PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO PETROLEUM ETHER CỦA CÂY BỒ CÔNG ANH VIỆT NAM (Lactuca indica L.), HỌ CÚC (Asteraceae)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ PHAN HỮU NHÂN PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO PETROLEUM ETHER CỦA CÂY BỒ CÔNG ANH VIỆT NAM Lactuca indica L., HỌ CÚC Asteraceae LUẬN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

PHAN HỮU NHÂN

PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO PETROLEUM ETHER

CỦA CÂY BỒ CÔNG ANH VIỆT NAM (Lactuca indica L.),

HỌ CÚC (Asteraceae)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

PHAN HỮU NHÂN

PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO PETROLEUM ETHER

CỦA CÂY BỒ CÔNG ANH VIỆT NAM (Lactuca indica L.),

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này ngoài sự cố gắng của bản thân, em còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy cô anh chị và các bạn Em xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến:

GVC Ts Tôn Nữ Liên Hương, người cô kính yêu, người đã hướng dẫn

em đi theo con đường hóa học các hợp chất tự nhiên

GVC Ths Lâm Phước Điền, người thầy cố vấn tận tâm đã luôn quan tâm giúp đỡ em từ những ngày đầu tiên bước vào trường đại học

Quý thầy cô bộ môn Hóa, khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho

em trong suốt quá trình học

Các anh chị và các bạn đã tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Sau cùng em xin cảm ơn gia đình đã làm chổ dựa vững chắc cho em cả về vật chất lẫn tinh thần

Xin chân thành cảm ơn!

ii

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: “Phân lập hợp chất từ cao petroleum ether của cây Bồ công anh

Việt Nam (Lactuca indica L.), họ Cúc (Asteraceae)”

3 Sinh viên thực hiện: Phan Hữu Nhân MSSV: B1304078

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng 05 năm 2017

Ts Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: “Phân lập hợp chất từ cao petroleum ether của cây Bồ công anh

Việt Nam (Lactuca indica L.), họ Cúc (Asteraceae)”

3 Sinh viên thực hiện: Phan Hữu Nhân MSSV: B1304078

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:

b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng 05 năm 2017

Từ khóa: Lactuca indica L., lutein, apigenin, beta-sitosterol, stigmasterol, carbohydrate, calories, vitamin

v

ABSTRACT

From the extract of Lactuca indica L., collecting in 11 Ward, Trai Mat, Da Lat city, Lam Dong province Some compounds were isolated: lutein; apigenin; beta-sitosterol and stigmasterol The structure of these compounds have been elucidated by modern spectroscopic methods (1D, 2D NMR and ESI-

MS) and by comparing with known spectral data Besides, Lactuca indica L

have nutritional value: carbohydrate, calories and some vitamins

Keywords: Lactuca indica L., lutein, apigenin, beta-sitosterol, stigmasterol, carbohydrate, calories, vitamin

vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH PHỤ LỤC x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1

1.3.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan thực vật 3

2.1.1 Khái quát 3

2.1.2 Phân loại thực vật 3

2.1.3 Mô tả thực vật [2] 4

2.1.4 Sinh thái và phân bố [2] 5

2.2 Công dụng của cây Bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.) 6

2.2.1 Y học cổ truyền Việt Nam 6

2.2.2 Y học nước ngoài 6

2.3 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài trong và ngoài nước 6

2.3.1 Ngoài nước 6

2.3.2 Trong nước 8

2.4 Nghiên cứu thành phần hóa học 8

vii

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Phương tiện nghiên cứu 13

3.1.1 Hóa chất 13

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 13

3.2 Phương pháp nghiên cứu 14

3.2.1 Phương pháp cô lập hợp chất [11] 14

3.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất [11] 14

3.2.3 Phương pháp xác định giá trị dinh dưỡng của cây 14

3.3 Thực nghiệm 15

3.3.1 Thu hái và xử lý mẫu 15

3.3.2 Điều chế 15

3.3.3 Khảo sát thành phần hóa học cao PE 17

3.3.4 Khảo sát phân đoạn PE3 18

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Hợp chất LIN01 19

4.1.1 Tính chất của LIN01 19

4.1.2 Định danh hợp chất LIN01 19

4.2 Hợp chất LIN02 22

4.2.1 Tính chất của LIN02 22

4.2.3 Định danh hợp chất LIN02 22

4.3 Hợp chất LIN03 23

4.3.1 Tính chất của LIN03 23

4.3.2 Định danh hợp chất LIN03 24

4.4 Kết quả phân tích hàm lượng dinh dưỡng của cây 27

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28

5.1 Kết luận 28

5.2 Kiến nghị 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

PHỤ LỤC 32

viii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học đã được công bố của loài Lactuca indica L 8

Bảng 3.1 Phương pháp xác định giá trị dinh dưỡng của cây 15

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký cột của cao PE 17

Bảng 3.3 Kết quả sắc ký cột thường của phân đoạn PE3 18

Bảng 4.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR của LIN01 và lutein [12] 19

Bảng 4.2 Dữ liệu phổ 13C-NMR của LIN01 và lutein [12] 20

Bảng 4.3 Số liệu phổ 1D NMR của LIN02 (δ) và apigenin (δ#) 23

Bảng 4.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR của LIN03, stigmasterol và β-sitosterol 24

Bảng 4.2 Dữ liệu phổ 13C-NMR của LIN03, stigmasterol và β-sitosterol 25

Bảng 4.5 Kết quả phân tích giá trị dinh dưỡng của cây 27

ix

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Thân, lá, rễ và hoa của cây Bồ công anh Việt Nam 5

Hình 3.1 Sơ đồ điều chế các loại cao từ cây Bồ công anh Việt Nam 16

Hình 4.1 Cấu trúc của lutein 22

Hình 4.2 Cấu trúc apigenin 23

Hình 4.3 Cấu trúc của β-sitosterol và stigmasterol 26

x

DANH SÁCH PHỤ LỤC

Phụ lục 1.1 Hình ảnh chiết lỏng-lỏng các cao phân đoạn và sắc ký cột nhanh

khô của cao PE 32

Phụ lục 1.2 Sắc ký lớp mỏng phân đoạn PE3.2 và PE3.3 32

Phụ lục 1.3 Hình ảnh tinh thể và sắc ký lớp mỏng trong các hệ dung môi khác nhau của chất LIN01, hiện màu bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 33

Phụ lục 1.4 Hình ảnh tinh thể và sắc ký lớp mỏng trong các hệ dung môi khác nhau của chất LIN02, quan sát dưới đèn UV bước sóng 254 nm 33

Phụ lục 1.5 Hình ảnh tinh thể và sắc ký lớp mỏng trong các hệ dung môi khác nhau của chất LIN03, hiện màu bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 34

Phụ lục 2.1 Phổ 1H-NMR của LIN01 35

Phụ lục 2.2a Phổ 1H-NMR dãn rộng của LIN01 36

Phụ lục 2.2b Phổ 1H-NMR dãn rộng của LIN01 37

Phụ lục 2.3 Phổ 13C-NMR của LIN01 38

Phụ lục 2.4a Phổ 13C-NMR dãn rộng của LIN01 39

Phụ lục 2.4b Phổ 13C-NMR dãn rộng của LIN01 40

Phụ lục 2.5 Phổ DEPT của LIN01 41

Phụ lục 2.6a Phổ DEPT dãn rộng của LIN01 42

Phụ lục 2.6b Phổ DEPT dãn rộng của LIN01 43

Phụ lục 2.7 Phổ HSQC của LIN01 44

Phụ lục 2.8a Phổ HSQC dãn rộng của LIN01 45

Phụ lục 2.8b Phổ HSQC dãn rộng của LIN01 46

Phụ lục 2.9 Phổ HMBC của LIN01 47

Phụ lục 2.10a Phổ HMBC dãn rộng của LIN01 48

Phụ lục 2.10b Phổ HMBC dãn rộng của LIN01 49

Phụ lục 2.10c Phổ HMBC dãn rộng của LIN01 50

Phụ lục 2.10d Phổ HMBC dãn rộng của LIN01 51

Phụ lục 3.1 Phổ 1H-NMR của LIN02 52

Phụ lục 3.2 Phổ 1H-NMR dãn rộng của LIN02 53

Phụ lục 3.3 Phổ 13C-NMR của LIN02 54

xi

Phụ lục 3.4 Phổ 13C-NMR dãn rộng của LIN02 55

Phụ lục 3.5 Phổ DEPT của LIN02 56

Phụ lục 3.6 Phổ DEPT dãn rộng của LIN02 57

Phụ lục 3.7 Phổ HSQC của LIN02 58

Phụ lục 3.8 Phổ HSQC dãn rộng của LIN02 59

Phụ lục 3.9 Phổ HMBC của LIN02 60

Phụ lục 3.10a Phổ HMBC dãn rộng của LIN02 61

Phụ lục 3.10b Phổ HMBC dãn rộng của LIN02 62

Phụ lục 3.10c Phổ HMBC dãn rộng của LIN02 63

Phụ lục 3.11 Phổ ESI-MS của hợp chất LIN02 64

Phụ lục 4.1 Phổ 1H-NMR của LIN03 65

Phụ lục 4.2a Phổ 1H-NMR dãn rộng của LIN03 66

Phụ lục 4.2b Phổ 1H-NMR dãn rộng của LIN03 67

Phụ lục 4.2c Phổ 1H-NMR dãn rộng của LIN03 68

Phụ lục 4.3 Phổ 13C-NMR của LIN03 69

Phụ lục 4.4a Phổ 13C-NMR dãn rộng của LIN03 70

Phụ lục 4.4b Phổ 13C-NMR dãn rộng của LIN03 71

Phụ lục 4.5 Phổ DEPT của LIN03 72

Phụ lục 4.6a Phổ DEPT dãn rộng của LIN03 73

Phụ lục 4.6b Phổ DEPT dãn rộng của LIN03 74

Phụ lục 5.1 Kết quả phân tích giá trị dinh dưỡng của cây Bồ công anh Việt Nam (Lactuca Indica L.) 75

xii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

1D NMR One Dimension Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

2D NMR Two Dimensions Nuclear Magnetic Resonance

Ea Ethyl acetate (CH3COOC2H5)

EtOH Ethanol (C2H5OH)

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Corelation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Corelation

Hz Hertz (đơn vị đo tần số)

