PHÂN LẬP HAI HỢP CHẤT TỪ CAO METHANOL CỦA ĐỊA Y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale THU HÁI TẠI THÀNH PHỐ ĐÀ LẠT, TỈNH LÂM ĐỒNG

Luận văn này đươc ̣ thưc hiện nhằm muc đích nghiên cứu thành phần hó a hoc ̣ trong phân đoan ̣ cao chiết methanol của loà i đia ỵ Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale, được thu hái tai ̣ Thành Phô Đà Lat, tỉnh Lâm Đồng. Hiên nay ̣ ở Viêt Nam ̣ , chưa co nhiề bá cá khoa họ vê thành phầ hó a hoc c ̣ ũng như là hoat ̣ tính sinh họ về loài đia y ṇ à y. Từ phân đoạ cao methanol tổg, qua nhiề lầ n sắ ký bả n mỏ ng và sắ c ký côt, k ̣ ế quả đã phân lâp được 2 hơp ch ̣ ất tinh khiết là orcinol (PT8) và lecanoric acid (PT3). Cấu trúc của các hơp ch ̣ ất được xác đinh ḍ ưa trên c ̣ ác phương pháp phổ nghiêm ̣ 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC, MS và so sánh với các tài liệu tham khả o trong nước và ngoài nước.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA - -

Nguyễn Văn Mun Lưu Phạm Hải Vương

PHÂN LẬP HAI HỢP CHẤT TỪ CAO METHANOL

CỦA ĐỊA Y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale THU HÁI TẠI THÀNH PHỐ ĐÀ LẠT, TỈNH LÂM ĐỒNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

Cần Thơ, 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA - -

Nguyễn Văn Mun Lưu Phạm Hải Vương

PHÂN LẬP HAI HỢP CHẤT TỪ CAO METHANOL CỦA

ĐỊA Y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale THU HÁI TẠI

LỜI CẢM ƠN



Để hoàn thành được luận văn này, chúng em đã nhâ ̣n được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và hỗ trợ nhiệt tình từ các thầy cô, gia đình và ba ̣n bè Qua đây, chúng em xin gửi những lời cảm ơn chân thành nhất:

Vớ i lòng biết ơn sâu sắc nhất, chúng em xin gửi đến Thầy-TS Nguyễn Phúc Đảm, Giảng viên Khoa Sư phạm, Trườ ng Đại ho ̣c Cần Thơ, Thầy đã tâ ̣n tâm chỉ dẫn chú ng em trong suốt quá trình làm luâ ̣n văn tốt nghiệp, Thầy đã nhiệt tình truyền đa ̣t cho chúng em những kiến thức và kinh nghiêm quý báu để chú ng em đa ̣t được những thành quả này Không chỉ vâ ̣y, đối với chúng em, Thầy như là một người thân trong gia đình, luôn quan tâm và da ̣y bảo chúng

em, là nguồn động lực to lớn tiếp thêm sức ma ̣nh tinh thần cho chúng em Mô ̣t

lần nữa, xin chân thành cảm ơn Thầy

Chúng em xin biết ơn Thầy-TS Nguyễn Trọng Tuân, giảng viên Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại ho ̣c Cần Thơ, Thầy đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ chúng em về kiến thức, trang thiết bi ̣, hóa chất và kinh phí trong suốt quá trình chúng em thực hiê ̣n Luận văn này

Xin cám ơn cô-TS Nguyễn Thi ̣ Thu Trâm, Phó Trưởng Khoa Khoa Khoa

học Cơ bản, Trường Đa ̣i học Y Dược Cần Thơ, cô đã ki ̣p thời giúp đỡ và hỗ trợ trong lú c chúng em gă ̣p khó khăn

Xin chân thành cám ơn các thầy cô Khoa Khoa ho ̣c Tự nhiên và nhiều thầy

cô khác đã truyền đạt cho chúng em những kiến thức quý báu, những kinh nghiệm hữu ích nhất, là những hành trang quý giá cho chúng em cho hôm nay

và mai sau

Chúng em xin gửi đến những lời cám ơn thân thương nhất dành cho các anh chị và các bạn ở phòng thí nghiệm Hóa sinh-Hữu cơ, Bô ̣ môn Hóa ho ̣c, Khoa Sư pha ̣m, cùng các ba ̣n lớp Hóa Dược 1 K40 đã cùng chia sẻ với chúng

em nhiều kinh nghiê ̣m trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, chúng em xin dành hết tình cảm và lòng biết ơn cho gia đình

và những người thân, đã động viên và luôn bên ca ̣nh chúng em, luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc, cổ vũ chúng em từ những ngày đầu tiên đèn sách và hoàn thành được luâ ̣n văn này

Chú ng em xin chân thành cám ơn và biết ơn sâu sắc!

