PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO DICHLOROMETHANE CỦA THÂN CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del.), HỌ CÚC (Asteraceae)

Nghiên cứu thành phần hóa học thân cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) thu hái ở quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ. Kết quả cho thấy từ phân đoạn cao chiết dichloromethane của thân cây Lá đắng phân lập được hợp chất syringaresinol-β-D-glucoside. Cấu trúc của hợp chất được xác định bằng phương pháp phổ hiện đại 1D-NMR, 2D-NMR và so sánh với tài liệu đã công bố.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN HOÀNG LƯƠNG

PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO DICHLOROMETHANE CỦA THÂN CÂY LÁ ĐẮNG

(Vernonia amygdalina Del.), HỌ CÚC (Asteraceae)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN HOÀNG LƯƠNG

PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO DICHLOROMETHANE CỦA THÂN CÂY LÁ ĐẮNG

(Vernonia amygdalina Del.), HỌ CÚC (Asteraceae)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts TÔN NỮ LIÊN HƯƠNG

2017

LỜI CẢM ƠN

Qua quá trình tham gia thực hiện đề tài nghiên cứu, em đã học tập được rất nhiều kiến thức, kinh nghiệm và kỹ năng chuyên môn bổ ích từ quý thầy cô, bạn bè Để hoàn thành tốt luận văn này em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến:

Ts Tôn Nữ Liên Hương, người cô kính mến, cô đã hết lòng giúp đỡ, quan tâm và dìu dắt trong suốt khóa luận Cô đã tận tình truyền đạt kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần để em có thể hoàn thành tốt luận văn

Quý thầy cô khoa Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho em những kiến

thức và kinh nghiệm quý báu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để học tập

và hoàn thành khóa luận

Các bạn lớp hóa dược 2 cùng anh, chị và bạn bè phòng Hóa Hữu Cơ – khoa Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giúp đỡ và gắn bó với em trong suốt thời gian qua

Lời cuối cùng cũng là lời biết ơn sâu sắc nhất con xin gửi đến cho cha mẹ

đã luôn bên cạnh, chăm sóc, động viên và tạo mọi điều kiện cho con học tập

Xin chân thành cảm ơn !

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: “Phân lập hợp chất từ cao dichloromethane của thân cây Lá

đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ Cúc (Asteraceae)”

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hoàng Lương MSSV: B1304062

Lớp: KH13Y2A2 Khóa: 39

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (Ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2017

Cán bộ hướng dẫn

Ts Tôn Nữ Liên Hương

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện:

2 Đề tài: “Phân lập hợp chất từ cao dichloromethane của thân cây Lá

đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ Cúc (Asteraceae)”

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hoàng Lương MSSV: B1304062

Lớp: HK13Y2A2 Khóa: 39

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (Ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2017

Cán bộ phản biện

TÓM TẮT

Nghiên cứu thành phần hóa học thân cây Lá đắng (Vernonia amygdalina

Del.) thu hái ở quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ Kết quả cho thấy từ phân

đoạn cao chiết dichloromethane của thân cây Lá đắng phân lập được hợp chất

phương pháp phổ hiện đại 1D-NMR, 2D-NMR và so sánh với tài liệu đã công

bố

Từ khóa: Vernonia amygdalina Del., syringaresinol-β- D -glucoside

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH SÁCH PHỤ LỤC ix

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT x

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đa ̣i cương thực vâ ̣t 3

2.1.1 Giới thiệu cây Lá đắng 3

2.1.2 Mô tả chi tiết về cây Lá đắng 3

2.1.3 Nguồn gốc, phân bố và sinh thái 4

2.2 Thành phần hoá ho ̣c 5

2.3 Tác du ̣ng dược lý của cây Lá đắng 5

2.3.1 Một số công du ̣ng trong y ho ̣c dân gian 5

2.3.2 Hoạt tính sinh ho ̣c của cây Lá đắng đã được nghiên cứu 5

2.4 Những công trình nghiên cứu về cây Lá đắng 6

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 6

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 7

2.5 Tổng hợp, đánh giá các nghiên cứu về cây Lá đắng 7

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Phương tiện nghiên cứu 15

3.1.1 Hóa chất 15

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 15

3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

3.2.1 Phương pháp chiết xuất 15

3.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 16

3.2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất 16

3.3 Thực nghiệm 16

3.3.1 Thu hái và xử lý mẫu 16

3.3.2 Điều chế các loại cao 16

3.3.3 Phân lập hợp chất từ cao dichloromethane 18

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Xác định cấu trúc hợp chất TVA.DC02 20