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

J Hằng số ghép spin

M Khối lượng phân tử

MeOH Methanol (CH3OH)

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Lý do chọn đề tài

Hiện nay, các hợp chất tự nhiên ngày càng được sử dụng phổ biến vì tính

an toàn, ít tác dụng phụ hơn so với các chất hóa học có nguồn gốc tổng hợp và bán tổng hợp, tránh sự tồn dư chất độc đối với cơ thể Nghiên cứu mới này được

kỳ vọng sẽ giúp tìm được loại cây có tiềm năng sinh học cao đóng góp vào kho tàng dược liệu của nhân loại

Nhiều vùng ở nước ta, cây Bồ công anh Việt Nam được người dân biết đến như một loại rau thực phẩm, ngoài ra còn có nhiều tác dụng dược lý và thường được sử dụng để trị một số bệnh như: tắc sữa, viêm tuyến sữa ở phụ nữ, mụn nhọt, các bệnh về nhiễm trùng đường tiết niệu, ăn uống khó tiêu và đau dạ dày [1]

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bồ công anh Việt Nam, nhưng ở nước ta vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học và tiềm năng sinh học của cây

được công bố Từ thực tế trên, đề tài tốt nghiệp “Phân lập hợp chất từ cao

petroleum ether của cây Bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.), họ Cúc

(Asteraceae)” đã được chọn để thực hiện nghiên cứu

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài tốt nghiệp “Phân lập hợp chất từ cao petroleum ether của cây

Bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.), họ Cúc (Asteraceae)” nhằm đóng

góp thêm thông tin về thành phần hóa học của cây cũng như làm phong phú thêm nguồn dược liệu của nước ta

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Toàn bộ các bộ phận (rễ, thân, lá, hoa,…) của cây Bồ công anh Việt Nam

(Lactuca indica L.), thuộc họ Cúc (Asteraceae) được thu hái tại Trại Mát,

2

1.3.3 Nội dung nghiên cứu

Thu nguyện liệu toàn cây tại Trại Mát, phường 11, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng

Áp dụng các phương pháp trong kỹ thuật tách chiết hợp chất thiên nhiên

để phân lập hợp chất trong cây

Tiến hành phân tích phổ từ đó xác định cấu trúc hóa học của hợp chất Viết báo cáo

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan thực vật

2.1.1 Khái quát

Lactuca là một chi tương đối lớn gồm những cây sống một năm hoặc vài

năm Ở Ấn Độ có khoảng 25 loài, ở Việt Nam có hơn 10 loài Trong đó loài phổ biến nhất là Bồ công anh [2] Ở nước ta có ít nhất 3 loại cây cùng có tên Bồ công anh Để tránh nhầm lẫn cần phải chú ý đến phân bố và đặc điểm cơ bản để phân biệt cây

Bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.) được sử dụng phổ biến, nhất

là tại phía Bắc và Bắc Trung Bộ Đặc điểm nhận biết là cây cao khoảng 0,6-1

m, có thể cao tới 3 m Thân mọc thẳng, nhẵn, không cành hoặc ít cành Lá có nhiều hình dạng, lá phía dưới dài 30 cm, rộng 5-6 cm Bấm lá và thân đều thấy tiết ra nhũ dịch màu trắng đục như sữa, vị hơi đắng Cụm hoa màu vàng [1]

Bồ công anh Trung Quốc (Taraxacum officinale Wigg.) mọc hoang và

được trồng ở vài nơi ở nước ta, nhất là tại các miền núi cao như Tam Đảo, Sa

Pa Đặc điểm là cây có rễ trụ, lá mọc thành hoa thị ở gốc, phiến lá cắt thành thùy nhỏ như răng nhọn, từ giữa lá mọc lên cuống cụm hoa màu vàng, khi già quả có lông màu trắng xếp thành hình cầu [1]

Cây Chỉ thiên (Elephantopus scaber L.) phân bố ở khắp nơi trên thế giới

tập trung nhiều ở Mỹ Cây này ở miền Nam thường gọi tên Bồ công anh Đặc biệt ở vài nơi ở miền Nam Trung Quốc (tỉnh Quảng Tây) người ta cũng gọi cây Chỉ thiên này là cây Bồ công anh và dùng như cây Bồ công anh Trung Quốc [1] Đặc điểm nhận biết cây là lá mọc chụm ở mặt đất, thân cây cao 20-50 cm, thân hình trụ, cứng, có lông thô, phân nhiều nhánh khi có hoa Cụm hoa mọc thành xim hoặc ngù mang nhiều đầu giả, trong mỗi đầu có 4 hoa màu tím hoặc tím hồng; tràng hình ống có 5 thùy, mào lông gồm 5-6 sợi tơ, bao phấn

có tai Quả bế hình thoi có 10 cạnh lồi [2]

4

Tên nước ngoài: Indian lettuce (Anh), Laitue indienne, laitue d′ Inde

(Pháp) [2]

Tên đồng nghĩa: Lactuca squarrosa Miq., L brevirostris Champ [2]

Giới (Kingdom): Plantae

Ngành (division): Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

2.1.3 Mô tả thực vật [2]

Cây Bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.) là một loại cây thân thảo,

mọc đứng, sống một năm hay hai năm

Thân: thân nhẵn, thẳng, cao 0,5-1 m, có khi đến 2 m, ít phân cành, đôi khi

có những đốm tía

Lá: lá mọc so le, gần như không cuống, rất đa dạng Những lá ở dưới thuôn

dài, xẻ thùy không đều, hẹp và sâu, thùy lớn và thùy nhỏ xen kẽ nhau, mép có răng cưa, gốc tù, đầu nhọn; lá ở giữa và ở trên ngắn và hẹp hơn, có ít răng hoặc hoàn toàn nguyên

Hoa: cụm hoa là một đầu, tụ họp thành chùy dài 20-40 cm, mọc ở ngọc

thân và kẽ lá, phân nhánh nhiều, mỗi nhánh mang 2-3 đầu; tổng bao hình trụ, mỗi đầu có 8-10 hoa màu vàng hoặc vàng nhạt; tràng hoa có lưỡi dài, ống mảnh; bao phấn có đỉnh rất tròn, tai hình dùi; vòi nhụy có gai

Quả: quả bế, màu đen, có mào lông trắng nhạt, 2 cạnh có cánh, 2 cạnh

khác giảm thành một đường lồi

Thân và lá khi bấm có dịch màu trắng tiết ra

Mùa hoa: tháng 6-7; mùa quả: tháng 8-9

Cây dễ nhầm lẫn:

Bồ công anh hoa tím (Cichorium intybus L.), chicory, wild endive (Anh),

chicorée (Pháp) Cây nhập trồng, có nguồn gốc Địa Trung Hải

5

Hình 2.1 Thân, lá, rễ và hoa của cây Bồ công anh Việt Nam

2.1.4 Sinh thái và phân bố [2]

Lactuca là một chi tương đối lớn, gồm những cây sống một năm, vài loài

sống nhiều năm, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Bắc bán cầu

Ở Ấn Độ, có khoảng 25 loài, Việt Nam cũng có hơn 10 loài, trong đó, Bồ công anh Việt Nam là loài phân bố phổ biến nhất, ở hầu hết các tỉnh từ miền núi đến đồng bằng Độ cao phân bố thường không quá 1500 m Cây cũng gặp ở nhiều nước khác như Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Nhật Bản

Bồ công anh là cây ưa ẩm và ưa sáng, thường mọc trên những nơi đất tương đối màu mỡ, nhất là các bãi bồi ven sông, vườn bỏ hoang hoặc nương rẫy Hàng năm, cây con mọc từ hạt thường xuất hiện vào cuối mùa xuân Cây sinh trưởng nhanh trong mùa hè, ra hoa quả vào đầu mùa thu và sau đó tàn lụi Hạt giống có túm lông ở đỉnh, nhờ gió phát tán đi khắp nơi Vài năm trở lại đây, nhiều cơ sở chữa bệnh y học dân tộc đã trồng thêm cây thuốc này

Bồ công anh không kén đất, có khả năng thích nghi rộng nên được trồng phổ biến ở các vườn thuốc của trạm xá, bệnh viện, trường học, viện nghiên cứu

để hướng dẫn học tập và khai thác sử dụng Cả cây Bồ công anh được thu hái

6

vào tháng 5-7, lúc này cây chưa ra hoa Thường dùng tươi làm rau ăn và thuốc đắp hoặc phơi khô

2.2 Công dụng của cây Bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.)

2.2.1 Y học cổ truyền Việt Nam

Theo Đông y, Bồ công anh Việt Nam có vị ngọt, hơi đắng và tính hàn Có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu viêm tán kết [3]

Theo dân gian Việt Nam thường dùng rau Bồ công anh chữa bệnh mụn nhọt sang lỡ, trị viêm tuyến sữa ở phụ nữ, trị tắc tia sữa thời kì cho con bú và các bệnh về nhiễm trùng đường tiết niệu [1]

Bồ công anh Việt Nam thường được dùng phối hợp với các vị thuốc khác Đắp ngoài trị ung nhọt Có trường hợp dùng uống để điều trị bệnh đau dạ dày,

ăn uống kém tiêu [2]

Ngoài ra, Bồ công anh được nhắc đến trong chuyên mục sức khỏe và đời sống trong việc điều trị bệnh mắt sưng đỏ, mụn nhọt, viêm loét dạ dày tá tràng, viêm họng, viêm phế quản, đặc biệt còn chữa viêm gan do virus

2.2.2 Y học nước ngoài

Bồ công anh còn được thử nghiệm với phương pháp lồng cử động đã thể hiện tác dụng an thần

Flavonoid của Bồ công anh đã được nghiên cứu tác dụng sinh học cho thấy

có tác dụng ức chế men catalase, oxy hóa khử peroxidase trên máu chuột bạch Những thí nghiệm tiến hành với huyết thanh người cũng cho kết quả ức chế men oxy hóa khử rõ rệt

Theo tài liệu nước ngoài, tại một số nước, người ta có sử dụng và nghiên

cứu những loài Lactuca khác như L virosa, L sativa (rau Diếp ăn), cho thấy

những cây này không độc và cho tác dụng trên hệ thần kinh trung ương gây ngủ nhẹ

2.3 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài trong và ngoài nước

2.3.1 Ngoài nước

Trên thế giới, các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Bồ công anh đã được tiến hành ở một số nước như: Hàn Quốc, Trung Quốc, Hà Lan với nhiều công trình đã được công bố