NGYỄN VĂN MUN LƯU PHẠM HẢI VƯƠNG

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Nguyễn Phúc Đảm

2 Đề tài: Phân lập hai hợp chất từ cao methanol của địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale thu hái tại Thành Phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Mun MSSV: B1401406

Lưu Phạm Hải Vương MSSV: B1401462 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 40

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2017

Cán bộ hướng dẫn

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện:

2 Tên đề tài: : Phân lập hai hợp chất từ cao methanol của địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale thu hái tại Thành Phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Mun MSSV: B1401406

Lưu Phạm Hải Vương MSSV: B1401462 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 40

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

* Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

* Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2017

Cán bộ phản biện

TÓM TẮT



Luận văn này được thực hiện nhằm mu ̣c đích nghiên cứu thành phần hóa

học trong phân đoa ̣n cao chiết methanol của loài đi ̣a y Parmotrema tinctorum

(Nyl.) Hale, được thu hái ta ̣i Thành Phố Đà La ̣t, tỉnh Lâm Đồng Hiê ̣n nay ở Việt Nam, chưa có nhiều báo cáo khoa học về thành phần hóa ho ̣c cũng như là hoạt tính sinh học về loài đi ̣a y này

Từ phân đoạn cao methanol tổng, qua nhiều lần sắc ký bản mỏng và sắc

ký cô ̣t, kết quả đã phân lâ ̣p được 2 hợp chất tinh khiết là orcinol (PT8) và lecanoric acid (PT3) Cấu trúc của các hợp chất được xác đi ̣nh dựa trên các phương pháp phổ nghiê ̣m 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC, MS và

so sánh với các tài liệu tham khảo trong nước và ngoài nước

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT



Từ viết tắt Tên viết đầy đủ

P praesorediosum Parmotrema praesorediosum (Nyl.) Hale

MỤC LỤC



LỜI CẢM ƠN i

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ii

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN iii

TÓM TẮT iv

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH SƠ ĐỒ x

DANH SÁCH PHỤ LỤC xi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục đích nghiên cứu: 2

1.3 Nội dung nghiên cứu: 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan thực vật học điạ y 3

2.1.1 Đặc điểm của địa y 3

2.1.2 Công dụng của địa y 3

2.2 Chi Parmotrema 4

2.2.1 Mô tả thực vật 4

2.2.2 Thành Phần hóa học của chi Parmotrema 4

2.3 Địa y Parmotrma tinctorum (Nyl.) Hale 12

2.3.1 Phân loại thực vật 12

2.3.2 Mô tả thực vật 2

2.3.3 Phân bố 12

2.3.4 Thành phần hóa học 12

2.3.5 Hoạt tính sinh học 13

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 18

3.1 Phương tiện nghiên cứu 18

3.1.1 Thời gian và địa điểm 18

3.1.2 Hóa chất 18

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 18

3.2 Khảo sát nguyên liệu 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 19

3.3.2 Điều chế cao methanol tổng 19

3.3.3 Phương pháp cô lập 20

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Biện luận cấu trúc của hợp chất PT8: 30

4.2 Biện luận cấu trúc của hợp chất PT3: 31

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

PHỤ LỤC 39

DANH SÁCH BẢNG



Bảng 2.1: Một số cấu trúc hóa học của Parmotrema tinctorum 14

Bảng 2.2: Nồng độ ức chế chủng nấm tối thiểu của các cao địa y 15

Bảng 2.3: Hoạt tính kháng khuẩn của P Tinctorum 16

Bảng 2.4: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của các cao địa y 16

Bảng 2.5: Nồng độ ức chế chủng nấm tối thiểu của các cao địa y 16

Bảng 3.1: Kết quả SKLM cao methanol sắc ký nhanh - cột khô từ cao methanol 20

Bảng 3.2: kết quả sắc ký nhanh-cột khô từ phân đoạn 8 22

Bảng 3.3: Kết quả sắc ký cột khô từ phân đoạn 8.11 24

Bảng 3.4: Kết quả sắc ký cột khô phân đoạn 12 26

Bảng 3.5: Kết quả sắc ký cột phân đoạn 12.4 27

Bảng 4.1: So sánh dữ liệu phổ của hợp chất PT8 với orcinol 31

Bảng 4.2: Phổ NMR của PT3 34

Bảng 4.3: So sánh dữ liệu phổ của hợp chất PT3 với lecanoric acid 35

DANH SÁCH HÌNH



Hình 1.1: Các dạng địa y thường gặp 3

Hình 2.2: Địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale 12

Hình 3.1: Kết quả SKLM cao methanol sắc ký nhanh-cột khô từ cao methanol 21

Hình 3.2: Kết quả SKLM phân đoạn 8 23

Hình 3.3: Kết quả SKLM phân đoạn 8.11 24

Hình 3.4: Chất PT8 25

Hình 3.5: Kết quả SKLM chất PT8 25

Hình 3.6: Kết quả SKLM phân đoạn 12 26

Hình 3.7: Kết quả SKLM phân đoạn 12.4 28

Hình 3.8: Tinh thể PT3 28

Hình 3.9: Kết quả SKLM PT3 29

DANH SÁCH SƠ ĐỒ



Sơ đồ 3.1: Quy trình điều chế cao methanol bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng 19