4.2 Xác định cấu trúc hợp chất TVA.DC03 20

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 24

5.1 Kết luận 24

5.2 Kiến nghị 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

PHỤ LỤC 28

DANH SÁCH BẢNG

Ba ̉ ng 2.1 Thành phần hoá ho ̣c đã được công bố của cây Lá đắng 8

Bảng 3.1 Kết quả sắc ký cột cao dichloromethane 19

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký cột phân đoạn P4 19

Bảng 4.1 Dữ liệu phổ 1D-NMR và 2D-NMR của TVA.DC03 21

Bảng 4.2 Dữ liệu phổ 1D-NMR của TVA.DC03 và syringaresinol-β-D-glucoside 22

DANH SÁCH HÌNH

Hi ̀nh 2.1 Cây Lá đắng 4

Sơ đồ 3.1 Quy trình điều chế cao từ thân cây Lá đắng 18 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất TVA.DC03 21

DANH SÁCH PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA TVA.DC02 VÀ TVA.DC03 28

Phụ lục 1.1 Bản mỏng TVA.DC02 28

Phụ lục 1.2 Bản mỏng TVA.DC03 28

PHỤ LỤC 2: CÁC PHỔ CỦA TVA.DC02 29

Phụ lục 2.1 Phổ 1H-NMR của TVA.DC02 29

Phụ lục 2.2 Phổ 13C-NMR của TVA.DC02 30

PHỤ LỤC 3: CÁC PHỔ CỦA TVA.DC03 31

Phụ lục 3.1 Phổ 1H-NMR của TVA.DC03 31

Phụ lục 3.2 Phổ 1H-NMR giãn rộng của TVA.DC03 32

Phụ lục 3.3 Phổ 1H-NMR giãn rộng của TVA.DC03 33

Phụ lục 3.4 Phổ 13C-NMR của TVA.DC03 34

Phụ lục 3.5 Phổ 13C-NMR giãn rộng của TVA.DC03 35

Phụ lục 3.6 Phổ 13C-NMR giãn rộng của TVA.DC03 36

Phụ lục 3.7 Phổ DEPT-NMR của TVA.DC03 37

Phụ lục 3.8 Phổ DEPT-NMR giãn rộng của TVA.DC03 38

Phụ lục 3.9 Phổ HSQC của TVA.DC03 39

Phụ lục 3.10 Phổ HSQC giãn rộng của TVA.DC03 40

Phụ lục 3.11 Phổ HSQC giãn rộng của TVA.DC03 41

Phụ lục 3.12 Phổ HMBC của TVA.DC03 42

Phụ lục 3.13 Phổ HMBC giãn rộng của TVA.DC03 43

Phụ lục 3.14 Phổ HMBC giãn rộng của TVA.DC03 44

Phụ lục 3.15 Phổ HMBC giãn rộng của TVA.DC03 45

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

1D-NMR One Direction Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

2D-NMR Two Direction Nuclear Magnetic Resonance

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam là một nước nằm trong khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa nên có hệ thực vật rất đa dạng và phong phú Theo ước tính nước ta có khoảng gần 13000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4000 loài được sử dụng làm thuốc Việc sử dụng nguồn tài nguyên đó để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khỏe cho con người đã có một quá trình lịch sử hàng nghìn năm và ngày càng trở nên quan trọng

Ngoài sự đa dạng về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị to lớn ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa nhiều loại bệnh khác nhau Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc quý giá Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được khoa y – dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng

Cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) là một loại cây thuộc họ Cúc

được sử dụng phổ biến trong dân gian như một loại rau ăn cũng như để điều trị một số bệnh như sốt, sốt rét, tiêu chảy, kiết lỵ, hỗ trợ điều trị đái tháo đường,… Trên thế giới, cây Lá đắng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học và dược lý học Tuy nhiên ở Việt

