Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn euphorbia hirta l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ LỚN EUPHORBIA HIRTA L Mã số: CS.2015.19.18 Chủ nhiệm đề tài: Ths Lê Thị Thu Hương Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ LỚN EUPHORBIA HIRTA L Mã số: CS.2015.19.18 Xác nhận quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài (Ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên) Lê Thị Thu Hương Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2016 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI Giảng viên: Ths Lê Thị Thu Hương – Chủ nhiệm đề tài Các sinh viên khoa Hóa ĐHSP TP.HCM gồm có: Ngơ Văn Kh Nguyễn Thị Mỹ Hạnh Nguyễn Như Ngọc Vũ Hải My CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÀI BÁO CÁO Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt A Acetic acid Axit axetic C Chloroform Clorofom EA Ethyl Acetate Etyl Axetat EtOH Ethanol Etanol M Methanol Metanol ED Petroleum Ether Ether dầu hỏa W Water Nước NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT Distortionless Enhancement Phổ DEPT chữ viết tắt by Polarization Transfer HMBC Heteronuclear Multiple Tương quan H-C qua 2, liên kết Bond correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Tương quan H-C qua liên kết ppm Part per million Một phần triệu s Singlet Mũi đơn d Doublet Mũi đôi dd Double of Doublet Mũi đôi đôi m Multiplet Mũi đa J Coupling constant Hằng số ghép spin TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bảng mỏng Rf Retention factor Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học cỏ sữa lớn Euphorbia hirta L.” Mã số: CS.2015.19.18 Chủ nhiệm đề tài: Lê Thị Thu Hương Tel: 0963817468 E-mail: huonghctn@yahoo.com Cơ quan chủ trì đề tài : Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM Cơ quan cá nhân phối hợp thực : Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngô Văn Khuê, Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Như Ngọc, Vũ Hải My Thời gian thực hiện: Tháng 04 năm 2015 đến tháng 04 năm 2016 Mục tiêu: Cô lập 5-7 hợp chất từ cỏ sữa lớn Công bố 01 báo Đào tạo 02 sinh viên Nội dung chính: Đã lập xác định cấu trúc hợp chất từ cỏ sữa lớn Kết đạt (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế-xã hội): Công bố 01 báo Tạp chí Khoa học tự nhiên, Trường Đại học sư phạm Hà Nội, tập 61, số 9, trang 48-52, năm 2016 04 sinh viên làm khóa luận tốt nghiệp Trang Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương SUMMARY Project Title: “Studies on chemical constituents of Euphorbia hirta L.” Code number: CS.2015.18.19 Coordinator: Le Thi Thu Huong Tel: 0963817468 E-mail: huonghctn@yahoo.com Implementing Institution : University of Pedagogy Ho Chi Minh City Cooperating Institution(s): • Viet Nam Academy of Science and Technology • Ngo Van Khue, Nguyen Thi My Hanh, Vu Hai My, Nguyen Nhu Ngoc Duration: from April, 2015 to April, 2016 Objectives: • Isolating approximately 5-7 compounds from Euphorbia hirta L • Publishing 01 report • Training 02 students working on undergraduate thesis Main contents: • Six compounds were isolated from Euphorbia hirta L Their structures were elucidated using one and two dimensional NMR spectroscopic techniques Results obtained: • Published one article on the Journal of Science, Natural Sciences, Hanoi National University of Education, volume 61, number 9, page 48-52, 2016 • Trained four students working on undergraduate thesis Trang Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương PHẦN I MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Từ xưa đến nay, việc sử dụng cỏ làm thuốc đóng vai trò quan trọng đời sống người Ngày với kinh tế phát triển mạnh mẽ, mục tiêu chăm sóc sức khỏe người ngày nâng cao, thế, dược tính hóa tính nhiều loại thảo mộc nghiên cứu khơng ngừng phát triển Trong đó, cỏ sữa lớn diện khắp nơi sử dụng Y học cổ truyền để chữa bệnh thông thường như: giải nhiệt, hạ sốt, an thần, kháng viêm, chữa lỵ, hen suyễn, viêm phế quản Ngoài ra, cỏ sữa lớn cịn chứa chất chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, lợi tiểu chống ung thư Cho đến việc nghiên cứu thành phần hóa học cỏ sữa lớn nước giới phổ biến, đặc biệt nước Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Malaysia,… Việt Nam có cơng trình nghiên cứu lồi Với lí trên, chúng tơi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học cỏ sữa lớn – Euphorbia hirta L.” nhằm mục đích tách chiết xác định cấu trúc số chất có cỏ sữa lớn thu hái tỉnh Đồng Nai Mục tiêu đề tài - Thu nhận mẫu cặn chiết từ cỏ sữa lớn tỉnh Đồng Nai - Tách chiết xác định cấu trúc số hợp chất thiên nhiên có cỏ sữa lớn Cách tiếp cận đề tài - Tổng quan tài liệu cỏ sữa lớn - Thu hái mẫu tỉnh Đồng Nai - Tiến hành ngâm chiết dung môi ether dầu hỏa, ethyl acetate, butanol để thu cặn chiết khác Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp ngâm chiết dung môi ether dầu hỏa, ethyl acetate, butanol để thu cặn chiết khác - Phân lập, tách chiết hợp chất phương pháp sắc kí cột sắc kí bảng mỏng Trang Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương - Sử dụng phương pháp vật lí đại phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc chất cô lập Phạm vi nghiên cứu - Cơ lập chất có cặn chiết ethyl acetate cỏ sữa lớn Nội dung nghiên cứu - Sử dụng phương pháp sắc kí cột, sắc kí bảng mỏng để lập 5-7 hợp chất có cỏ sữa lớn - Xác định cấu trúc hóa học chất tách phương pháp vật lí đại phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC Trang Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương PHẦN II NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Mô tả thực vật Cây cỏ sữa lớn hay gọi cỏ sữa lông, thiên thảo, mủ, vú sữa đất, có tên khoa học Euphobia hirta L thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae.[1,2,3] Cây có thân bị đứng, cao khoảng 15-40 cm, có nhiều rễ phụ đỏ tím, tồn có lơng vàng nhựa mủ trắng[2] Hình 1.1: Cây cỏ sữa lớn Lá màu xanh lẫn màu đỏ mọc đối, cuống ngắn, phiến hình mũi mác, dài 1-4 cm, rộng 1-1,5 cm, mép có cưa nhỏ Gốc cuống có kèm nhỏ, hình lơng cứng.[3] Nhiều cụm hoa màu trắng đỏ nhạt, hình chén nhỏ nách Quả lúc đầu đỏ sau xanh chuyển dần sang nâu, nhỏ, đường kính khoảng 1,5 mm, già nứt thành mảnh vỏ, có hạt nhỏ.[1,3] 1.2 Phân bố sinh thái Cây cỏ sữa lớn mọc hoang khắp nơi Việt Nam, chỗ đất có sỏi đá, bãi cỏ, đường đi, miền Bắc miền Nam Cây mọc Trung Quốc, Malaysia[26], Ấn Độ, Australia, châu Phi[23, 28], châu Mỹ 1.3 Tác dụng dược lí Nhiều nghiên cứu Euphorbia hirta L chứa nhiều chất trị rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy[6], loét dày, ợ nóng, nơn mửa[5], bệnh lỵ[33], bệnh cao huyết áp[28], chống ngứa, thông sữa, rối loạn kinh nguyệt, vô sinh bệnh hoa liễu[5], sử dụng điều trị rối loạn phế quản đường hô hấp bao gồm bệnh hen suyễn[6], viêm phế quản, sốt mùa hè[5, 13] viêm kết mạc.[14] Mủ thường sử dụng trị mụn cóc để ngăn chặn lây nhiễm mầm bệnh[26] Trang Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương Cỏ sữa lớn có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn[25], kháng nấm, lợi tiểu[5], giải lo âu[21], chống viêm chống ung thư[12, 25] Ngồi người ta cịn nghiên cứu tác dụng cỏ sữa lớn việc điều trị bệnh tiểu đường.[24] 1.