DANH SÁCH PHỤ LỤC



Phụ lục 1: Các phổ của 5-methylbenzene-1,3-diol (PT8) 39

Phụ lục 1.1: Phổ MS của PT8 39

Phụ lục 1.2: Phổ 1H-NMR của PT8 40

Phụ lục 1.3: Phổ 1H-NMR dãn rộng của PT8 41

Phụ lục 1.4: Phổ 1H-NMR dãn rộng của PT8 42

Phụ lục 1.5: Phổ 13C-NMR của PT8 43

Phụ lục 1.6: Phổ 13C-NMR dãn rộng của PT8 44

Phụ lục 2: các phổ của 4-(2,4-dihydroxy-6-methylbenzoyl)oxy-2-hydroxy-6-methylbenzoic Acid (PT3) được đo trong dung môi acetone 45

Phụ lục 2.1: Phổ MS của PT3 45

Phụ lục 2.2: Phổ 1H-NMR của PT3 46

Phụ lục 2.3: Phổ 1H-NMR dãn rộng của PT3 47

Phụ lục 2.4: Phổ 1H-NMR dãn rộng của PT3 48

Phụ lục 2.5: Phổ 13C-NMR của PT3 49

Phụ lục 2.6: Phổ 13C-NMR dãn rộng của PT3 50

Phụ lục 2.7: Phổ COSYcủa PT3 51

Phụ lục 2.8: Phổ COSY dãn rộngcủa PT3 52

Phụ lục 2.9: Phổ HSQC của PT3 53

Phụ lục 2.10: Phổ HSQC dãn rộng của PT3 54

Phụ lục 2.11: Phổ HMBC của PT3 55

Phụ lục 2.12: Phổ HMBC dãn rộng của PT3 56

Phụ lục 2.13: Phổ HMBC dãn rộng của PT3 57

Phụ lục 2.14: Phổ HMBC dãn rộng của PT3 58

Phụ lục 3: các phổ của 4-(2,4-dihydroxy-6-methylbenzoyl)oxy-2-hydroxy-6-methylbenzoic Acid (PT3) được đo trong dung môi DMSO 59

Phụ lục 3.1: Phổ 1H-NMR của PT3 59

Phụ lục 3.2: Phổ 1H-NMR dãn rộng của PT3 60

Phụ lục 3.3: Phổ 1H-NMR dãn rộng của PT3 61

Phụ lục 3.4: Phổ 13C-NMR của PT3 62

Phụ lục 3.5: Phổ 13C-NMR dãn rộng của PT3 63

Phụ lục 3.6: Phổ 13C-NMR dãn rộng của PT3 64

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam có rất nhiều loài thực vật có tác dụng điều trị bệnh, là nguồn dược liệu quý giá cho y học cổ truyền và y học hiện đại

Địa y là loài thực vật cộng sinh giữa tảo và nấm, có thể sống ở hầu hết các nơi: đất, đá và thậm chí trên thân cây Thế nên, chúng có đóng góp đáng kể vào hệ sinh thái thông qua quá trình quang hợp, giúp làm giảm lượng CO2 trong khí quyển

Địa y, xuất hiện cách đây 400 triệu năm, được biết đến như là một loại dược liệu dùng để chữa bệnh cho con người Trên thế giới, các công trình về sự tách chiết các hợp chất từ địa y cho thấy nó chứa một lượng lớn các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm depside, depsidone, dibenzofuran, xanthone, terpene Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học, những công trình khảo sát hoạt tính sinh học cho thấy các chất từ địa y có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư, kháng HIV,…[1]

Năm 2006, khoảng 275 loài địa y ở Việt Nam đã được thống kê, trong đó

122 loài mới lần đầu tiên được ghi nhận Một số nghiên cứu cho thấy địa y chứa các hợp chất có cấu trúc hóa học đặc biệt cũng như có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô ruột kết HTC116, ức chế DNA polymerase Nghiên cứu trên đối tượng địa y đang là một hướng đi mới mẻ trong hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta [2-3]

Việt Nam có khí hậu rất thích hợp cho sự phát triển của địa y Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, địa y có nhiều hoạt tính sinh học quý giá nhưng nó chưa được quan tâm nghiên cứu đúng mức ở Việt Nam, trong khi nước ta có nguồn địa y rất phong phú và dồi dào Nối tiếp những thành quả nghiên cứu của

nhóm, đề tài “Phân lập hai hợp chất từ cao methanol của địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale thu hái tại Thành Phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng” góp

Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale ở Việt Nam.

1.2 Mục đích nghiên cứu:

Phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chất từ loài địa y Parmotrema

tinctorum (Nyl.) Hale

1.3 Nội dung nghiên cứu:

- Tìm hiểu về loài địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale

- Thu và xử lý nguyên liệu địa y tươi, nghiền mịn nguyên liệu thành bột

- Tiến hành chiết cao methanol (cao tổng), thực hiện chiết các cao phân đoạn

- Khảo sát, phân lập hợp chất tinh khiết từ cao methanol bằng sắc ký cột

và sắc ký lớp mỏng

- Xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết thu được

- Tổng hợp, đánh giá kết quả và viết báo cáo

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan thực vật học địa y

2.1.1 Đặc điểm của địa y

Địa y là sinh vật cộng sinh gồm photobiont (tảo hoặc tảo xanh) và mycobiont (nấm) cùng nhau tạo thành một đơn vị sinh lý độc lập Các photobiont cung cấp cho địa y các chất dinh dưỡng bằng cách thực hiện quang hợp, và mycobiont giúp hấp thụ nước và chất dinh dưỡng từ môi trường xung quanh và môi trường bảo vệ photobiont Do đó, địa y tự hỗ trợ và phát triển trên đá, mái nhà, thân cây, vv Chúng không có các cơ quan chuyên môn như rễ, thân, lá, Vì vậy chúng thích nghi với khí hậu khô hạn và có thể sống trên những điều kiện khắc nghiệt [4]

