tinh thể dạng bột, màu trắng

Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO, δH ppm) cho thấy ở δH ppm 2.97

có tính hiệu proton của nhóm oxymethin đặc trưng ở vị trí C-3 của hợp chất pentcyclic triterpenoid Một nhóm isopropenyl ở δH ppm 4.66 (1H, d, 2.5 Hz), 4.53 (1H, dd,1 Hz) và 1.63 (3H, s) và có 6 tín hiệu của 6 methyl tại δH

ppm 0.66-1.63 Ngoài ra, có xuất hiện 3 tín hiệu proton ở δH ppm 3.52 (1H,

d, 10.5 Hz), 3.09 (1H, d, 10 Hz) và 2.38 (1H, m)

Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δC ppm) kết hợp với phổ DEPT90,

DEPT135 của hợp chất PHUOC-KY13 cho tín hiệu của 30 nguyên tử

carbon, có 6 carbon bậc bốn, 6 carbon methine, 12 carbon methylen và 6 carbon methyl đặc trưng cho một hợp chất triterpen khung lupan Sự có mặt của nhóm isopropenyl được xác định bởi 1 carbon methyl tại δC ppm 18.7 và

1 liên kết đôi tại δC ppm 150.3, 109.5 Tín hiệu của 1 carbon oxymethine tại

δC ppm 76.8 và 1 carbon oxymethylen tại δC ppm 57.9 cho phép xác định có

2 nhóm hydroxyl trong phân tử của hợp chất

Bảng 4.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PHUOC-KY13

Vị trí C/H

δ H ppm

(số H, tín hiệu mũi, J

Hz)

δC ppm

DEPT 135 DEPT 90 KẾT

LUẬN

1 38.2 Mũi âm Biến mất -CH2-

2 26.6 Mũi âm Biến mất CH2-

54.8 Mũi dương Mũi dương >CH-

6 17.9 Mũi âm Biến mất -CH2-

7 33.8 Mũi âm Biến mất -CH2-

13 36.7 Mũi dương Mũi dương >CH-

14 42.2 Biến mất Biến mất >C<

15 27.1 Mũi âm Biến mất -CH2-

16 29.3 Mũi âm Biến mất -CH2-

21 29.0 Mũi âm Biến mất -CH2-

22 33.8 Mũi âm Biến mất -CH2-

23 0.87 (3H, s) 28.1 Mũi dương Biến mất -CH3

24 0.66 (3H, s) 15.7 Mũi dương Biến mất -CH3

25 0.77 (3H, s) 15.9 Mũi dương Biến mất -CH3

26 0.98 (3H, s) 14.5 Mũi dương Biến mất -CH3

27 0.93 (3H, s) 15.7 Mũi dương Biến mất -CH3

18.7 Mũi dương Biến mất -CH3

Bảng 4.2 So sánh dữ liệu phổ của hợp chất PHUOC-KY13 với hợp chất

betulin

Vị trí C/H