Đề tài: “PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.) HỌ THẦU DẦU (Euphorbiaceae).Mục tiêu: + Góp phần cung cấp thêm thông tin về thành phần hoá học của cây Cỏ sữa. + Cung cấp cơ sở khoa học về tác dụng trị bệnh của cây Cỏ sữa
ĐỀ TÀI PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.), HỌ THẦU DẦU (Euphorbiaceae) (Euphorbiaceae ĐẶT VẤN ĐỀ Đề tài: “PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.) HỌ THẦU DẦU (Euphorbiaceae)” Mục tiêu: - Góp phần cung cấp thêm thơng tin thành phần hoá học Cỏ sữa - Cung cấp sở khoa học tác dụng trị bệnh Cỏ sữa NỘI DUNG CƠ BẢN Giới thiệu 1.1 Giới thiệu sơ lược Cỏ sữa lớn: - Tên khoa học: Euphorbia hirta L họ Thầu dầu Euphorbiaceae Phân bố: chủ yếu nước thuộc khu vực nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á Tại Việt Nam, mọc hoang khắp nơi, trừ vùng núi cao lạnh.2 - - Võ Văn Chi, 2007 Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam Đỗ Huy Bích, 2004 Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam vol Tập 1, pp 503–505 Giới thiệu 1.2 Thành phần hoá học: - Chủ yếu: Alkaloids, flavonoids, sterols, triterpenoids, tanins,… Ngồi ra: muối khống Mg, K, Ca, Fe, Zn,… Friedelin Quercitin Cycloartenol E T Li et al., 2015 Chemical constituents from Euphorbia hirta Biochem Syst Ecol., vol 62, pp 204–207 Y Liu, N Murakami, H Ji, P Abreu, and S Zhang, 2007 Antimalarial Flavonol Glycosides from Euphorbia hirta Pharm Biol., vol 45, no 4, pp 278–281 Giới thiệu 1.3 Tác dụng dược lí: Bài thuốc dân gian:3 - Chữa lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, tiêu chảy, ho, hen - Giúp gia tăng lượng sữa cho phụ nữ thời kỳ cho bú - Dịch ép bôi trị đứt vết thương mới, tươi giã nát đắp nhọt Hoạt tính sinh học: - Kháng khuẩn 4, kháng oxi hố - Chống ung thư 6, hoạt tính gây độc tế bào - Hạ đường huyết, giúp trị đái tháo đường.7 Đỗ Huy Bích, 2004 Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam vol Tập 1, pp 503–505 G Singh and P Kumar, 2011 Phytochemical study and screening for antimicrobial activity of flavonoids of Euphorbia hirta A A Basma, Z Zakaria, L Y Latha, S Sasidharan,2011 Antioxidant activity and phytochemical screening of the methanolextracts of Euphorbia hirta L P Anitha, PG Geegi, J Yogeswari, SA Anthoni, 2014 In Vitro Anticancer Activity of Ethanolic Extract of Euphorbia hirta (L.) Đặng Thúy Hồng, 2013 Nghiên cứu đặc tính sinh dược học dịch chiết từ Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) Thực nghiệm 2.1 Điều chế cao thô: Cây Cỏ sữa tươi 37 kg Rửa Phơi khô Xay nhuyễn Bột cỏ sữa lớn khô 6.5 kg Ngâm dầm với dung môi n-hexan Lọc, cô quay thu hồi dung môi Cao hexan 100g Bã bột lại Cao ethyl acetate 165g Ngâm dầm với dung môi ethyl acetate Lọc, cô quay thu hồi dung mơi Bã bột lại Thực nghiệm 2.2 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro cao Hex cao Ea Cỏ sữa lớn Quy trình thử nghiệm Mẫu (0,5mL) BSA (μL) Cao chiết (μL) Chất chuẩn (μL) Nước cất (μL) Dung dịch thử 450 50 0 Dung dịch chuẩn 450 50 Dung dịch chứng 450 0 50 Dung dịch chứng chiết suất cao chiết 50 450 Dung dịch chứng chất chuẩn 0 50 450 Ủ mẫu 37oC 20 phút Tăng lên 57oC phút Làm lạnh + 2,5 mL dung dịch đệm Đo OD bước sóng 255nm Thực nghiệm 2.2 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro cao Hex cao Ea Cỏ sữa lớn Cơng thức tính hiệu suất ức chế biến tính albumin nhiệt: ODt: mật độ quang đo mẫu thử