Khoảng 17.000 loài địa y đã được biết Địa y được chia làm 3 dạng chính [1]:

- Dạng khảm (crustose lichen): bề mặt của tản địa y khảm cực kì mỏng và bám chặt vào bề mặt vật chủ bằng những sợi nấm có lõi

- Dạng phiến (foliose lichen): tản địa y dạng phiến có hình dạng như tờ giấy mỏng Bề mặt trên và dưới khác biệt nhau rõ rệt Tản bám lỏng lẻo trên bề mặt chủ bằng các rễ giả

- Dạng bụi (fruiticose lichen): địa y dạng bụi có hình thức giống như bụi cây nhỏ, đứng trên bề mặt chủ và xõa xuống

2.1.2 Công dụng của địa y

Điạ y khá phổ biến trong thiên nhiên Chúng phát triển sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng nhiệt đới, có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh mà tại

Địa y dạng khảm Địa y dạng phiến Địa y dạng bụi

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Lichen) Hình 1.1: Các dạng địa y thường gặp

đó không có sự cạnh tranh của các thực vật khác Sau một thời gian phát triển địa y tiết ra một loại acid làm mục đá có tác dụng rất lớn đối với sự hình thành đất Khi chúng chúng chết đi, tại đó hình thành lớp đất mùn nhiều dinh dưỡng

là nguồn thức ăn cho các loài thực vật khác đến sau (rêu, thực vật có mạch) Như vậy, địa y đã giữ vai trò tiên phong, mở đường trên các chỗ đất cằn cõi [5]

Một số loài địa y như Cladonia rangiferina còn là thức ăn chủ yếu của loài hươu

Bắc cực [6]

Trong nghiên cứu sinh thái, địa y có khả năng hấp thụ các chất độc hại như sulfur dioxide (SO2), flo (F2) và nitơ dioxide (NO2) vào hệ thống tản địa y Địa y đã được con người sử dụng trong nhiều thế kỷ với nhiều mục đích khác nhau như: thực phẩm, thuốc nhuộm, nguyên liệu cho nước hoa và là

phương thuốc chữa bệnh trong y học dân gian Evernia prunastri Var prunastri (oakmoss) và Pseudevernia furfuracea (treemoss) là hai loài địa y được sử dụng

trong ngành công nghiệp nước hoa Một số dịch chiết địa y đã được dùng trong

y học dân gian để chữa nhiều bệnh khác nhau, chẳng hạn như Lobaria

pulmonaria chữa bệnh phổi, Xanthoria parientina trị vàng da , Usnea spp tăng

cường tóc, Cetraria islandica (rêu Iceland) trị bệnh lao, viêm phế quản mãn tính

và tiêu chảy [7]

2.2 Chi Parmotrema

2.2.1 Mô tả thực vật

Chi Parmotrema đặc trưng bởi dạng phiến ngắn và rộng, thùy có lông, vỏ

ngoài xốp, bào tử đính hình trụ, rễ ngắn và nhỏ, bao gồm các dạng địa y trung

gian giữa chi Cetraria và loài Xanthoparmelia Mặt dưới của phiến lá có màu

trắng đến đen Hiện nay, chi này có khoảng 350 loài, phân bố chủ yếu ở vùng

nhiệt đới, đặc biệt ở các đảo Thái Bình Dương và Nam Mỹ [7]

2.2.2 Thành phần hóa học của chi Parmotrema

- Các acid béo: 9-oxodecanoic acid (1), 9-methyltetradecanoic acid (2), 6-methyltetradecanoic acid (3), 3-hydroxydecanoic acid (4), nonanedioic acid (5) và decanedioic acid (6) [8]

9-oxodecanoic acid (1) 9-methyltetradecanoic acid (2)

6-methyltetradecanoic acid (3) 3-hydroxydecanoic acid (4)

nonanedioic acid (5) decanedioic acid (6)

- Các acid béo vòng: năm 1990, F David và cộng sự đã cô lập được

prasesorediosic acid (7) và protopraesorediosic acid (8) từ Parmotrema

praesorediosum Ngoài ra, cũng từ chi Parmotrema còn phân lập được

lichesterinic acid (9) và protolichesterinic acid (10) [9]

prasesorediosic acid (7) protopraesorediosic acid (8)

lichesterinic acid (9) protolichesterinic acid (10)

- Các hợp chất phenol đơn vòng:

+ Năm 2000, từ địa y Parmotrema stuppeum (Nyl.) Hale, Jayaprakasha G

K đã cô lập orsellinic acid (14) và methyl orsellinate (15) [10]

+ Năm 2002, Irma S Rojas công bố sự có mặt của orcinol (11), methyl-

tinctorum (Nyl.) Hale [11]

