Nghiên cứu đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta L.)

LỜI CẢM ƠN Bằng lòng cảm ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trương Văn Châu tận tình giúp đỡ, bảo suốt trình thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các, thầy cô Ban giám hiệu, phòng Sau đại học khoa Sinh - Kĩ thuật nông nghiệp trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, nơi đào tạo kiến thức bản, chuyên môn sinh học thực nghiệm tạo điều kiện cho suốt trình học tập, thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới lãnh đạo sở GDĐT Hà Nội, tập thể sư phạm trường THPT Đa Phúc tạo điều kiện tốt cho học tập nâng cao trình độ chuyên môn để hoàn thành luận văn Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp quan tâm, giúp đỡ thực luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 03 tháng 07 năm 2013 Học viên Đặng Thúy Hồng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu trình bày luận văn thực không trùng lặp với tác giả khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nội dung đề cập luận văn Hà Nội, ngày 03 tháng 07 năm 2013 Học viên Đặng Thúy Hồng MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục hình, biểu đồ Danh mục bảng Danh mục chữ viết tắt MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 1.1 Hợp chất tự nhiên thực vật 1.1.1 Hợp chất phenolic 1.1.2 Flavonoid thực vật 1.1.3 Tannin thực vật 10 1.1.4 Hợp chất coumarin 11 1.1.5 Alkaloid 12 1.1.6 Steroid 13 1.1.7.Terpen thực vật 14 1.2 Bệnh béo phì (Obisity) 14 1.2.1 Thực trạn o h t n giới Việt Nam 15 1.2.2 Tác hại bệnh béo phì 16 1.2.3 Nguyên nhân gây béo phì 16 1.2.4 Giải há điều trị bệnh béo phì 16 1.2.5 Rối loạn t ao đổi lipid 16 1.3 Bệnh đái tháo đường 18 1.3.1 Khái niệm phân loại 18 1.3.2 Thực trạn đái tháo đường giới Việt Nam 19 1.3.3 Phân loại chế bệnh sinh ĐTĐ 21 1.3.4 Tác hại biến chứng 22 1.3.5 Một số thuốc tổng hợ điều trị bệnh ĐTĐ 23 1.3.6 Đái tháo đường với y học cổ truyền (YHCT) 23 1.4 Mối quan hệ béo phì đái tháo đường 24 1.5 Phương pháp gây đái tháo đường STZ 25 1.6.Vài nét Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) 26 1.6.1 Mô tả 26 1.6.2 Phân bố, sinh thái 26 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.1 Mẫu thực vật 28 2.1.2 Mẫu động vật 28 2.1.3 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 29 2.2 Phươn há nghiên cứu 29 2.2.1 Phươn há tách chiết mẫu nghiên cứu 29 2.2.2 Phươn há khảo sát thành phần hóa học Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) 30 2.2.4 Sắc ký lớp mỏng 33 2.2.5 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết dịch chiết Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) lên chuột nhắt ây ĐTĐ ằng STZ 33 2.2.6 Sử dụn hươn há hóa sinh - y dược 35 2.2.7 Xử lý số liệu 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .39 3.1 Kết tách chiết số đặc tính hoá sinh hân