Nam các nghiên cứu về loài này còn rất hạn chế Do đó đề tài “Phân lập hợp

chất từ cao dichloromethane của thân cây Lá đắng (Vernonia amygadalina

Del.), họ Cúc (Asteraceae)” được thực hiện

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cao dichloromethane củ a thân cây Lá đắng (Vernonia

amygdalina Del.) nhằm đóng góp thêm thông tin về thành phần hóa học của loài

cây này

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là phần thân của cây Lá đắng (Vernonia

Kiều, thành phố Cần Thơ

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cao chiết

dichloromethane phần thân của cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.)

1.4 Nội dung nghiên cứu

Nguyên liệu là phần thân của cây Lá đắng (Vernonia amygadalina Del.)

tại quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ được thu hái và xử lý Sử dụng kỹ thuật ngâm dầm mẫu bột nguyên liệu khô bằng methanol, cô đuổi dung môi để thu cao methanol tổng

Áp dụng kỹ thuật chiết lỏng–lỏng với dung môi n-hexane, dichloro-

methane, ethyl acetate của thân cây Lá đắng

Sử dụng các phương pháp thường qui trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên như sắc ký cột, sắc ký nhanh – cột khô với các hệ dung môi thích hợp, kết tinh lại,… để cô lập hợp chất

Tiến hành phân tích, tìm phổ nghiệm, từ đó xác định cấu trúc của hợp chất Viết báo cáo luận văn

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đa ̣i cương thực vâ ̣t

2.1.1 Giới thiệu cây Lá đắng

Cây Lá đắng tên khoa học Vernonia amygdalina Del., là loại cây bụi lâu

năm thuộc họ Cúc (Asteraceae) phát triển khắp nơi ở vùng nhiệt đới châu Phi

Nó là cây thuốc được sử dụng nhiều nhất trong chi Vernonia [1]

Tên nước ngoài: Bitterleaf, common bitterleaf (English); vernonie, vernonie commune, ndole (France); sucumadeira, pau fede (Portuguese); Daun Bismillah (Malaysia) [2]

2.1.2 Tên go ̣i và phân loa ̣i thực vâ ̣t

● Tên go ̣i [2]

Tên khoa học: Vernonia amygdalina Del

Tên đồng nghĩa: Gymnanthemum amygdalinum Del

● Phân loa ̣i thực vâ ̣t [3]

Loài: Vernonia amygdalina

(Theo Global Biodiversity Information Facility : Vernonia amygdalina)

2.1.2 Mô ta ̉ chi tiết về cây Lá đắng [1, 4]

Thân: bụi hoặc cây nhỏ cao 1,5-3 m, nhiều nhánh; đường kính thân cây lên đến 40 cm; vỏ màu xám đến nâu, nhẵn, thân có nhiều nhánh nhỏ

La ́ : lá đơn, mọc so le; không có lá kèm, cuống lá dài 0,2-4 cm; phiến lá

hình mác hay hình trứng, dài 4-15 cm, rô ̣ng 1-4 cm, mép lá có răng cưa thô, lá non có lông tơ, gân lá hình lông chim

Hoa: hoa mọc thành cu ̣m ở đầu, chùm hoa hình tán; cuống hoa dài đến

1 cm, bao hoa hình tru ̣ hoă ̣c elip rô ̣ng, dài 3-5 mm, 3-7 be ̣ hoa liên tiếp nhau,

dài 1-4,5 mm, ép vào nhau Hoa lưỡng tính, thường có 5 phần, thò ra từ bao hoa;

mào lông bao ở phía ngoài, bên trong có tơ cứng màu kem hoă ̣c hơi nâu dài

4-7 mm; tràng hoa hình ống, dài 5-8 mm, màu trắng; nhi ̣ hoa với bao phấn hợp la ̣i trong 1 ống với phần phu ̣ ở đỉnh; nhuy ̣ hoa thấp