+ Năm 2011, Dương Trúc Huy, Huỳnh Bùi Linh Chi và cộng sự đã phân

lập methyl orsellinate (15), orsellinic acid (14), methyl haematommate (13), butyl orsellinate (16) từ địa y Parmotrema planatilobatum (Hale) [12]

n Depside:

+ Năm 1987, Sakurai A Đã cô lập được isolecanoric acid (17) từ loài địa

y Parmotrema tinctorum [13]

+ Năm 1999, Laily B Din [14] đã công bố trong các loài địa y thuộc chi

Parmotrema có chứa một hàm lượng lớn các hoạt chất bậc hai bao gồm các

depside như atranorin (18) và chloroatranorin (19)

+ Năm 2002, Alcir Teixeira Gomes [15] và cộng sự đã cô lập lecanoric

acid (20) từ Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale

+ Năm 2011, Neeraj V Và cộng sự đã cô lập và xác định cấu trúc của hợp

chất tinh khiết atranorin (18), lecanoric (20) từ địa y Parmotrema sancti-angelli

methyl orsellinate (15) COOCH3 H

n-butyl orsellinate (16) COOC4H9 H

- Depsidone: Trong các loài địa y thuộc chi Parmotrema có mặt các

depsidone: furmaprotocetraric aicd (23), succinprotocetraric acid (24)

+ Năm 1977, Keogh M.F đã phân lập và xác định cấu trúc của 3 hợp chất

protocetraric acid (22), malonprotocetraric acid (21) và từ loài địa y

Parmotrema conformatum [17]

+ Năm 1980, Donovan D.G và cộng sự công bố đã phân lập và xác định

cấu trúc hợp chất tinh khiết salazinic acid (25) và consalazinic acid (26) từ loài

địa y Parmotrema subisidiosum [18]

+ Năm 2000, Kharel M.K và cộng sự đã công bố phân lập và xác định cấu trúc hóa học 3 hợp chất α-alectoronic acid (29), α-collatolic acid (27) và dehydrocollatolic acid (28) từ loài địa y Paramotrema nilgherrense [19]

+Năm 2010, Honda N.K và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của

norstictic acid (30), hypostictic acid (31) từ loài địa y Parmotrema dilatum [20]

+ Năm 2012, tác giả Lê Hoàng Duy đã phân lập và xác định cấu trúc hóa

học của 2’’’-O-methyα-alectoronic acid (32), 2’’’-O-ethyl-α-alectoronic acid

(33), dehydroalectoronic acid (34), dehydrocollatolic acid (28), parmosidone A

(35), parmosidone B (36), parmosidone C (37) từ loài địa y Parmotrema

mellissii [3]

isolecanoric acid (17) H COOH

lecanoric acid (20) COOH H

R

atranorin (18) H

chloroatranorin (19) Cl

R

malonprotocetraric acid (21) COCH2COOH

protocetraric acid (22) H

furmaprotocetraric aicd (23) COCH=CHCOOH

succinprotocetraric acid (24) COCH2CH2COOH

+ Năm 2012, tác giả Lê Hoàng Duy đã phân lập và xác định cấu trúc hóa

học của isocoumarin A (39), isocoumarin B (40), alectoronic acid (41), collatolic acid (42), 2’’’-O-β-alectoronic acid (43), 2’’’-O-ethyl-β-alectoronic acid (44) từ loài địa y Parmotrema mellissii [3]

β-+ Năm 2016, Dương Thức Huy đã phân lập và xác định cấu trúc của

Parmoether B (38) [2]

Parmoether B (38)

isocoumarin A (39) isocoumarin B (40)

- Dibenzofuran: Năm 1977, Keogh M.F [17], năm 2012, Lê Hoàng Duy

[3], năm 2011, Dương Thúc Huy, Huỳnh Bùi Linh Chi và cộng sự [15] đã phân

planatilobatum (Hale) Hale

Usnic acid (45)

- Xanthone: Năm 2009, Ana C.M., N K Honda và cộng sự đã cô lập được

lichenxanthonium và Parmotrema sphaerospora [21]

Lichenxanthone (46)

- Quinone: Năm 2014, Prashith Kekuda đã phân lập và xác định cấu trúc

Skyrin (47)

- Triterpene: Năm 2016, Dương Thúc Huy đã phân lập và xác định cấu

trúc của 6α-acetoxyhopan-16β,22-diol (48), hopan-6α,16α,22-triol (49) từ loài

2.3 Địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale

2.3.1 Phân loại thực vật

- Tên khoa học: Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale

- Tên gọi khác : Parmelia tinctorum, Parmelia tinctoria, Lichen chinenis

Giới (kingdom): Nấm

Ngành (phylum): Pezizomycotina

Lớp (class): Lecanoromycetes

Bộ (oder): Leacanorineae

Họ (family): Parmeliaceae

Chi (genus): Parmotrema

Loài (species): Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale

2.3.2 Mô tả thực vật

Địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale là loài địa y dạng phiến rộng 7 –

15 cm, có thùy tròn rộng 10 – 20 mm, mép nối liền hoặc khía tai bèo Ở giữa tản có xẻ dạng chân vịt Mặt trên màu xanh xám; mặt dưới màu đen mịn [4]