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa Năm 2011, Abu Arra Basma, Zuraini Zakaria cộng sự[5] nghiên cứu khả chống oxi hóa từ phận khác cỏ sữa lớn để tìm kiếm nguồn chất chống oxy hóa an tồn tốn Từ mẫu lá, cành, hoa rễ người ta tìm hợp chất phenolic flavonoid có khả chống oxy hóa mạnh 1.3.2 Hoạt tính điều trị bệnh tiểu đường Năm 2014, Quy Trinh, Ly Le[24] có nghiên cứu hoạt tính sinh học số chất cỏ sữa lớn có tác dụng trị bệnh tiểu đường phương pháp gắn kết chất tìm cỏ sữa lớn với số protein liên quan tới bệnh tiểu đường loại Các chất bao gồm quercetrin, rutin, myricitrin, cyanidin 3,5-Odiglucoside, pelargonium 3,5-diglucose thuộc họ flovonoid α-amyrine, β-amyrine, taraxerol thuộc họ terpene Kết nghiên cứu cho thấy liên kết chất cỏ sữa lớn với protein có khả điều trị hiệu bệnh tiểu đường 1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn Năm 1995, K Vijaaya, S Ananthan cộng sự[18] nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn hợp chất chiết xuất từ Camellia sinensis L chiết xuất methanol cỏ sữa lớn chống lại bệnh lỵ - loại bệnh Shigella spp gây nên Các tác dụng kháng khuẩn dịch chiết methanol cỏ sữa lớn chứng minh phịng thí nghiệm cách sử dụng loài vi khuẩn Shigella Thực nghiệm cho thấy chiết xuất khơng gây độc tế bào có hoạt tính kháng khuẩn Năm 2013, A Annamalai, V.L.P Christina cộng sự[6] nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn cỏ sữa lớn việc tổng hợp hạt nano vàng không độc hại (Au NPs) cách sử dụng chất chiết từ cỏ sữa lớn Các Au NPs có khả chống lại chủng vi khuẩn Escherchia coli, Pseudomonas aeroginosa Klebsiella pneumonia Trang Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường 3.2 Lê Thị Thu Hương Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất EH3 Hợp chất EH3 (4 mg) chất màu trắng, dạng bột, có đặc điểm phổ: Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) (xem phụ lục 2.1), δ H ppm, J Hz: 6,81 (1H, m, H-2); 4,39 ( 1H, m, H-3); 3,71 (1H, dd, J = 7,0; 4,0, H-4); 4,02 (1H, m, H-5); 2,72 (1H, ddt, J = 18,0; 5,0; 2,0; H-6a); 2,22 (1H, ddt, J = 18,0; 5,5; 1,5; H-6b); 3,77 (3H, s, OCH ) Phổ 13C-NMR (CD OD, 125 MHz) (xem phụ lục 2.2) kết hợp với phổ DEPT-NMR (xem phụ lục 2.3), δ C ppm: 130,2 (C-1); 139,1 (C-2); 67,2 (C-3); 72,6 (C-4); 68,4 (C5); 31,5 (C-6); 52,4 (OCH ); 168,7 (C-1′) Phổ HSQC, HMBC, COSY (CD OD, phụ lục 2.4, 2.5, 2.6)  BIỆN LUẬN CẤU TRÚC Trên phổ 1H-NMR hợp chất EH3 có:  Ở vùng trường thấp: Có tín hiệu multiplet proton có δ H 6,81 ppm, quy kết cho proton nhóm =C-H khơng no (trong vịng cyclohexene)  Ở vùng trường trung bình: Có tín hiệu proton có δ H 4,39, 4,02 3,71 quy kết cho proton nhóm –CH-OH (δ H nằm vùng từ 3,5÷4,1 ppm) Có tín hiệu singlet có δ H 3,77 tín hiệu proton nhóm methoxy  Ở vùng trường cao: Có tín hiệu dạng doublet-doublet-triplet proton có δ H 2,72 2,22, quy kết cho proton nhóm –CH (H-6a H-6b) Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy EH3 có nguyên tử carbon gồm carbon loại CH , carbon loại CH , carbon loại CH-OH δ C (67,2; 68,4; 72,6), carbon loại -CH= (δ C 139,1), carbon tứ cấp δ C (130,2; 168,7), tín hiệu có δ C 168,7 đặc trưng cho carbon nhóm >C=O Carbon với δ C 31,5 cho tương quan HSQC với hai proton δ H 2,72 δ H 2,22, proton gắn carbon δ C 31,5 (C-6) Nhóm methoxy δ H 3,77 tương Trang 29 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương quan với carbon δ C 52,4, proton δ H (6,81, H-2) tương quan với carbon δ C 139,1 nên δ C C-2 Tương tự ta quy kết tín hiệu có δ C 67,2; 68,4; 72,6 carbon C-3, C-4 Trên phổ HMBC tương quan từ proton δ H 4,02 (H-5), δ H 2,72 (H-6a) δ H 2,22 (H-6b) đến carbon δ C 130,2, carbon C-1 Tương quan từ proton δ H 6,81 (H-2) δ H 3,77 (OCH ) đến carbon δ C 168,7 carbon C-1′ Trên phổ COSY cho thấy tương quan từ proton δ H 2,72 (H-6a) δ H 2,22 (H-6b) đến proton δ H 6,81 (H-2), δ H 4,39 (H-3), δ H 4,02 (H-5), nên hình dạng proton H-6 doublet-doublet-triplet Từ phân tích liệu phổ hợp chất EH3, kết hợp so sánh với liệu phổ acid shikimic[37] cho thấy có nhiều điểm tương đồng, khác EH3 có thêm nhóm methoxy, nên đề nghị hợp chất EH3 methyl shikimate COOCH3 HO OH OH Hình 3.2: Một số tương quan HMBC methyl shikimate Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR hợp chất EH3 hợp chất so sánh Vị trí δ H (ppm) (J=Hz) Acid shikimic Hợp chất EH3 (MeOD) (MeOD)[37] δC HMBC (ppm) ( H → C) 13 130,2 6,81 (1H, m) 139,1 Trang 30 δ C (ppm) 129,3 ′, 4, 137,5 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương 4,39 ( 1H, m) 67,2 3,71 (1H, dd, 7,0; 4,0) 72,6 2, 5, 71,3 4,02 (1H, m) 68,4 1, 3, 67,1 6a 2,72 (1H, ddt, 18,0; 5,0; 2,0) 31,5 1, 2, 4, 30,3 6b 2,22 (1H, ddt, 18,0; 5,5; 1,5) 31,5 1, 2, 4, 30,3 3,77 (3H, s) 52,4 1′ - OCH 1′ (C=O) 66,0 168,7 168,7 3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất EH4 Hợp chất EH4 (63 mg) thu từ phân đoạn EA.3.1 có đặc điểm sau: chất bột vơ định hình, khơng màu, R f = 0,31 với hệ dung môi giải ly C:M:W (5:1:0,1) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d , phụ lục 3.1) Phổ 13C-NMR, DEPT (125 MHz, DMSO-d , phụ lục 3.2, 3.3) Phổ HSQC, HMBC, COSY (xem phụ lục 3.4, 3.5, 3.6)  Biện luận cấu trúc Trên phổ 1H-NMR có tín hiệu proton anomer [δ H (ppm); J (Hz); 4,09 (1H; d; 7,5; H-1′)] với proton nằm vùng có δ 2,95-3,63 ppm Kết hợp với phổ 13C-NMR có tín hiệu δ C (100,0; 77,2; 77,0; 73,3; 70,1; 61,1) cho thấy diện đường β-D-glucopyranoside Ngoài ra, vùng trường thấp xuất tín hiệu nhóm (E)-olefin [δ H 5,94 (1H; d; 15,5) 5,64 (1H; dd; 15,5 6,5)], nhóm methine [δ H 5,76 (1H; m)] Ở vùng trường trung bình có nhóm oxymethine δ H 4,42 (1H; m; H-9) Dựa vào phổ HSQC xác định độ chuyển dịch hóa học carbon C-9 72,1 ppm Ở vùng trường cao xuất tín hiệu nhóm methyl, tín hiệu [δ H 0,93 (3H; s; H-11) 0,91 (3H; s; H-12)] tín hiệu nhóm methyl nối với carbon tứ cấp, nhóm methyl gắn với nhóm vinylic [δ H 1,82 (3H; d; 1,0; H-13)] Trang 31 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương nhóm methyl nối với carbon bậc ba [δ H 1,18 (3H; d; 6,5; H-10)] Ngồi cịn có xuất tín hiệu [δ H 2,54 (1H; d; 17,0; H-2); 2,05 (1H; d; 16,5; H-2)] cho thấy diện nhóm methylene Phổ 13 C-NMR kết hợp với DEPT cho thấy hợp phần aglycone EH4 có 13 nguyên tử carbon, có carbon nhóm carbonyl (δ C 197,4), carbon alkenic (δ C 163,8; 131,7; 131,5; 125,6), carbon nhóm methyl (δ C 24,1; 23,1; 22,1; 18,7), carbon nhóm oxymethylene (δ C 72,1), carbon nhóm methylen (δ C 49,4), carbon tứ cấp (δ C 78,0; 40,9) Độ chuyển dịch hoá học carbon 197,4; 163,8; 125,6 chứng tỏ có mặt nhóm carbonyl liên hợp với nối đơi C=C Như EH4 có chứa khung megastigmane Mặt khác proton anomer 4,09 ppm (H-1′) có tương quan HMBC với carbon 72,1 ppm (C-9), điều chứng tỏ phần đường liên kết với carbon số Từ kiện nêu trên, số liệu phổ 13C-NMR EH4 so sánh với giá trị tương ứng công bố cho hợp chất corchoionosid C[35] Sự phù hợp số liệu phổ vị trí tương ứng hai hợp chất cho phép xác định EH4 corchoionosid C có công thức cấu tạo sau H H HO O H OH O 3' OH 1' 10 H H 5' OH H O (7E)-6,9-Dihydroxymegastigma-4,7-dien-3-on 9-O-β-D-glucopyranoside Hình 3.3: Một số tương quan HMBC EH4 Trang 32 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR hợp chất EH4 hợp chất so sánh Corchoionosid C δ H (ppm) (J = Hz) δ C (ppm) HMBC (1H→13C) 40,9 2,54 (d; 17,0) 2,05 (d; 16,5) (DMSO-d )[35] EH4 (DMSO-d ) Vị trí 40,9 49,4 1, 3, 4, 6, 11, 12 197,4 5,76 (m) δ C (ppm) 125,6 49,3 197,2 2, 6, 13 126,5 163,8 163,6 78,0 77,9 5,94 (d; 15,5) 131,7 5, 6, 131,6 5,64 (dd; 15,5; 6,5) 131,5 6, 9, 10 131,4 4,42 (m) 72,1 1′, 7, 8, 10 71,9 10 1,18 (d; 6,5) 22,1 8, 22,0 11a 0,93 (s) 23,1 1, 2, 3, 6, 12 23,1 12a 0,91 (s) 24,1 1, 2, 3, 6, 11 24,1 13 1,82 (d; 1,0) 18,7 4, 5, 18,6 1′ 4,09 (d; 7,5) 100,0 2′, 99,9 2′ 2,95 (m) 73,3 3′, 4′ 73,3 3′ 3,03 (m) 77,0 2′, 4′ 77,0 4′ 3,03 (m) 70,1 2, 3′ 70,0 5′ 2,95 (m) 77,2 1′, 3′, 4′ 77,1 61,1 4′ 61,0 6′ 3,63 (m) 3,42 (m) a: Tín hiệu trao đổi lẫn 3.4 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất EH8 Hợp chất EH8 (5 mg) chất dạng nhựa kết dính, khơng màu Trang 33 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương Dữ liệu phổ 1H-NMR (DMSO-d , 500 MHz) (xem phụ lục 4.1), phổ 13C-NMR (DMSO-d , 125 MHz) (xem phụ lục 4.2) Phổ HSQC, HMBC (DMSO-d , phụ lục 4.3, 4.4)  Biện luận cấu trúc: Trên phổ 1H-NMR có tín hiệu proton anomer δ H [4,15 (1H; d; 8,0; H-1’)] với proton nằm vùng có δ H 2,9- 3,65 Kết hợp với phổ 13C-NMR có tín hiệu carbon δ C (61; 70,2; 73,5; 76,7; 76,9; 102,3) cho thấy diện đường β-D-glucopyranoside Dựa vào phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp phần aglycone EH8 có 13 nguyên tử carbon gồm carbon loại tứ cấp, carbon loại CH, carbon loại CH carbon loại CH Trong có tín hiệu carbon tứ cấp δ C 198,1 (C3) đặc trưng cho nhóm carbonyl, hai carbon δ C 124,1 (C-4), 165,4 (C-5) đặc trưng cho carbon nhóm vinyl Phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất EH8 gần giống với phổ hợp chất EH4, khác với EH4 khơng có nối đơi olefin CH=CH Từ phân tích cho thấy số liệu phổ chất EH8 giống với chất Blumenol C glucoside công bố[10] Sự phù hợp số liệu phổ vị trí tương ứng hai hợp chất cho phép xác định cấu trúc hóa học EH8 Blumenol C glucoside, có cơng thức phân tử C 19 H 32 O có cơng thức cấu tạo sau: H H HO O H OH O 3' OH 1' 10 OH H 5' OH H O Hình 3.4: Một số tương quan HMBC Blumenol C glucoside Trang 34 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR hợp chất EH8 hợp chất so sánh Blumenol C glucoside (DMSO-d )[10] EH8 (DMSO-d ) Vị trí δ H (ppm) (J = Hz) 2,37 (d; 17,0) 1,87 (d; 17,0) 47,1 5,71 (s) 124,1 1, 3, 4, 6, 12 1,70 (m) 1,53 (m) 50,4 47,2 198,4 6, 13 165,4 1,87 (m) δ C (ppm) 36,2 198,1 HMBC ( H→13C) 36,1 δ C (ppm) 124,4 166,2 1, 4, 5, 7, 50,6 24,8 24,9 35,9 1,53 (m) 35,5 3,72 (m) 74,7 1′ 75,1 10 1,15 (d; 6,0) 21,6 8, 21,8 11 1,00 (s) 26,7 1, 6, 12 26,9 12 0,94 (s) 28,7 1, 6, 11 28,7 13 1,96 (s) 24,0 4, 5, 24,3 1′ 4,15 (d; 8,0) 102,3 102,7 2′ 3′ 4′ 5′ 2,91 (m) 3,10 (m) 3,06 (m) 3,03 (m) 73.5 76.7 70.2 76.9 73,9 77,0 70,4 77,0 61,0 61,4 3,65 (br d; 13,0) 6′ 3,41 (dd; 12,5; 5,5) 3.5 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất EH5 Hợp chất EH5 (4 mg) thu từ phân đoạn EA.1 có đặc điểm sau: chất rắn, màu trắng, R f = 0,28 với hệ dung môi giải ly C:M (8:2) Phổ 1H-NMR (500 MHz, acetone-d , phụ lục 5.1), δ H ppm: 7,14 (2H, s) Trang 35 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương Phổ 13C-NMR (125 MHz, acetone-d , phụ lục 5.2), δ C ppm: 138,6 (C-1); 110,1 (C-2 C-6); 146,0 (C-3 C-5); 122,1 (C-4); 167,6 (COOH)  Biện luận cấu trúc Trên phổ 1H-NMR có tín hiệu vùng thơm 7,14 ppm (2H, s) hai proton tương đương vòng benzene Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy EH5 có tín hiệu: gồm tín hiệu 167,6 ppm đặc trưng cho carbon nhóm COOH, carbon loại CH (δ C 110,1), carbon tứ cấp δ C (146,0; 138,6; 122,1), có tín hiệu cao gấp đơi so với tín hiệu cịn lại Như qua phân tích phổ NMR nhận thấy EH5 hợp chất thơm có nhóm OH, nhóm COOH, đề nghị EH5 gallic acid có cơng thức cấu tạo sau: COOH HO OH OH Gallic acid Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR hợp chất EH5 hợp chất so sánh Vị trí Hợp chất EH5 (Acetone-d ) δ H (ppm) Gallic acid (DMSO-d )[39] δ C (ppm) δ C (ppm) 138,6 138,0 110,1 108,7 146,0 145,4 122,1 120,4 146,0 145,4 110,1 108,7 167,6 167,5 COOH 7,14 (s) 7,14 (s) 3.6 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất EH9 Hợp chất EH9 (30 mg), thu từ phân đoạn EA.3.2 có đặc điểm sau: chất bột vơ định hình, khơng màu, sắc kí bảng mỏng với hệ dung mơi giải ly EA:M:W Trang 36 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương (15:1:1) hình thuốc thử H SO 20% cho vết màu đen hơ nóng có R f = 0,27 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD) 13C-NMR (125 MHz, MeOD) (xem phụ lục 6.1, 6.2) Phổ DEPT, HSQC, HMBC, COSY (xem phụ lục 6.3, 6.4, 6.5, 6.6) Khối phổ HR-ESI-MS (xem phụ lục 6.7)  Biện luận cấu trúc Hợp chất EH9 cô lập dạng chất bột vơ định hình, khơng màu, khối phổ HR-ESI-MS (chế độ dương, [M+Na]+) cho mũi ion giả phân tử m/z 298,09228 tương ứng với công thức phân tử C 11 H 17 NO Phổ 1H-NMR cho thấy có 12 tín hiệu proton, bao gồm: nhóm olefinic [δ H (ppm); J (Hz) 6,19 (1H; d; 1,5) 6,13 (1H; d; 1,0)], hai nhóm oxymethylene [δ H 4,04 (1H; dd; 10,5; 4,0); 3,67 (1H; dd; 10,8; 7,5); 3,90 (1H; br d; 11,5); 3,70 (1H; m)], nhóm oxymethine [δ H 4,47 (1H; m); 4,36 (1H; d; 8,0); 3,39 (1H; dd; 9,5; 8,5); 3,33 (2H; m); 3,24 (1H; t; 8,0)] Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT cho thấy EH9 có 11 carbon, có carbon alkenic (δ C 132,9; 125,1), carbon nhóm nitrile (δ C 118,1), carbon nhóm oxymethylene (δ C 73,1; 62,6), với carbon nhóm oxymethine (δ C 104,7; 78,0; 77,8; 75,0; 72,0; 71,5) Trên phổ HMBC, tín hiệu proton olefinic 6,19 ppm (H-5a) 6,13 ppm (H-5b) có tương quan với carbon δ C 118,1 (C-1); 125,1 (C-2); 72,0 (C-3) Tín hiệu proton nhóm oxymethine 4,47 ppm (H-3) tương quan với carbon δ C 118,1 (C-1); 125,1 (C-2); 73,1 (C-4); 132,9 (C-5) Đồng thời tín hiệu proton nhóm oxymethylene 4,04ppm (H-4a) 3,67 ppm (H-4b) có tương quan với carbon δ C 104,7 (C-1′); 125,1 (C-2); 72,0 (C-3) Từ giúp ta xác định phần aglycon EH9 3,4-dihydroxy-2-methylenebutannitrile Phổ 1H-NMR 13C-NMR, kết hợp với phổ (COSY, HSQC, HMBC) EH9 có phân tử đường β-D-glucopyranoyl với tín hiệu carbon anomer δ C 104,7 δ H 4,36 (1H; d; 8,0) Mặt khác proton anomer 4,36 ppm (H-1′) có tương quan HMBC với carbon 73,1 ppm (C-4), điều chứng tỏ phần đường liên kết với carbon số Từ việc phân tích phổ trên, cho phép xác định EH9 3,4-dihydroxyTrang 37 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương 2-methylenebutannitrile 4-O-β-D-glucopiranoside có cơng thức cấu tạo sau Đây hợp chất tự nhiên[40] H OH 5' HO HO H O OH 1' 3' H H O OH H N CH2 3,4-Dihydroxy-2-methylenebutannitrile 4-O-β-D-glucopiranoside Hình 3.6: Cơng thức cấu tạo hợp chất EH9 Bảng 3.6: Số liệu phổ NMR hợp chất EH9 Vị trí EH9 (MeOD) δ H (ppm) (J = Hz) δ C (ppm) 118,1 125,1 HMBC ( 1H→13C) 4,47 (m) 72,0 1, 2, 4, 4a 4,04 (dd; 10,5; 4,0) 73,1 1′, 2, 4b 3,67 (dd; 10,8; 7,5) 5a 6,19 (d; 1,5) 132,9 1, 2, 5b 6,13 (d; 1,0) 1′ 4,36 (d; 8,0) 104,7 2′, 3′, 2′ 3,24 (t; 8,0) 75,0 1′, 3′, 4′ 3′ 3,39 (dd; 9,5; 8,5) 77,8 2′, 5′ 4′ 3,33 (m) 71,5 2′, 3′, 5′, 6′ 5′ 3,33 (m) 78 3′, 4′, 6′ 6′a 3,90 (br d; 11,5) 62,6 4′, 5′ 6′b 3,70 (m) Trang 38 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương CHƯƠNG KẾT LUẬN 4.1 KẾT LUẬN Thông qua việc thực đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học cỏ sữa lớn”, cô lập xác định cấu trúc hợp chất  Quercitrin (EH2)  Methyl shikimate (EH3)  Corchoionosid C (EH4)  Gallic acid (EH5)  Blumenol C glucosid (EH8)  3,4-Dihydroxy-2-methylenebutannitrile 4-O-β-D-glucopiranoside (EH9) Trong hợp chất EH9 hợp chất lần cô lập từ cỏ sữa lớn, hợp chất lại cô lập 4.2 ĐỀ XUẤT Do hạn chế thời gian nên dừng lại việc khảo sát cấu trúc hóa học số hợp chất cao ethyl acetate cỏ sữa lớn – Euphorbia hirta L Các phân đoạn khác Euphorbia hirta L như: cao ether dầu hỏa, cao butanol chưa nghiên cứu Do thời gian tới tiến hành khảo sát phân đoạn cịn lại để góp phần làm rõ thành phần hóa học cỏ sữa lớn Euphorbia hirta L Trang 39 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, 283 - 284 [2] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Tập 2, NXB Trẻ, 291 [3] Đỗ Tất Lợi (2009), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 200 [4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐHQGTPHCM TÀI LIỆU TIẾNG ANH [5] Abu Arra Basma, Zuraini Zakaria, Lacimanan Yoga Latha, Sreenivasan Sasidharan (2011), “Antioxidant activity and phytochemical screening of the methanol extracts of Euphorbia hirta L.”