Qua ̉ : da ̣ng quả bế có 10 sọc, dài 1,5-3,5 mm, màu nâu đến đen, trên đỉnh

có chùm tơ cứng dài hơn

Hi ̀nh 2.1 Cây Lá đắng – A Cây; B Lá; C Hoa 2.1.3 Nguồn gốc, phân bố va ̀ sinh thái

Cây Lá đắng mo ̣c hoang dã ở hầu hết các nước nhiê ̣t đới châu Phi, từ phía đông Guinea đến Somalia và phía nam đến đông bắc Nam Phi và ở Yemen Nó được trồng phổ biến như một loa ̣i rau ở Benin, Nigeria, Cameroon, Gabon và

Cộng hoà Congo Người Luhya ở phía tây Kenya sử du ̣ng cây Lá đắng như mô ̣t loại rau nhưng không trồng nó [2]

Cây Lá đắng mo ̣c tự nhiên do ̣c theo các sông và hồ, ở bìa rừng, rừng và

đồng cỏ, những nơi có đô ̣ cao đến 2000 m Nó thường mo ̣c ở những khu đất nông nghiệp bi ̣ bỏ hoang và trong các rừng thứ sinh Cây Lá đắng cần được trồng ở nơi có đầy đủ ánh sáng mă ̣t trời Loài cây này thích môi trường ẩm ướt

mặc dù nó chi ̣u ha ̣n khá Nó có thể mo ̣c được ở tất cả các loa ̣i đất, nhưng phát triển tốt nhất ở đất giàu mùn

C

2.2 Tha ̀nh phần hoá ho ̣c

Thành phần hoá ho ̣c của cây Lá đắng chứa saponin, flavonoid, alkaloid, terpene, steroid, courmarin, phenolic acid, lignan, xanthone, anthraquinone, edotide và sesquiterpene Các steroid glycoside gồm: vernonioside A1-A4, B1-B3, C, D, D2 và E; vernoamyoside A-D Các sesquiterpene lactone gồ m: vernolide, vernodalol, vernolepin, vernodalin, vernomygdin, vernomygdalin, hydroxyvernolide, vernodalinol, 11,13-dihydrovernolide , 11,13-dihydro-vernodalin và epivernodalol Các flavonoid gồm: luteolin, luteolin 7-О-β-

glucoroniside và luteolin 7-О-β-glucoside [2, 4, 11-18]

2.3 Ta ́ c du ̣ng dươ ̣c lý của cây Lá đắng

2.3.1 Mô ̣t số công du ̣ng trong y ho ̣c dân gian

Lá cây Lá đắng được dùng để điều trị sốt, sốt rét, tiêu chảy, kiết ly ̣, viêm gan và ho Nó còn được sử du ̣ng như mô ̣t loa ̣i thuốc cho bê ̣nh ghẻ, nhức đầu và đau da ̣ dày Dịch chiết từ rễ cũng được dùng để điều tri ̣ sốt rét và rối loa ̣n tiêu hoá [2,4]

Ở Nigeria, lá được dùng để đắp lên vết thương thay thế cho iodine Cây

Lá đắng là mô ̣t dược liệu phổ biến trong viê ̣c điều tri ̣ giun đường ruô ̣t, bao gồm giun tròn [2]

Ở Zimbabwe, nước sắc từ rễ được dùng để điều tri ̣ các bê ̣nh lây truyền qua đường tình du ̣c Nước sắc từ vỏ cũng dùng điều tri ̣ sốt rét và tiêu chảy, hoa khô chống rối loạn da ̣ dày [2]

2.3.2 Hoa ̣t tính sinh ho ̣c của cây Lá đắng đã được nghiên cứu

Năm 1999, nghiên cứu của David A Akinpelu về cây Lá đắng cho kết

quả: cao chiết methanol 60% kháng 6 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis,

Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus ulgaris, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus ở nồng độ 25 mg/mL [5]

Năm 2006, P Erasto và cộng sự đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+), kháng nấm của sesquiterpene lactone được cô lập từ cây Lá đắng Nghiên cứu đã cô lập được hai sesquiterpene lactone: vernolide và vernodalol Hai hợp chất tiếp tục được tiến hành thử nghiệm với 10 chủng vi khuẩn và 5 loài nấm Cả hai hợp chất có khả năng kháng