2.3.3 Phân bố

Loài địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale phân bố trên đá và cây xanh

trong khu vực ẩm ướt của Australia, các vùng nhiệt đới và ô đới ở Bắc Trung

và Nam Mỹ, châu Phi, Nam Á, Đông Á và Indonesia Trong Châu Đại Dương, ngoài Australia nó cũng được tìm thấy ở đảo quốc Fiji, Papua New Guinea, Vanuatu, Samoa và miền Bắc của New Zealand, nó xuất hiện trên vỏ cây, gỗ và đá từ khu vực ven biển đến rừng núi Tại Việt Nam chúng được tìm thấy ở nhiều khu vực có khí hậu gần giống vùng ôn đới như khu vực Thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng

Hình 2.2: Địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale

2.3.4 Thành phần hóa học

- Năm 1987, Sakurai A Đã phân lập được isolecanoric acid (17) [13]

- Năm 1993, Bazyli czeczuga và Hiroyuki Kashiwadani đã tìm thấy

flavoxanthin (50) và β-citraurin (51) trong địa y P tinctorum [22]

- Năm 1998, Jayaprakasha G.K., Jaganmohan Rao L Và cộng sự đã cô lập

được 4 hợp chất gồm atranorin (18), methyl orsellinate (15), orsellinic acid (14)

và lecanoric acid (20) [10]

- Năm 2000, V L Eifler-Lima và cộng sự đã phân lập được salazinic acid

(25) [23]

- Năm 2002, Irma S Rojas công bố sự có mặt của orcinol (11),

methyl-β-orcinolcarboxylate (12) và methyl haematommate (13) [11]

Năm 2002, Alcir Teixeira Gomes và cộng sự đã cô lập lecanoric acid (20)

[15]

- Năm 2013, các tác giả Chutima S., Thitima R., Kansri B đã phân lập và

xác định cấu trúc của orsellinic acid (14), methyl orsellinate (15), antranorin (18) và lecanoric acid (20) [24]

- Năm 2015, Nguyễn Văn Lộc đã phân lập và xác định cấu trúc của

methyl-β-orcinolcarboxylate (12) [25]

- Năm 2016, Trần Minh Chí đã phân lập và xác định cấu trúc của atranol

(52), lecanorol (53), divaricatinic (54), methyl-β-orcinolcarboxylate (12), methyl haematommate (13) và 3β-acetoxyhopan-1β,22-diol (55) [26]

- Năm 2016, Lê Mộng Tuyền và Dương Thị Kim Ngân đã phân lập và xác

định cấu trúc của orsellinic acid (14) và lecanorol (53) [27]

- Năm 2017, Nguyễn Hoàng Phương đã phân lập và xác định cấu trúc của praesorether A [28]

- Năm 2017, Lâm Đức Ninh và Nguyễn Thị Cẩm Thu đã phân lập và xác

định cấu trúc của methyl β-orsellinate và methyl orsellinate (15) [29]

2.3.5 Hoạt tính sinh học

Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale có chứa hợp chất có hoạt tính sinh học

atranorin, lecanoric acid, salazinic acid và usnic acid [16] Chúng thể hiện tác dụng sinh học đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa và kháng ung thư, [6,17]

2.3.5.1 Kháng nấm

Năm 2014, Vivek M.N và cộng sư đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng

nấm trên cao methanol của 3 loài địa y là P tinctorum, P grayanum, P

praesorediosum, kết quả P tinctorum cho hoạt động ức chế cao nhất trên 2 loại

nấm Candida albicans và Crytococcus neoformans bằng kỹ thuật khoanh giấy

kháng sinh khuếch tán [18]

- Ở nồng độ 10mg/mL, vùng ức chế là 1,2±0,1 cm ở Candida albicans và 1,2±0,0 cm ở Crytococcus neoformans

- Ở nồng độ 20 mg/mL, vùng ức chế là 1,4±0,1 cm ở Candida albicans và 1,5±0,1 cm ở Crytococcus neoformans

Năm 2017, Trần Thị Thủy Tiên, Trần Thị Thu Trang đã thử hoạt tính trên

địa y Parmotrema tinctorum có khả năng ức chế sự phát triển các loài nấm [19]

Bảng 2.2: Nồng độ ức chế chủng nấm tối thiểu của các cao địa y

Collectotrichum sp

(µg/mL)

Fusarirum oxysporum

(µg/mL)

Achlya sp

(µg/mL) Methanol ngâm ở

Năm 2014, Vivek M.N và các cộng sự đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính

kháng khuẩn trên cao methanol của 3 loài thuộc chi Parmotrema Kết quả cho thấy Parmotrema tinctorum kháng trên 8 dòng vi khuẩn cả gram (-) và gram (+): Staphylococus aureus, Staphylococus epidermidis, Bacillus cereus,

Kbebsiella preumoniae, Enterobacter aerogenes, Shigella flexneri, Salmonella typhi, Escheria coli [3]