7

Năm 2016, Chang Ik Choi và cộng sự đã cô lập được 8 hợp chất phenolic,

gồm apigenin, luteolin, isoquercitrin, chlorogenic acid, protocatechuic acid, hydroxymethyl benzoic acid, trans-cinnamic acid, và p-coumaric acid Trong

p-đó các hợp chất luteolin, isoquercitrin, chlorogenic acid và p-hydroxymethyl

benzoic acid là chất kháng oxy hóa hoạt động với giá trị IC50 các giá trị trong

khoảng 35,5-52,5 μM Ngoài ra, apigenin và luteolin ức chế hoạt động

α-glucosidase với IC50 lần lượt có giá trị tại 96,4 và 100,7 μM [4]

Năm 2007, Ki Hyun Kim và cộng sự đã phân lập 7 dẫn xuất quinic acid

như 3,4-di-O-caffeoylquinic acid, 3,5-di-O-caffeoyl-muco-quinic acid, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid, 4,5-di-O-caffeoylquinic acid, 5-O-caffeoylquinic acid, 3-O-caffeoylquinic acid và 5-O-(E)-p-coumaroylquinic acid Và 5 dẫn xuất flavonoid như quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-

glucopyranoside, quercetin 5-O-β-D-glucopyranoside, luteolin 7-O-β-D

-glucuronide, 20-dihydroxy-7-O-β-D-glucuronylflavone, quercetin 3-O-β-D- glucopyranoside các hợp chất đã được thử hoạt tính bảo vệ gan ở qui mô ống nghiệm [5]

Năm 2008, Ki Hyun Kim và cộng sự đã cô lập được 7 terpene và 5

phenolic, bao gồm: trans-phytol, 3-β-hydroxyglutin-5-ene, hydroxy-7-megastigmen-9-one, 11-β-13-dihydrolactucin, 2-phenylethyl-β-D-

5,6-epoxy-3-glucopyranoside, cichorioside B, 1-hydroxylinaloyl-6-O-β-D-glucopyranoside,

(6S,9S)-roseoside, benzyl-β-D-glucopyranoside, 2-(3-O-β-D-glucopyranosyl 4-hydroxyphenyl)-ethanol, 3-(β-D-glucopyranosyloxymethyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(3-hydroxypropyl)-7-methoxydihydrobenzofuran, và (+)-taraxafolin-B [6]

Năm 2010, Ki Hyun Kim và cộng sự đã phân lập 1 hợp chất là

di-E-caffeoyl-meso-tartaric acid từ dịch chiết MeOH của phần trên mặt đất của cây Lactuca indica L trong dòng tế bào gan HBV-transfected nhân

HepG2.2.15, hợp chất này có hiệu quả giảm nồng độ HBV DNA trong việc giải phóng các hạt HBV trưởng thành từ việc nuôi cấy HepG2.2.15 [7]

Năm 2003, Sheng-Yang Wang và cộng sự đã khảo sát hoạt tính kháng oxi

hóa và tính chất của các chất được tách từ cây Lactuca indica L Kết quả cho thấy chiết xuất từ Lactuca indica L có khả năng thu giữ các gốc tự do hoạt

động, giảm stress oxy hóa trong bệnh bạch cầu promyelocytic HL-60 của

tế bào người Hơn nữa, chiết xuất của Lactuca indica L gần như ức chế hoàn

toàn sản xuất nitric oxyde và các biểu hiện mRNA của chất cảm ứng enzym tổng hợp nitric oxyde, với liều 100 IG/mL, trong các đại thực bào RAW264.7 Bên cạnh đó các nhà nghiên cứu đã phân lập được 6 hợp chất protocatechulic

8

acid, methyl p-hydroxybenzoate, caffeic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid, luteolin 7-O-α-glucopyranoside và quercetin 3-O-α-glucopyranoside [8]

Năm 2007, Yi-Hsuan Chen và công sự đã đánh giá tác dụng kháng sinh

của dịch chiết ethanol của Lactuca indica L trên bạch cầu dòng tế bào HL-60

của người và các thành phần tạo nên hoạt tính của dịch chiết Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng gây độc tế bào mạnh mẽ, chống lại tế bào HL-60; giá trị

IC50 là 313 IG/mL Dịch chiết này chứa 5% các hợp chất phenolic, như quercetin, caffeic acid, rutin, và chlorogenic acid.Trong số bốn hợp chất phenolic hoạt động, quercetin đã được tìm thấy là hiệu quả nhất trong việc

ức chế đối với khả năng tồn tại trong tế bào và biến đổi các chức năng của

ty thể [9]

Năm 2011, Petra Lüthje và cộng sự đã nghiên cứu khả năng ngăn cản tế

bào ung thư bàng quang bởi Escherichia coli của dịch chiết Lactuca indica L Kết quả cho thấy rằng ngoài tác dụng lợi tiểu, Lactuca indica L còn có các tác

dụng trực tiếp trên tế bào biểu mô có thể bảo vệ chống lại nhiễm trùng

2.4 Nghiên cứu thành phần hóa học

Thông qua các tài liệu nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính trong

cây Bồ công anh (Lactuca indica L.) là các các dẫn xuất của quinic acid,

flavonoid, một số loại terpenoid, hợp chất có thành phần chứa phenolic và các hợp chất khác [4-8]