5 chủng vi khuẩn Gram (+) Bacillus cereus, Staphylococcus epidermidus,

Staphylococcus aureus, Micrococcus kristinae, Streptococcus pyrogens Trong

thử nghiệm kháng nấm, vernolide cho hoạt tính cao với LC50 0,2; 0,3; 0,4

mg/mL kháng lần lượt Penicillium notatum, Aspergillus flavus, Aspergillus

niger, Mucorhiemalis Vernodalol kháng Aspergillus flavus, Penicillium

Năm 2008, Lecia J Gresham và các cộng sự đã nghiên cứu cho thấy cao chiết từ nước của lá cây Lá đắng có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư vú BT-549 với nồng độ 10, 100, 1000 µg/mL ức chế phát triển BT-549 tương ứng 14%, 22%, và 50% [7]

Năm 2013, qua nghiên cứu của Fang Cheng Wong và cộng sự cho thấy cao chiết ethanol 80% của lá cây Lá đắng gây ức chế hai dòng tế bào ung thư

vú MCF-7 và MDA-MB-231 [8]

Năm 2013, Adetunji và các cộng sự đã khảo sát hoạt động của vi khuẩn trong dịch chiết nóng, lạnh của methanol và nước của cây Lá đắng, kết quả cho thấy dịch chiết methanol nóng và lạnh kháng khuẩn mạnh hơn dịch chiết từ

nước, có thể kháng các dòng vi khuẩn S.aureus, P.aeruginosa và E Coli [9]

Trong một nghiên cứu năm 2013 của Keyuna S Camaron và cộng sự cho thấy dịch chiết cây Lá đắng có khả năng ức chế tổng hợp ADN của tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PC-3) Tế bào ung thư được điều trị với dịch chiết cây Lá đắng có nồng độ tăng dần 0,01; 0,1 và 1 mg/mL làm giảm sự tổng hợp ADN của tế bào tương ứng 12%, 45% và 73% [10]

Ngoài ra, còn có các nghiên cứu cho thấy cây Lá đắng được sử dụng trong việc kiểm soát bệnh đái tháo đường (Akah và Okafor, 1992; Atangwho và cô ̣ng

sự, 2010) Nó còn được dùng để chống giun sán, chống sốt rét, ha ̣ nhiệt, thuốc nhuận tràng và làm lành vết thương (Ijeh và Ejike, 2011) Ở Nigeria, thân cây

Lá đắng được nhai để vê ̣ sinh răng miê ̣ng và kiểm soát các vấn đề về răng (Ijeh

và Ejike, 2011) Cây Lá đắng còn có các hoạt tính như: kháng ung thư (Izevbigie 2003; Khalafalla và cộng sự, 2009), kháng khuẩn (Ibrahim và cô ̣ng sự, 2009), giải đô ̣c gan (Arhoghro và cô ̣ng sự, 2009), tính kháng oxi hoá (Adaramoye và

cộng sự, 2008) [2-4, 11]

2.4 Như ̃ng công trình nghiên cứu về cây Lá đắng

2.4.1 Ti ̀nh hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1969, S M Kupchan đã phân lâ ̣p được 2 sesquiterpene lactone mới: vernodalin và vernomygdin [12]

Năm 1972, E O Arene đã tách được 7,24(28)-stigmastadien- 3β-ol [13]

Năm 1983, Iraj Ganjian và các cô ̣ng sự đã cô lâ ̣p được vernodalin, vernodalol và 1 sesquiterpene lactone mới là 11,13-dihydrovernodalin [14] Laekeman và các cộng sự cũng cô lâ ̣p được vernolepin từ quả Lá đắng [15]

Năm 1991, Hajime Ohigashi và các cộng sự đã cô lâ ̣p được vernonioside A1 và vernonioside B1 [16]

Năm 1992, Mitsuo Jisaka và các cộng sự đã phân lâ ̣p được 4 steroid glycoside: vernonioside A1, A2, A3 và B1 [17]

Năm 1993, Mitsuo Jisaka và các cô ̣ng sự đã tìm ra được 3 steroid glycoside

mớ i: vernonioside A4, B2 và B3 [18]