Bảng 2.3: Hoạt tính kháng khuẩn của P tinctorum

Năm 2016, Trần Thị Thủy Tiên, Trần Thị Thu Trang đã tiến hành khảo sát

khả năng kháng khuẩn của địa y P tinctorum bằng phương pháp in vitro trên đĩa thạch Kết quả cho thấy các cao chiếc từ địa y P tinctorum có khả năng ức

chế các chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) nhưng ở nồng độ ức chế tối thiểu khá cao [19]

Bảng 2.4: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của các cao địa y

2.3.5.3 Kháng oxy hóa

Bên cạnh thử nghiệm kháng khuẩn, Vivek M.N và các cộng sự còn tiến

hành khảo sát khả năng kháng oxy hóa DPPH trên 3 loài địa y Parmotrema Kết quả cho thấy cao chiết methanol của địa y P tinctorum kháng oxy hóa yếu (IC50

= 439,06 µg/mL) so với vitamin C (IC50 = 2,3 µg/mL) [3]

Năm 2014, nghiên cứu của P Salin Raj, A Prathapan và cộng sự về khả

năng kháng oxy hóa từ dịch chiết ethyl acetate của Parmotrema tinctorum

(PTEE) bằng cách sử dụng làm sạch gốc tự do DPPH, ABTS, superoxide và hydroxyl Kết quả cho thấy hoạt động kháng gốc tự do DPPH của PTTE (IC50

= 396,83 ± 2,98 mg/mL), ABTS (151,34 ± 1,79 mg/mL), superoxide (30,29 ± 1,17 mg/mL) và hydroxyl (35,42 ± 1,22 mg/mL) [20]

2.3.5.4 Kháng ung thư

Năm 2010, Bogo D Và cộng sự đã công bố kết quả thử nghiệm in vitro

khả năng kháng lại ung thư biểu mô thanh quản, ung thư biểu mô tế bào vú, ung thư biểu mô tế bào thận từ các hợp chất orsellinate phân lập được từ loài địa y

P tinctorum Kết quả cho thấy trong các nhóm orsellinate khảo sát, n-butyl

orsellinate có hoạt tính mạnh nhất với IC50 = 7,2 µg/mL đối với tế bào ung thư biểu mô thanh quản, IC50 = 14,0 µg/mL trên dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào

vú và IC50 = 12,6 µg/mL trên dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào thận [21]

2.3.3.5 Khả năng ức chế enzyme

Năm 2014, Jomon Sebastian và cộng sự đã công bố những nghiên cứu về tiềm năng ức chế aldose reductase của cao chiết ethyl acetate (PTEAE) và

ethanol (PTEE) của địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale Kết quả cho thấy

cao chiết từ ethyl acetate và ethanol có thành phần chính là acid usnic, sở hữu cao nhất tiềm năng ức chế Nghiên cứu sâu hơn về điều này chắc chắn sẽ dẫn đến sự phát triển của một loại thuốc chống đục tinh thể do tiểu đường và bệnh võng mạc [17]

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ

THỰC NGHIỆM 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

- Đề tài “Phân lập hai hợp chất từ cao methanol của địa y Parmotrema

tinctorum (Nyl.) Hale thu hái tại Thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng” được thực

hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh-Hữu cơ, khoa Sư Phạm, trường Đại Học Cần Thơ

- Thời gian thực hiện từ tháng 7 năm 2017 đến tháng 11 năm 2017

3.1.2 Hóa chất

- Dung môi đóng chai Việt Nam (Chemsol) và dung môi đóng chai Trung

Quốc: n-hexane, acetone, methanol, dichloromethane, diethyl ether, ethyl

acetate,…

- Vanilin và H2SO4 đậm đặc, được dùng để pha thuốc thử hiện màu

- Silica gel Merck (0,04-0,063 mm) để sắc ký cột

- Bản mỏng silica gel GF254 của Merck dùng cho SKLM

và Công nghệ Hà Nội, Việt Nam

- Khối phổ được đo trên máy khối phổ Agilent 6120, sử dụng kỷ thuật APCI và ESI tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Hà Nội, Việt Nam

- Cân phân tích Sartorius bốn số lẻ

- Một số dụng cụ khác như: máy bơm tạo áp suất, lọ thủy tinh, bình cầu dung tích 50 mL, 250 mL, 500 mL và 1000 mL Và các loại becher, erlen, ống đong, ống mao quản, phễu thủy tinh, bếp điện, máy sấy,…

- Các loại cột sắc ký có đường kính (Φ) và chiều dài (l) như sau:

+ Φ = 0,9 cm, l = 30 cm

+ Φ = 1,5 cm, l = 60 cm

+ Φ = 2 cm, l = 80 cm

+ Φ = 3 cm, l = 70 cm

3.2 Khảo sát nguyên liệu

- Địa y Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale được thu hái tại Thành phố Đà

Lạt, tỉnh Lâm Đồng và được định danh bởi TS Võ Thị Phi Giao, Khoa Sinh học và Công nghệ Sinh học , Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM

- Một tiêu bản thực vật có ký hiệu CTU-CD006 được lưu trữ tại bộ môn

Sư phạm Hóa học-Khoa Sư phạm-Trường Đại Học Cần Thơ

- Mẫu sau khi thu hái được làm sạch, sấy khô và nghiền thành bột mịn để chuẩn bị cho quá trình tách chiết