Bảng 2.1 Thành phần hóa học đã được công bố của loài Lactuca indica L

Các dẫn xuất của quinic acid

13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Hóa chất

Dung môi hữu cơ (Chemsol, Việt Nam): petroleum ether (PE), n-hexan

(Hex), dicloromethane (DC), chloroform (C), ethyl acetate (Ea), ethanol

(EtOH), methanol (MeOH), n-butanol (n-BuOH)

Hóa chất khác: dung dịch FeCl3 (5%) trong ethanol, thuốc thử vaniline/H2SO4(5%), muối Na2SO4

Silica gel 60 của hãng Merck

 Bình cô quay loại 50 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL

 Phễu, đũa thủy tinh, giấy lọc

Các thiết bị dùng dể ghi phổ:

Phổ khối lượng (ESI-MS) được ghi trên máyAgilent Technologies

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Advance AM500 FT-NMR

- Chiết rắn-lỏng (ngâm dầm) với ethanol (EtOH), lọc bỏ bã và cô quay với

áp suất thấp để điều chế cao tổng Quá trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi chiết kiệt chất trong mẫu cây

- Chiết lỏng-lỏng với dung môi có độ phân cực tăng dần để điều chế các cao thành phần Có độ phân cực khác nhau

- Sử dụng phương pháp sắc ký cột nhanh khô và sắc ký cột hở với chất hấp phụ và hệ dung môi thích hợp để phân lập chất

- Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình tách của sắc

ký cột và đánh giá độ tinh sạch của hợp chất

- Áp dụng phương pháp kết tinh hoặc kết tinh lại trong dung môi thích hợp

để tinh chế hợp chất

3.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất [11]

Chất vừa tinh sạch xong được xác định các tính chất lý hóa đặc trung như: màu sắc, dạng tinh thể, Rf, khả năng hòa tan trong các loại dung môi, hấp thu quang phổ…

Cấu trúc của hợp chất được xác định bằng các loại phổ: 1D, 2D NMR và ESI-MS được đo tại phòng NMR-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Từ những tính chất vật lý, các số liệu quang phổ và các số liệu so sánh giúp xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được

3.2.3 Phương pháp xác định giá trị dinh dưỡng của cây

Mẫu cây tươi sau khi thu hái được gửi đo giá trị dinh dưỡng tại phòng thí nghiệm chuyên sâu trường Đại học Cần Thơ bằng các phương pháp phân tích như ở bảng 3.1

15

Bảng 3.1 Phương pháp xác định giá trị dinh dưỡng của cây

3.3 Thực nghiệm

3.3.1 Thu hái và xử lý mẫu

Mẫu cây Bồ công anh Việt Nam được thu hái tại thành phố Đà Lạt, được định danh bởi Ts Đặng Minh Quân Bộ môn Sinh học, Khoa Sư phạm, Đại học Cần Thơ

Toàn bộ nguyên liệu được làm sạch bùn đất, phần bị hỏng, phơi khô trong bóng râm và xay nhuyễn thành 3,8 kg bột cây

3.3.2 Điều chế

Bột cây được tận trích với ethanol bằng phương pháp ngâm dầm, dịch chiết sau đó được lọc bỏ bã, cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất kém Lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi chiết kiệt các chất trong nguyên liệu Thu được cao tổng EtOH dạng sệt có khối lượng m1 = 420,0 g Cao tổng sau đó được hòa tan

trong một lượng nước cất vừa phải xấp xỉ 1:1 (v/v), sau đó tiến hành chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: PE, DC, Ea, n-BuOH thu được

các cao thành phần Khối lượng cao thành phần lần lượt là m2 = 147,0 g cao PE;

m3 = 6,0 g cao DC; m4 = 3,5 g cao Ea và m5 = 13,5 g cao n-BuOH Quá trình

chiết cao được tóm tắt ở Hình 3.1 Trong nghiên cứu này cao PE được chọn để nghiên cứu

STT Tên chỉ tiêu Phương pháp thử

2 Khoáng tổng AOAC 935.12

3 Carbonhydrate TCVN 4295:1986

4 Đường tổng TCVN 4594:1988

6 Protein thô AOAC 968.06

7 Calories Nutrition, Labeling and Food Analysis

16

Hình 3.1 Sơ đồ điều chế các loại cao từ cây Bồ công anh Việt Nam

- Ngâm dầm với EtOH

- Lọc bỏ bã

- Cô đuổi dung môi Bột cây 3,8 kg

Cao Ea (3,5 g)

- Chiết kiệt với Ea

- Cô đuổi dung môi

- Chiết kiệt với n-BuOH

- Cô đuổi dung môi

Dung dịch sau chiết

Cao n-BuOH

(13,5 g)

Dung dịch sau chiết

- Hòa với nước cất

- Chiết kiệt với PE

- Cô đuổi dung môi

Bã bột cây

còn lại bỏ

Cao tổng EtOH (420,0 g)

- Chiết kiệt với DC

- Cô đuổi dung môi

Cao PE

(147,0 g)

Dung dịch sau chiết

Cao DC (6,0 g)