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 386-390 [6] A Annamalai, V.L.P Christina, D Sudha, M Kalpana, P.T.V Lakshmi (2013), “Green synthesis, characterization and antimicrobial activity of Au NPs using Euphorbia hirta L leaf extract”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 108, 60-65 [7] Atallah A M., Nicolas H J (1972), “Triterpenoids and steroids of Euphorbia pilulifera”, Phytochemistry, 11(5), 1860-1868 [8] Baslas R K., Agaxai R (1980), “Isolation and characterization of different constituents of Euphorbia hirta Linn”, Current Science, 49(8), 311-312 [9] Blanc P (1972), “Galactogenic properties of plants of the African flora: Sersalisia djalionensis and E hirta”, Annales de Biologic Clinique (Paris), 21, 829 [10] Chen Bin, Li Bo-Gang, Zhang Guo-Lin (2002), “Glycosides from Erigeron breviscapus”, Acta Botanica Sinica, 44(3), 344-348 [11] Chen L (1991), “Polyphenols from leaves of Euphorbia hirta L.”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 16(1), 38-39 [12] Consolacion Y Ragasa, Kimberly B Cornelio (2013), “Triterpenes from Euphorbia hirta and their cytotoxicity”, Chinese Journal of Natural Medicines, 11(5), 0528−0533 [13] C Panneerselvam, K Murugan, K Kovendan, P Mahesh Kumar, J Subramaniam (2013), “Mosquito larvicidal and pupicidal activity of Euphorbia hirta Linn (Family: Trang 40 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương Euphorbiaceae) and Bacillus sphaericus against Anopheles stephensi Liston”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 102-109 [14] Daphne Sue Yen Loh, Hui Meng Er, Yu Sui Chen (2009), “Mutagenic and antimutagenic activities of aqueous and methanol extracts of Euphorbia hirta”, Journal of Ethnopharmacology, 126, 406-414 [15] Elnagar L., Beeal J L., Parks L M., Salman K N., Patil P., Shawarting A E (1978), “A note on the isolation and identification of two pharmacologically active constituents of Euphorbia pilulifera”, Lloydia, 41(1), 73-75 [16] Gnecco S (1996), “Distribution pattern of n-alkanes in Chilean species from the Euphorbiaceae family”, Boletin de la Sociedad Chilena de Quimica, 41(3), 229 [17] Gupta D R., Gard S K (1966), “A chemical examination of Euphorbia hirta”, Bulletin of the Chemical Society, (Japan), 39, 2532-2534 [18] K.Vijaaya, S Ananthan, R Nalini (1995), “Antibacterial effect of theaflavin, polyphenon 60 (Camellia sinensis) and Euphorrbia hirta on Shigella spp.- a cell culture study”, J Ethnopharmacol, 49(2), 115-8 [19] Mariano Martinez Vazquez, Teresa O Ramirez Apan, Maria Eugenia Lazcano, Robert Bye (1999), “Anti-inflammatory active compounds from the n-hexane extract of Euphorbia hirta”, Journal of the Mexican Chemical Society, 43, 3-4, 103-105 [20] M C Lanhers, J Fleurentin, P Cabalion, P Dorfman, J M Pelt Dorfman P, Mortier F Analgesic (1991), “Antipyretic and anti-inflammatory properties of Euphorbia hirta”, Planta Medica, 57(3), 225-231 [21] Mei-Fen Shih, Yih-Dih Cheng, Chia-Rui Shen, Jong-Yuh Cherng (2010), “A molecular pharmacology study into the anti-inflammatory actions of Euphorbia hirta L on the LPS-induced RAW 264.7 cells through selective iNOS protein inhibition”, J Nat Med.,64, 330-335 [22] Nont Thitilertdecha, Aphiwat Teerawutgulrag, Jeremy D Kilburn, Nuansri Rakariyatham (2010), “Identification of major phenolic compounds from Nephelium lappaceum L and their antioxidant activities”, Molecules, 15, 1453–1465 [23] Patricia B Johnson, Ezzeldin M Abdurahman, Emmanuel A Tiam (1999), “Euphorbia hirta leaf extracts increase urine output and electrolytes in rats”, Journal of Ethnopharmacology, 65, 63–69 Trang 41 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương [24] Quy Trinh, Ly Le (2014), “An investigation of antidiabetic activities of bioactive compounds in Euphorbia hirta Linn using molecular docking and pharmacophore”, Med Chem Res, 23, 2033-2045 [25] Shanmugapriya Perumal, Roziahanim Mahmud (2013), “Chemical