Năm 1994, Godwin O Igile và các cộng sự đã cô lâ ̣p được 3 flavone:

luteolin, luteolin 7-O-β-glucuronoside va ̀ luteolin 7-O-β-glucoside [19] Năm

1995 nhó m nghiên cứu này tiếp tu ̣c tìm ra được 2 steroid glycoside mới: vernonioside D và E [20]

Năm 2010, Olatunde Owoeye và các cô ̣ng sự đã phân lâ ̣p được epivernodalol – có hoa ̣t tính chống la ̣i dòng tế bào HT-114 (u hắc tố da) [21] Xuan Luo và các cộng sự cũng phân lâ ̣p được vernodalinol – có hoa ̣t tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú (MCF-7) [22]

Năm 2015, M M Zenebe và các cô ̣ng sự đã cô lâ ̣p được hợp chất MM-4 (3-amino-5-methylhex-5-enyl 3-amino-6-methylhept-6-enyl terephthalate) [23] Annamaria Sinisi và các cộng sự cũng tìm ra được 3 sesquiterpene lactone

mớ i: 14-O-methylvernolide, 3′-deoxyvernodalol, vernomygdalin và

5 sesquiterpene lactone đã biết: vernolide, 11,13-dihydrovernolide, 3′-hydroxyvernolide, vernodalol và 12-methoxyvernolepin [24]

Năm 2016, Olga Quasie và các cộng sự đã phân lâ ̣p được 4 steroid saponin

mớ i: vernoamyoside A, B, C và D [25]

2.4.2 Ti ̀nh hình nghiên cứu trong nước

Trước năm 2016, chưa có công trình nghiên cứu nào trong nước công bố

về thành phần hoá học cũng như hoa ̣t tính sinh ho ̣c của thân của cây Lá đắng

2.5 Tổng hơ ̣p, đánh giá các nghiên cứu về cây Lá đắng

Qua các tài liê ̣u nghiên cứu về thành phần hoá ho ̣c của cây Lá đắng từ năm

1969 cho tới nay, các nhà khoa ho ̣c đã phân lâ ̣p được hơn 32 hợp chất chủ yếu thuộc các nhóm sau: sesquiterpene, steroid glycoside, flavonoid và một vài hợp chất thuộc các nhóm khác

Ba ̉ ng 2.1 Thành phần hoá ho ̣c đã được công bố của cây Lá đắng

M (amu) Sesquiterpene lactone

1

Vernodalin

C19H20O7

(360,36 amu)

2

Vernomygdin

C19H24O7

(364,39 amu)

C20H24O8

(392,40 amu)

C20H27O7

(376,41 amu)

5

11,13-Dihydrovernodalin

C20H22O7

(374,39 amu)

6

Vernolepin

C15H16O5

(276,29 amu)

7

Epivernodalol

C20H24O8

(392,40 amu)

8

Vernodalinol

C19H22O8

(378,38 amu)

C19H22O6

(346,38 amu)

(376,41 amu)

11

11,13-Dihydrovernolide

C19H24O7

(364,39 amu)

12

3′-Hydroxyvernolide

C19H22O8

(378,38 amu)

13

12-Methoxyvernolepin

C16H20O6

(308,33 amu)

14

Vernomygdalin

C15H18O5

(278,30 amu)

Steroid glycoside

15 Vernonioside A1: R1=OGlc; R2=β-OH, H; R3=H C35H52O10

(632,79 amu)

16 Vernonioside A2: R1=OGlc; R2=α-OH, H; R3=H

C35H52O10

(632,79 amu)

17 Vernonioside A3: R1=OGlc; R2=O; R3=H

C35H50O10

(630,78 amu)

18 Vernonioside B1: R1=OGlc; R2=H,H; R3=OH

C35H52O10

(632,79 amu)

19 Vernonioside B3: R1=OGlc; R2=OAc,H; R3=H

C37H54O11

(674,83 amu)

20

Vernonioside A4

C35H52O11

(648,79 amu)

21

Vernonioside B2

C35H56O12

(680,83 amu)