đoạn dịch chiết từ Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) 39 3.1.1.Quy t nh tách hân đoạn dịch chiết từ Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) 39 3.1.2 Kết định tính số nhóm hợp chất tự nhiên phân đoạn dịch chiết từ Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) 40 3.1.3 Phân tích thành phần hợp chất tự nhi n t on hân đoạn dịch chiết Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) sắc kí lớp mỏng 42 3.1.4 Định lượn hàm lượng polyphenol tổng số cao dịch chiết hân đoạn từ Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) 43 3.2 Kết xác định liều độc cấp 45 3.3 Kết tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm 46 3.4 Tác dụng hạ glucose huyết số hân đoạn dịch chiết từ Cỏ sữa to mô hình chuột ĐTĐ ty e 51 3.4.1 Kết tạo mô hình chuột ĐTĐ ty e thực nghiệm 51 3.4.2.Tác dụng số hân đoạn dịch chiết từ Cỏ sữa to đến nồng độ glucose huyết lúc đói chuột ĐTĐ 54 3.5 Tác dụn đến chuyển hóa lipid Cỏ sữa to mô hình chuột ĐTĐ ty e 57 KẾT LUẬN .60 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ H nh 1.1 Khun cac on flavonoid Hình 2.1 Cây Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) 28 Hình 2.2 Chuột nhắt t ắn Swiss 29 Hình 2.3 Phươn há lấy máu đo lucose huyết 36 H nh 3.1 Quy t nh chiết xuất chất tự nhi n từ Cỏ sữa to 39 H nh 3.2 Sắc ký đồ hân đoạn 42 H nh 3.3 Đồ thị chuẩn allic acid 43 H nh 3.4 Chuột nuôi chế độ ăn o (A) ăn chuẩn (B)…………………….47 Hình 3.5 Biểu đồ iểu diễn tăn t ọn nhóm chuột với chế độ dinh dưỡn khác t on vòn tuần 47 Hình 3.6 Biểu đồ so sánh số số hóa sinh iữa lô chuột TN 49 Hình 3.7 Nồn độ lucose huyết lúc đói lô chuột thí n hiệm t ước sau ti m 72 iờ 54 Hình 3.8 Nồn độ lucose huyết lúc đói lô chuột t ước sau 21 n ày điều t ị 56 Hình 3.9 So sánh số số li id máu chuột ĐTĐ t ước sau điều t ị ằn cao hân đoạn EtOH, cao hân đoạn n-Hexan cao phân đoạn EtOAc 59 DANH MỤC CÁC BẢNG Bản 1.1 Phân loại BMI n ười t ưởn thành châu Âu châu Á 14 Bản 2.1 Bản hản ứn định tính đặc t ưn 30 Bản 2.3 Mô h nh n hi n cứu khả năn hạ lucose hân đoạn dịch chiết từ Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) 35 Bản 3.1 Khối lượn cao thu chiết qua hân đoạn hiệu suất 40 Bản 3.2 Bản kết định tính số hợ chất tự nhi n t on hân đoạn dịch chiết từ Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) 41 Bản 3.3 Kết đườn chuẩn allic 43 Bản 3.4 Hàm lượn oly henol tổn số t on PĐ dịch chiết ….44 Bản 3.5 Kết thử độc tính cấ theo đườn uốn 45 Bản 3.6 Thành hần thức ăn có hàm lượn li id choleste ol cao 45 Bản 3.7 T ọn lượn t un nh hai nhóm chuột nuôi ằn hai chế độ dinh dưỡn khác 46 Bản 3.8 So sánh số số hóa sinh máu iữa chuột nuôi thườn nuôi o h thực n hiệm 48 Bản 3.9 Nồn độ lucose huyết lô chuột t ước sau ti m STZ 52 Bản 3.10 Kết nồn độ lucose huyết lúc đói lô chuột sau 21 n ày điều t ị 55 Bản 3.11 So sánh số số li id máu chuột ĐTĐ t ước sau điều t ị ằn cao hân đoạn EtOH, cao hân đoạn n-Hexan cao phân đoạn EtOAc 58 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BP Béo phì Cho Cholesterol ĐTĐ Đái tháo đườn EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol Glu Glucose HDL Li o otein tỷ t ọn cao (Hi h-density lipoprotein) LDL Li o otein tỷ t ọn thấ (Low-density lipoprotein) n-hex n-hexan PĐ Phân đoạn STZ Streptozotocin TG Triglycerid MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Sự hát t iển kinh tế xã hội thời đại làm cho đời sốn n ười nân cao õ ệt Tuy nhi n, sốn n ày càn ệnh đái tháo đườn (ĐTĐ) n ày càn hát t iển th hát t iển mạnh mẽ Tỉ lệ tử von ĐTĐ ây a đứn thứ a iới sau ệnh tim mạch un thư Hiện nay, t n iới với nhữn thốn k ệnh tiểu đườn , loại 2, đán lo n ại Tại Mỹ, có 25 t iệu n ười mắc tăn l n tới 60 t iệu t on 10 năm tới khôn có nhữn n ười t on t nh t ạn thay đổi t on nế sốn n ười dân tiền tiểu đườn ( edia etic) t thành ị tiểu đườn thực Tại nước Châu Á tỉ lệ nhữn n ười mắc ệnh đái tháo đườn cũn tăn l n mạnh mẽ Tại Ấn độ tỷ lệ ệnh tiều đườn chiếm 20 % tổn số n ười ị tiểu đườn t n iới khiến châu Á mỏ vàn cho côn ty dược hẩm chế tạo thuốc t ị ệnh tiểu đườn thiết ị đo đườn t on máu Tổ chức WHO ti n đoán vào năm 2025 th Ấn Độ sau T un Quốc dẫn đầu iới tỷ lệ ệnh tiểu đườn Ở Việt Nam số n ười mắc ệnh ĐTĐ năm 2007 khoản t iệu n ười vào khoản t iệu n ười Như ệnh ĐTĐ thực t thành ánh nặn kinh tế, tinh thần mối lo n ại lớn cho nhiều quốc ia t n iới Hiện tại, để điều t ị đái tháo đườn có thuốc kinh điển ồm sul honylu ea, metfo min, litazone, insulin nhữn thuốc man lại hiệu ất tốt iết dùn đún cách, nhi n loại thuốc cũn kèm theo nhiều nhữn hản ứn hụ khôn mon muốn, tốn k m t on điều t ị n n chưa hù hợ với t nh t ạn kinh tế n ười dân Việt Nam Việt Nam nước có n uồn tài n uy n thực vật vô cùn hon hú đa dạn với khoản 12000 loài thực vật ậc cao có mạch, t on có tới 4000 loài mà nhân dân ta dùn làm thảo dược Hơn Việt Nam lại đất nước có Y học dân tộc cổ t uyền lâu đời Từ xa xưa, ôn cha ta iết sử dụn cỏ có sẵn t on tự nhi n để t ị ệnh N ày nay, cùn với nhiệm vụ côn n hiệ hóa đại hóa đất nước, th t on nhữn nhiệm vụ ản hải đảm ảo hát t iển n uồn tài n uy n thi n nhi n đất nước, tận dụn nhữn lợi tài n uy n thi n nhi n sẵn có quốc ia vào hục vụ cho đời sốn n ười T on đặc iệt quan tâm việc sử dụn hợ chất tự nhi n từ thực vật t on lĩnh vực Y - Dược học Nhiều côn t nh n hi n cứu cho thấy, hợ chất oly henol (một nhóm hợ chất tự nhi n từ thực vật) đan n ày càn ứn dụn ộn ãi t on điều t ị nhiều loại ệnh t on có ệnh đái tháo đườn - ệnh hổ iến n uy hiểm n ày [4], [9], [10], [12] Chính v vậy, việc n hi n cứu, khảo sát thành hần hoá học đặc tính sinh dược học thuốc có iá t ị Việt Nam nhằm đặt sở cho việc sử dụn chún vào điều t ị ĐTĐ cách hợ lí, hiệu có tầm quan t ọn đặc iệt Cây Cỏ sữa to (Euphorbia hirta L.) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) t on số Cỏ sữa to thấy hân ố số nước thuộc khu vực nhiệt đới Đôn Nam Á Nam Á ồm Ấn Độ, Malaysia, Phili in, Thái Lan, Lào, Việt Nam số nơi hía nam T un Quốc Ở Việt Nam, Cỏ sữa to hân ố tươn đối hổ iến hầu hết tỉnh, từ đồn ằn đến miền núi, t vùn núi cao lạnh Cây ưa ẩm, ưa sán chịu ỏn , thườn mọc t n đất ẩm, tươn đối mầu mỡ, lẫn với loài cỏ khác t n ãi hoan , vườn nhà hay uộn t ồn hoa màu (n ô, đỗ lạc…) Bộ hận dùn làm thuốc toàn dùn tươi khô, 51 nước, li id vận chuyển t on máu dạn kết hợ với hiệu Các acid otein đặc o tự vận chuyển yếu ởi al umin, li id khác lưu hành t on máu dạn hức hợ li o otein Có nhiều loại li o otein: loại có tỉ t ọn cao có t n HDL, loại có tỉ t ọn thấ có tên LDL, loại có tỉ t ọn ất thấ có t n LDL HDL có chức năn vận chuyển choleste ol LDL có chức năn vận chuyển t i lyce id t on máu Choleste ol kết hợ với LDL (Low density li o otein) ký hiệu LDLc dạn choleste ol ây hại cho thể chún vận chuyển choleste ol vào t on máu thấm vào thành mạch máu chún có vai t ò quan t ọn t on t nh h nh thành mản xơ vỡ độn mạch, tắc n hẽn độn mạch n ười BP, dễ ây nhồi máu tim đột tử ây tắc mạch máu não Cholesterol kết hợ với HDL (hi ht density li o otein) ký hiệu HDL-c dạn choleste ol có lợi cho thể chún chốn lại t nh xơ vỡ độn mạch ằn cách chuyển choleste ol dư thừa từ t on thành mạch máu t an [24] Như với tăn t ọn lượn thể, tăn lucose huyết cùn với số mỡ máu tăn cao (TC, TG, LDL-c) iảm HDL-c chuột cũn nhữn hiểu iết t nh chuyển hoá li id, chún kết luận ằn mô h nh ây chuột BP ằn chế độ ăn iàu chất o thành công Chuột BP tiế tục sử dụn cho nhữn n hi n cứu tiế theo 3.4 Tác dụng hạ glucose huyết số phân đoạn dịch chiết từ Cỏ sữa to mô hình chuột ĐTĐ type 3.4.1 Kết tạo mô hình chuột ĐTĐ type thực nghiệm Chuột nuôi BP đến n ày thứ 60, t ước thí n hiệm, cho chuột nhịn đói 1216 iờ, sau chuột BP ti m ụn liều đơn STZ (110 m /k ) Sau từ 3- n ày nhữn chuột ị ệnh với nồn độ lucose huyết xác định ≥ 18mmol/l [9] 52 STZ (Streptozotocin) có tên hóa học là: - deoxy - - (3 - metyl - nitrosoureido) - D - glucopyranose, hân lậ đầu ti n vào năm 1960 từ Streptomyces achromogens Đây kháng sinh có hoạt tính chốn un thư, ti u u, sinh u ây ĐTĐ Tác dụn ây ĐTĐ STZ há hủy chọn lọc tế ài tiết insulin tuyến tụy (tế ) Do STZ sử dụn ộn ãi t on mô h nh độn vật ĐTĐ ty e ty e hục vụ t on n hi n cứu thuốc [15], [16], [19], [21] T ước thí n hiệm, cho chuột nhịn đói 12- 16 iờ, sau chuột BP ti m ụn STZ ( t on đệm Cit at 0.01M, H 4.5) với liều đơn 110 m /k thể t ọn Bảng 3.9 Nồng độ glucose huyết lô chuột trước sau tiêm STZ Nồng độ glucose huyết (mmol/l) Các lô chuột Chuột thườn ti m đệm Chuột thườn ti m STZ (110mg/kg) Chuột o h ti m đệm Chuột o h ti m STZ (110mg/kg) Trước tiêm Sau tiêm 72 6.18±0.21 6.57±0.25 6.15±0.26 7.09±0.17 7.40±0.23 8.02±0.14 P