analysis, inhibition of biofilm formation and biofilm eradication potential of Euphorbia hirta L against clinical isolates and standard strains”, Perumal and Mahmud BMC Complementary and Alternative Medicine, 13, 346 [26] Shanmugapriya Perumal, Roziahanim mahmud, Suthagar Pillai, Wei Cai Lee, Surasn Ramanathan (2012), “Antimicrobial activity and cytotoxicity evaluation of Euphorbia hirta (L.) extracts from Malaysia”, APCBEE Procedia, 2, 80 – 85 [27] Shashi B Mahato, Niranjan P Sahu, Amar N Ganguly, Ryoji Kasai, Osamu Tanaka (1980), “Steroidal alkaloids from Solanum khasianum: Application of 13 C- NMR spectroscopy to their structural elucidation”, Phytochemistry, 19, 2017-2020 [28] Sheikh Fayaz Ahmad, Beenish Khan, Sarang Bani (2013), “Immunosuppressive effects of Euphorbia hirta in experimental animals”, Inflammopharmacol, 21, 161– 168 [29] Shijun Yan, Dawei Ye, Yi Wang, Yan Zhao, Jianxin Pu, Xue Du, Lei Luo and Yong Zhao (2011), “Ent-Kaurane diterpenoids from Euphorbia hirta”, Records of Natural Products, 5(4), 247-251 [30] Sofowora A (1984), Medical Plants and Traditional Medicine in Africa, Ibadan, 114-213 [31] Tona L., Cimanga R.K., Mesia K., Musuamba C.T., De Bryune T., Apers S., Hernans N., Van Miert S., Pieters L., Totte J and Vlietinck A.J (2004), “In vitro antiplasmodial activity of extracts and fractions from seven medicinal plants used in the Democratic Republic of Congo”, Journal of Ethnopharmacology, 93, 27-32 [32] Uppuluri V Mallavadhani and Kilambi Narasimhan (2009), “Two novel butanol rhamnosides from Euphorbia hirta”, Natural Product Research, 23(7), 644-651 [33] Wu Yi, Qu Wei, Geng Di, Liang Jing-Yu, Luo Yang-Li (2012), “Phenols and flavonoids from the aerial part of Euphorbia hirta”, Chinese Journal of Natural Medicines, 10(1), 0040–0042 Trang 42 Đề tài khoa học công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương [34] Yuya Nomoto, Sachiko Sugimoto, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki Otsuka (2013), “Hirtionosides A–C, gallates of megastigmane glucosides, 3-hydroxyoctanoic acid glucosides and a phenylpropanoid glucoside from the whole plants of Euphorbia hirta”, J Nat Med., 67, 350–358 [35] Ihsan Calis, Ayse Kuruuzum-Uz, Piergiorgio A Lorenzetto, Peter Ruedi (2002), “(6S)-Hydroxy-3-oxo--ionol glucosides from Capparis spinosa fruits”, Phytochemistry, 59, 451-457 [36] Kadiyala Gopi, K Anbarasu, Kadali Renu, S Jayanthi, B.S Vishwanath, Gurunathan Jayaraman (2016), “Quercetin-3-O-rhamnoside from Euphorbia hirta protects against snake Venom induced toxicity” Biochimica et Biophysica Acta, 1860, 1528–1540 [37] Mingchuan Liu, Shengjie Yang, Linhong Jin, Deyu Hu, Zhibing Wu and Song Yang (2012), “Chemical constituents of the ethyl acetate extract of Belamcanda chinensis (L.) DC roots and their antitumor activities”, Molecules, 17, 6156-6169 [38] Nguyen Manh Cuong, Nguyen Manh Tuan (2006), “The chemical institution of Eurya ciliata leaves”, Journal of Chemistry, 44(1), 124-127 [39] Sravan Kumar Reddy Theepireddy, Ramakrishna Chinthala (2015) “The isolation, characterization and quantification of gallic acid from the fruit extract of Terminalia chebula”, IJMPR, 3(2): 983–988 [40] It was checked by Scifinder program at the University of Utah the USA in July 20th 2016 Trang 43 ... cao ethanol cỏ sữa l? ??n. [15] Năm 1991, Chen L phương pháp hóa l? ? quang phổ, phân l? ??p hợp chất từ cỏ sữa l? ??n acid gallic (14), acid 3,4-di-O-galloylquinic (17), 2,4,6-tri-O-galloyl-D-glucose (18),... TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CỎ SỮA L? ? L? ??N EUPHORBIA HIRTA L Mã số:... khác Euphorbia hirta L như: cao ether dầu hỏa, cao butanol chưa nghiên cứu Do thời gian tới tiến hành khảo sát phân đoạn cịn l? ??i để góp phần l? ?m rõ thành phần hóa học cỏ sữa l? ??n Euphorbia hirta L