ODc: mật độ quang đo mẫu chứng ODcs: mật độ quang đo mẫu chứng chiết suất Thực nghiệm … 2.3 Tinh chế cao Ethyl acetate Cao Ea E1 E7.1 E7.2 E.2 … … E6 E7 E7.7 … E7.10 E8 E7.11 E7.12 BHEu p E7.10.1 … E7.10.6 E7.10.7 BHEup02 10 3.2 Định danh hợp chất BHEup02 Bảng so sánh liệu phổ BHEup02 với tài liệu tham khảo 10 Hợp chất BHEup02 Vị trí δH (số H, dạng mũi, J = Hz) 10 10 6.22 (1H; d; J = Hz) 6.39 (1H; d; J = Hz) δC Afzelin δH (số H, dạng mũi, J = Hz) 158.6 136.2 179.6 163.2 99.9 6.19 (2H; d; J = 2.44 Hz) 166.0 94.8 6.36 (1H; d; J = 2.2 Hz) 159.3 105.9 δC 158.6 136.2 179.4 163.2 100.1 166.6 94.9 159.2 105.7 Sang Yeol Lee, Young-Jin So, Moon Sam Shin, Jae Youl Cho and Jongsung Lee, 2014 Antibacterial Effects of Afzelin Isolated from Cornus macrophylla on Pseudomonas aeruginosa, A Leading Cause of Illness in 24 Immunocompromised Individuals 3.2 Định danh hợp chất BHEup02 Bảng so sánh liệu phổ BHEup02 với tài liệu tham khảo Vị trí 1’ 2’, 6’ 3’, 5’ 4’ 1” 2” Hợp chất so sánh δH Hợp chất BHEup02 δH δC (số H, dạng mũi, J = Hz) 7.78 (2H; d; J = 8.25 Hz) 6.95 (2H; d; J = 8.5 Hz) 5.39 (1H; d; J = 1.5 Hz) 4.24 (1H; dd;Kết J = 3.5 Hz, luận: 1.5 Hz) (số H, dạng mũi, J = Hz) 122.7 131.9 7.76 (2H; d; J = 8.76 Hz) 116.5 6.93 (2H; d; J = 8.88 Hz) 161.6 103.5 5.36 (1H; d; J = 2.2 Hz) 71.9 4.21 dd; J = 3.42, BHEup02 là(1H; Afzelin 1.7 Hz) δC 122.6 131.9 116.5 161.6 103.5 72.1 3” 3.73 (1H; dd; J = Hz, 3.5 Hz) 72.2 3.71 (1H; m) 72.0 4” 5” 6” 3.34 (2H; m) 3.34 (2H; m) 0.94 (3H; d; J = 5.5 Hz) 72.0 3.60 (1H; m) 73.2 3.47 (1H; m) 17.7 0.91 (3H; d; J = 5.6 Hz) 73.2 71.9 17.7 25 Kết thảo luận 3.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng viêm Nồng độ tăng phần trăm ức chế biến tính tăng Phần trăm ức chế biến tính đạt giá trị cao nồng độ 800 µg/mL 26 Kết thảo luận 3.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng viêm Mẫu Phương trình hồi quy Gía trị IC50 Cao Ea y = 0.075x + 30.72 (R² = 0.952) 257.1 µg/mL Cao Hex y = 0.049x + 26.32 (R² = 0.977) 483.3 µg/mL Diclofenac y = 0.062x + 46.20 (R² = 0.964) 61.3 µg/mL Presnisolon y = 0.063x + 48.67 (R² = 0.958) 21.1 µg/mL Cao Ea có hoạt tính kháng viêm tốt Cao Hex có hoạt tính kháng viêm 27 Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận Đề tài “Phân lập chất từ cao ethyl acetate Cỏ sữa lớn (Euphorbia hirta L.), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)” phân lập 02 hợp chất: Acid gallic Afzelin Hoạt tính sinh học: - Chống oxi hố mạnh 11 - Kháng nấm, kháng khuẩn 11 - Kháng tế bào ung thư 12 Acid gallic Kim, Y J (2007) Antimelanogenic and antioxidant properties of gallic acid. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 30(6), 1052-1055 Kaur, M., Velmurugan, B., Rajamanickam, S., Agarwal, R., & Agarwal, C (2009) Gallic acid, an active constituent of grape seed extract, exhibits anti-proliferative, pro-apoptotic and anti-tumorigenic effects against prostate carcinoma xenograft growth in nude 28 mice. Pharmaceutical research, 26(9), 2133-2140 11 12 Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận Hoạt tính sinh học: - Chống xạ tia cực tím , bảo vệ da khỏi viêm ung thư.13 - Kháng khuẩn.14 - Chống lại ung thư tuyến tiền liệt.15 Afzelin 13 Shin, S W., Jung, E., Kim, S., Kim, J H., Kim, E G., Lee, J., & Park, D (2013) Antagonizing effects and mechanisms of afzelin against UVB-induced cell damage. PLoS One, 8(4), e61971 