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Tách chiết hợp chất hữu cơ ra khỏi cây

- Áp dụng hai phương pháp cơ bản để tách chiết các hợp chất hữu cơ ra khỏi bột cây là: phương pháp chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng Trong đó, phương pháp chiết rắn-lỏng được áp dụng phổ biến hơn bao gồm sự ngấm kiệt (perclolation), sự ngâm ở nhiệt độ phòng (maceration), sự chiết bằng hệ thống Soxhlet,… và sự chiết bằng cách nấu bột cây với nước ( gọi là nước sắc) Ngoài

ra, còn có các phương pháp lôi cuốn hơi nước (áp dụng đối với việc tách tinh dầu thực vật) và chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method),…

- Luận văn này áp dụng phương pháp chiết rắn-lỏng là sự ngâm ở nhiệt độ phòng

3.3.2 Điều chế cao methanol tổng

Địa y được sấy khô, nghiền nhỏ

Sơ đồ 3.1 Quy trình điều chế cao methanol bằng phương pháp ngâm ở

nhiệt độ phòng

3.3.3 Phương pháp cô lập

3.3.3.1 Sắc ký nhanh-cột khô

Tiến hành sắc ký nhanh-cột khô với mẫu cao methanol đã điều chế được Khối lượng cao methanol là 22 g, khối lượng silica gel trộn mẫu là 33 g, khối lượng silica gel pha tĩnh là 280 g, phễu dùng để sắc ký có đường kính là 8,5 cm, chiều cao lớp silica gel là 5 cm, dung mối giải ly là hexane-acetone-methanol với độ phân cực tăng dần từ 100% hexane và kết thúc là 100% methanol Silica gel được sử dụng là silica gel Merck

Kiểm tra quá trình sắc ký bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Sau đó, cô quay thu hồi dung môi thu được các chất có khối lượng không đổi Từ các kết quả sắc ký bản mỏng và khối lượng các chất thu được, tiến hành gôm phân đoạn

và chọn ra phân đoạn để tiến hành phân lập chất Kết quả được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả sắc ký nhanh - cột khô từ cao methanol tổng

40: 60: 0

30: 70: 0 20: 80: 0 10: 90: 0

0: 100: 0

0: 50: 50 0: 0: 100 100% Methanol

Thuốc hiện màu được sử dụng là Vanilin/H2SO4

Dựa vào kết quả SKLM, chọn phân đoạn 8 và phân đoạn 12 để tiếp tục

khảo sát

3.3.3.2 Khảo sát phân đoạn 8

Tiến hành sắc ký nhanh-cột khô phân đoạn 8 (m = 3,471 g) với cột sắc ký

đường kính 6,5 cm, khối lượng silica gel lên cột là 60 g, chiều cao lớp silica gel lên cột là 4 cm, hệ dung môi giải ly là dichloromethane-methanol với độ phân cực tăng dần, bắt đầu từ 100% dichloromethane và kết thúc quá trình giải ly bằng 100% methanol Silica gel Merck được sử dụng làm pha tĩnh

Kiểm tra các chất ra khỏi cột bằng sắc ký lớp mỏng Sau đó, cô quay thu hồi dung môi, thu được các chất có khối lượng không đổi Từ kết quả sắc ký bản mỏng và khối lượng các chất thu được, ta tiến hành chọn ra phân đoạn tiềm năng để tiếp tục phân lập chất Kết quả được trình bày trong bảng 3.2

Hình 3.1: Kết quả SKLM các phân đoạn từ cao methanol tổng

536,6

561,5 536,1 280,2

Tổng Hiệu Suất

3390,2 97,7% Bảng 3.2: kết quả sắc ký nhanh-cột khô từ phân đoạn 8

Thuốc hiện màu sử dụng là Vanilin/H2SO4

Dựa vào kết quả SKLM chọn phân đoạn 8.11 tiến hành khảo sát

a Phân lập hợp chất PT8

Tiến hành SKC phân đoạn 8.11 với khối lượng là 536,6 mg, sử dụng cột

có đường kính là 2 cm, khối lượng silica gel lên cột là 16 g, chiều cao lớp silica gel lên cột là 10,5 cm, hệ dung môi giải ly là hexane: ethyl acetate: acetone, dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần từ 100% hexane, và kết thúc quá trình giải ly bằng 100% acetone Pha tĩnh sử dụng silica gel Merck Kết quả được trình bày trong bảng 3.3 như sau:

Hình 3.2: Kết quả SKLM phân đoạn 8

Bảng 3.3: Kết quả sắc ký cột khô từ phân đoạn 8.11

Phân đoạn Số lọ (5 mL/lọ) Hệ dung môi giải ly

Hexane : ethyl acetate

Khối lượng (mg)

499,7 93,12%

Hình 3.3: Kết quả SKLM phân đoạn 8.11

Thuốc hiện màu sử dụng là Vanilin/H2SO4

Kết quả thu được từ phân đoạn 8.11 là 74,5 mg chất vô định hình màu vàng nâu thuộc phân đoạn 8.11.5, kết quả SKLM sơ bộ cho thấy đây là một chất

sạch và được kí hiệu là PT8