Dung dịch sau chiết

m m

0,420

0,147100

1

m m

0,420

0,6100

1

m m

0,420

5,3100

1

m m

0,420

5,13100

1

m m

3.3.3 Khảo sát thành phần hóa học cao PE

Cao PE được tiến hành sắc ký cột nhanh khô với hệ dung môi rửa giải có

độ phân cực tăng dần: Hex:Ea (95:5; 90:10; 80:20; 50:50; 10:90; 0:100) và cuối cùng là MeOH 100% Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi giải ly PE:Ea, Hex:Ea, C:MeOH Hiện vết bằng thuốc thử vaniline/H2SO4 (5%) Các mẫu cho kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau (về màu sắc và Rf) được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên cao petroleum ether thu được 7 phân đoạn chính (PE1-PE7)

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký cột của cao PE

Phân đoạn Hệ dung môi Khối lượng (g) Ghi chú vết hiện hình trên bản PE1 Hex:Ea (95:5) 58,18 Nhiều vết tím tròn (dạng dầu) PE2 Hex:Ea (90:10) 16,25 Kéo vệt dài

PE3 Hex:Ea (80:20) 27,41 Nhiều vết xanh dương và tím

tròn PE4 Hex:Ea (50:50) 11,80 Nhiều vết xanh dương và tím

tròn Có vết hồng gần cuối PE5 Hex:Ea (10:90) 19,80 Kéo vệt dài

PE6 Hex:Ea (0:100) 2,34 Kéo vệt dài

PE7 MeOH 100% 3,04 Kéo vệt dài

18

3.3.4 Khảo sát phân đoạn PE3

Phân đoạn PE3 có màu xanh, khối lượng 27,41 g, có vết chính rõ nên được chọn để khảo sát tiếp Tiến hành sắc ký cột thường với các hệ dung môi tăng dần độ phân cực Hex:Ea tỉ lệ 9:1; 8:2; 7:3; 5:5; 3:7; Ea 100%, cuối cùng là MeOH 100% Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng SKLM, hiện vết bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 (5%) Thu được 7 phân đoạn (PE3.1 đến PE3.7), trong đó phân đoạn PE3.1, PE3.2, PE3.3 được chọn để khảo sát tiếp

Bảng 3.3 Kết quả sắc ký cột thường của phân đoạn PE3

Phân đoạn PE3.1 được sắc ký cột nhiều lần với các hệ dung môi tăng dần

độ phân cực Hex:Ea tỉ lệ 8:2; 7:3; 6:4 thu được hợp chất tinh khiết được đặt tên

là LIN03 10 mg

Phân đoạn PE3.2 tiếp tục được sắc ký cột nhiều lần với các hệ dung môi

có độ phân cực tăng dần DC:Hex tỉ lệ 8:2; 9:1; DC 100% thu được hợp chất tinh

khiết được đặt tên LIN01 24,7 mg

Phân đoạn PE3.3 tiếp tục được sắc ký cột nhiều lần với các hệ dung môi

có độ phân cực tăng dần Hex:Ea tỉ lệ 7:3; 6:4; 5:5; 4:6; 3:7; Ea 100% thu được

hợp chất LIN02 4 mg

Phân

đoạn

Hệ dung môi Khối lượng (g) Kết quả SKLM

PE3.1 Hex:Ea (9:1) 5,6 Nhiều vết xanh và tím

PE3.2 Hex:Ea (8:2) 2,4 Nhiều vết xanh có 1 vết tròn

màu xanh dương PE3.3 Hex:Ea (7:3) 2,0 Nhiều vết: tím, vàng, hồng PE3.4 Hex:Ea (5:5) 5 Kéo vệt

PE3.5 Hex:Ea (3:7) 4,3 Kéo vệt

PE3.6 Ea (100%) 3,6 Kéo vệt

PE3.7 MeOH (100%) 2,3 Kéo vệt

Tổng khối lượng thu hồi mth = 25,2g

Hiệu suất thu hồi

Hth = mth

27,41× 100% =

25,227,41× 100%

= 91,9%

19

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Hợp chất LIN01

4.1.1 Tính chất của LIN01

Hợp chất LIN01 (24,7 mg) thu được dưới dạng tinh thể vô định hình màu

vàng cam, tan hoàn toàn trong dung môi CHCl3 (100%)

Sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Hex:Ea 6:4 cho vết có màu vàng cam, hấp thu UV bước sóng 254 nm, hiện hình bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 cho vết tròn màu xanh dương Rf = 0,5

So sánh với dữ liệu phổ của chất lutein trong tài liệu tham khảo có nhiều

Ghi chú: Các kí tự a, b, c biễu diễn cho các tín hiệu giống nhau có thể đỗi chổ cho nhau

Kết hợp với 2 loại phổ 2D NMR là HSQC và HMBC cho các kết quả rất trùng khớp

Từ các dữ liệu trên chất LIN01 được định danh là lutein

((3R,3′R,6′R)-β,ε-carotene-3,3′-diol) có công thức phân tử C40H56O2 công thức cấu tạo là:

22

Hình 4.1 Cấu trúc của lutein

4.2 Hợp chất LIN02

4.2.1 Tính chất của LIN02

Hợp chất LIN02 (4 mg) thu được dưới dạng tinh thể vô định hình, màu

vàng nhạt, tan hoàn toàn trong dung môi MeOH (100%)

Sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Hex:Ea 3:7 hấp thu bước sóng 254 nm, hiện hình bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 cho vết tròn màu vàng nhạt Rf = 0,38

4.2.3 Định danh hợp chất LIN02

Phổ 13C-NMR (MeOD, δC ppm, 125 MHz) kết hợp với phổ DEPT90,

DEPT135 cho thấy LIN02 có 15 tín hiệu của 17 carbon với δC > 80ppm, trong

đó ở δC 129,45 và 117,03 có sự trùng lặp của 2 carbon giống nhau, đây là vùng tín hiệu đặc trưng của khung flavone, ngoài ra còn có các tín hiệu carbon

có δC < 80 ppm

Phổ 1H-NMR (MeOD, δH ppm, 500 MHz) cho thấy 7 tín hiệu proton

methine mang nối đôi trong đó có 2 mũi ghép ortho với δH lần lượt là: 7,88 (2H;

d; 9) và 6,96 (2H; d; 8,5) cho thấy 4 proton này cùng nằm trên một vòng thơm;

2 mũi ghép meta với δH là: 6,48 (1H; d; 1,5) và 6,23 (1H; d; 1,5) cho thấy

2 proton này cùng thuộc vòng thơm khác; 1 mũi đơn δH 6,61 (1H; s) thuộc một

vòng khác; 1 mũi đơn δH 7,91 và 2 tín hiệu tạp δH 7,75 và 7,64; ngoài ra còn có các tín hiệu proton ở vùng từ trường cao δH < 5 ppm

Xét phổ HSQC sự tương tác giữa tín hiệu C, H: δC 132,3 với δH 7,64;

δC 129,9 với δH 7,75 nên loại hai tín hiệu carbon này; còn lại 13 tín hiệu trong vùng δC > 80 ppm với 15 carbon phù hợp với khung flvavone

Xét phổ HMBC cho thấy các proton, carbon của khung flvavone đều không cho tương tác với các tín hiệu carbon δC < 80 ppm, các tín hiệu proton

δH < 5 ppm cho thấy tất cả các tín hiệu này là tạp chất nên tiến hành loại bỏ Tín hiệu proton δH = 7,91 không cho tương tác với bất cứ carbon nào nên cũng loại

bỏ tín hiệu này

Phổ ESI-MS cho tín hiệu trùng khớp với công thức phân tử C15H10O5, M= 270 amu

Do đó hợp chất LIN02 được định danh là hợp chất apigenin

(5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one) có cấu trúc hóa học như Hình 4.2

Hình 4.2 Cấu trúc apigenin

4.3 Hợp chất LIN03

4.3.1 Tính chất của LIN03

Hợp chất LIN03 (10 mg) thu được dưới dạng chất rắn vô định hình, màu

trắng, tan hoàn toàn trong dung môi CHCl3 (100%)

- Các tín hiệu đặc trưng của sterol ở vùng từ trường cao δH < 3,4 ppm;

- Tín hiệu proton dạng >C=CH‒ ở C6 δH = 5,35 ppm (2H) (tín hiệu 1);

- Các tín hiệu của proton olefin mạch hở dạng ‒CH=CH‒ trên khung stigmastan như 5,16 (1H; dd; 8,5); 5,02 (1H; dd; 8,5) (tín hiệu 2);

- Tín hiệu 3,51 (2H; m) là tín hiệu của proton >CH‒OH (tín hiệu 3);

- Ngoài ra còn có tín hiệu của 2 nhóm CH3 ở vùng từ trường δH < 0,75 (tín hiệu 4);

- Tín hiệu 1, tín hiệu 3, có tỉ lệ 2:1 so với tín hiệu 2, tín hiệu 4→ cho nên

đề nghị LIN03 là hỗn hợp của stigmasterol và β-sitosterol, tỉ lệ mol (1:1)

Bảng 4.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR của LIN03, stigmasterol và β-sitosterol [14]

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) dựa trên dữ liệu phổ 1H-NMR tiến hành loại bỏ các mũi tín hiệu δC = 130,9; 128,8; 65,6 và 13,7 ppm Còn lại 48 tín hiệu với sự trùng lặp của 10 tín hiệu gồm các tín hiệu δC = 140,8; 121,7; 71,8; 42,4; 42,3; 37,3; 36,6; 31,9; 31,7; 21,1 ppm Kết hợp với phổ DEPT cho thấy có

2 carbon ‒CH=CH‒ ở tín hiệu ở δC = 138,3; 129,3 ppm cùng với 6 carbon trùng

lặp ở 3 tín hiệu gồm: 4 carbon >C=CH‒ trùng lặp ở 2 tín hiệu δC = 140,8; 121,7

và 2 carbon >CH‒OH trùng lặp ở tín hiệu δC = 71,8 ppm So sánh với dữ liệu

phổ đã công bố của 2 chất stigmasterol và β-sitosterol [14] cho thấy có sự trùng

Từ các dữ liệu trên chất LIN03 được xác định là hỗn hợp của stigmasterol

(C29H48O) và β-sitosterol (C29H50O) với tỉ lệ mol 1:1 (Hình 4.1)

Hình 4.3 Cấu trúc của β-sitosterol và stigmasterol