14 Lee, S Y., So, Y J., Shin, M S., Cho, J Y., & Lee, J (2014) Antibacterial effects of afzelin isolated from Cornus macrophylla on Pseudomonas aeruginosa, a leading cause of illness in immunocompromised individuals. Molecules, 19(3), 3173-3180 15 Zhu, K C., Sun, J M., Shen, J G., Jin, J Z., Liu, F., Xu, X L., & Lv, J J (2015) Afzelin exhibits anti-cancer activity against androgen-sensitive LNCaP and androgen-independent PC-3 prostate cancer cells through the inhibition of LIM domain kinase 29 1. Oncology letters, 10(4), 2359-2365 Kết luận kiến nghị 4.2 Kiến nghị • Khảo sát thành phần hóa học cao chiết phân đoạn khác • Thử hoạt tính kháng viêm cao chiết hợp chất tinh khiết phân lập từ cao chiết Cỏ sữa lớn phương pháp in vitro in vivo khác • Khảo sát hoạt tính khác kháng khuẩn, kháng nấm, gây độc tế bào,… 30 CẢM ƠN QUÝ THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE 31 Bảng so sánh liệu phổ BHEup Acid gallic * vị trí hợp chất BHEup δH (số H, dạng mũi, J = Hz) δC Acid gallic δH (số H, dạng mũi, J = Hz) Ghi CD3OD δC 139.6 139.7 110.3 7.10 (2H; s ) 110.4 146.5 146.4 122.3 122.0 146.5 146.4 110.3 7.10 (2H; s ) 110.5 170.6 170.5 7.10 (2H; s) 7.10 (2H; s) COOH * Madikizela, B., Aderogba, M A., Finnie, J F., & Van Staden, J (2014) Isolation and characterization of antimicrobial compounds from Terminalia phanerophlebia Engl & Diels leaf extracts. Journal of ethnopharmacology, 156, 228-234 32 33 Thực nghiệm 2.2 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro cao Hex cao Ea Cỏ sữa lớn Phương pháp khảo sát biến tính albumin nhiệt thực theo phương pháp Habibur Rahman cộng sự.8 Chuẩn bị dung dịch • Huyết bò Albumin Serum Bovine (BSA) 0,5%: Hòa tan 0.5 g BSA bình định mức 100 mL • Dung dịch đệm Phosphate pH 6.3: Hòa tan g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 800 mL nước cất Điều chỉnh pH đến 6.3 cách sử dụng HCl 1N Thêm nước cất đến 1000 mL H Rahman, 2015 In-vitro Anti-inflammatory and Anti-arthritic Activity of Oryza sativa Var Joha Rice (An Aromatic Indigenous Rice of Assam) 34 Thực nghiệm 2.2 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro cao Hex cao Ea Cỏ sữa lớn • Cao chiết: Pha lỗng DMSO thành nồng độ từ 800 – 12,5 μg/mL • Chất chuẩn (Diclofenac prednisolon): Pha loãng methanol thành nồng độ từ 800 – 12,5 μg/mL 35 Kết thảo luận 3.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng viêm Phần trăm ức chế biến tính (%) Mẫu Cao Ea Cao Hex Diclofenac Prednisolon 12.5 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL 200 µg/mL 400 µg/mL 800 µg/mL 25.9 28.1 34.7 41.9 51.8 65.6 87.2 18.7 23.8 28.8 33.5 38.2 46.1 64.8 40.6 47.9 51.0 54.2 60.1 75.4 93.8 44.4 46.0 54.2 60.1 63.4 76.0 97.6 Nồng độ tăng phần trăm ức chế biến tính tăng Phần trăm ức chế biến tính đạt giá trị cao nồng độ 800 µg/mL 36 37 38 ... viêm 27 Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận Đề tài “Phân lập chất từ cao ethyl acetate Cỏ sữa lớn (Euphorbia hirta L.), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)” phân lập 02 hợp chất: Acid gallic Afzelin Hoạt tính... nghị 4.2 Kiến nghị • Khảo sát thành phần hóa học cao chiết phân đoạn khác • Thử hoạt tính kháng viêm cao chiết hợp chất tinh khiết phân lập từ cao chiết Cỏ sữa lớn phương pháp in vitro in vivo...ĐẶT VẤN ĐỀ Đề tài: “PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.) HỌ THẦU DẦU (Euphorbiaceae)”