24

Vernoamyoside A: R1=H

C41H66O15

(798,96 amu)

25

Vernoamyoside B: R1=H

C35H52O11

(648,79 amu)

26

Vernoamyoside C: R1=α-OH

C36H56O12

(680,83 amu)

27

Vernoamyoside D: R1=β-OH

C35H52O11

(648,79 amu)

29

Luteolin 7-O-β-glucoside

C21H20O11

(448,38 amu)

30

Luteolin 7-O-β-glucuronoside

C21H18O12

(462,36 amu)

Ca ́ c hơ ̣p chất khác

31

7,24(28)-Stigmastadien-3β-ol

C29H48O (412,70 amu)

Cây Lá đắng chứa nhiều hợp chất với hoạt tính sinh học có giá trị cao trong việc chữa bệnh như: hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn, chống sốt rét, chống giun sán, kháng ung thư, Do vậy, đề tài tiến hành “Phân lập hợp chất từ cao dichloromethane củ a thân cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ Cúc

(Asteraceae)” để đóng góp thêm những hiểu biết về thành phần hóa thực vật

của con người về cây Lá đắng Qua đó khuyến khích bảo tồn và nhân rộng loài

thực vật có giá trị này

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Hóa chất

Dung môi hữu cơ (Chemsol, Việt Nam): n-hexane, dichloromethane, ethyl

acetate, methanol, acetone

Vanilin, H2SO4 đậm đặc và nước cất để pha thuốc thử hiện vết

Một số loại hóa chất khác như: natri sulfate (Na2SO4), acid acetic (CH3COOH)

Silica gel 60 – Merck (Đứ c), đường kính hạt 0,040-0,063 mm dùng cho sắc ký cột pha thường, silica gel 230-400 mesh (Ấn Độ) dùng trong sắc ký nhanh-cột khô

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp chiết xuất [26]

Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu Các phương pháp chiết rắn-lỏng, lỏng-lỏng hoặc kết hợp cả hai thường được sử dụng Phương pháp chiết xuất được sử dụng trong đề tài này là phương pháp chiết rắn-lỏng bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm (maceration) Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây Ngâm nguyên liệu trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy Phương pháp chiết lỏng-lỏng với dung môi có độ phân cực tăng dần để điều chế cao phân đoạn, sử dụng bình lóng để lắc chiết

3.2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất

Cấu trúc hóa học của hợp chất được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm bao gồm: phổ ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR,

Xác định tính chất vật lý của hợp chất cô lập như: màu sắc, dạng của hợp chất, Rf, khả năng hòa tan trong các loại dung môi,

3.3 Thực nghiệm

3.3.1 Thu hái và xử lý mẫu

Nguyên liệu là thân cây Lá đắng được thu ở đi ̣a bàn thành phố Cần Thơ

và được nhận danh bởi Ts Đặng Minh Quân, bộ môn Sinh học, khoa Sư phạm, Đại học Cần Thơ

Mẫu cây tươi được rửa sạch, loại bỏ phần hư, cắt nhỏ, phơi khô (tránh ánh nắng trực tiếp) sau đó xay thành bột mịn (12 kg) Bột cây là nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

3.3.2 Điều chế các loại cao

3.3.2.1 Điều chế cao methanol

Mẫu bột cây được cho vào các túi vải, buộc kín miệng và cho vào các bình thủy tinh lớn có nắp đậy Rót methanol vào bình cho đến xấp xỉ bề mặt của túi vải Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, để cho dung môi xuyên thấm vào túi vải và hòa tan các hợp chất có trong bột cây Sau 24 giờ dung dịch chiết được lọc qua giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi Dung môi thu hồi tiếp tục cho vào bình chiết, quá trình chiết được lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi chiết kiệt các chất trong nguyên liệu Cao MeOH (cao tổng) thu được sau khi cô quay thu hồi dung môi có dạng sệt có khối lượng là 1,4 kg Cao tổng hòa tan trong một lượng nước cất vừa phải xấp xỉ 1:1 (v/v) tiến hành phương pháp chiết lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần để được các cao phân đoạn

Hiệu xuất điều chế cao tổng: H1 = 1.4

12×100= 11,7%