Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ ngọt = (STEVIA REBAUDIANA (BERTONI) HEMSLEY )

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khoá luận tốt nghiệp TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA HỐ HỌC *************** Nguyễn cơng NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley) KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chun ngành: Hố Hữu Cơ Nguyễn Duy Cơng K31C- Khoa Hố học Lời cảm ơn Trước hết, em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy giáo - TS Nguyễn Văn Bằng- Khoa hoá học- Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình bảo, giúp đỡ em suốt trình thực hồn thiện khố luận tốt nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn TS Phan Văn Kiệm – Viện hoá học Hợp chất thiên nhiên - Viện khoa học công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ em q trình thực hồn thiện khoá luận Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy giáo Khoa Hoá họcTrường Đại học Sư phạm Hà Nội cán Viện hoá học Hợp chất thiên nhiên - Viện khoa học công nghệ Việt Nam ủng hộ tận tình bảo, tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khố luận tốt nghiệp Trong q trình thực khố luận tốt nghiệp dù cố gắng em không tránh khỏi số sai sót Vì vậy, em kính mong nhận góp ý bảo thầy, bạn sinh viên quan tâm Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2009 Sinh viên Nguyễn Duy Công LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết khố luận trung thực Các kết khơng trùng với kết công bố Sinh viên Nguyễn Duy Công Mục lục Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục hình vẽ bảng biểu Trang Mở đầu Chương 1: Tổng quan 1.1 Đặc điểm, tính vị cơng dụng cỏ 1.1.1 Thực vật học 1.1.2 Phân bố, sinh thái 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Tác dụng dược lý 1.1.5 Tính vị, cơng 1.1.6 Công dụng 1.2 Thành phần hố học hoạt tính sinh học cỏ 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Thành phần hố học hoạt tính sinh học 1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 11 1.3.1 Chọn dung môi chiết 12 1.3.2 Quá trình chiết 14 1.4 Các phương pháp sắc ký phân lập hợp chất hữu 15 1.4.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc kí 15 1.4.2 Cơ sở phương pháp sắc kí 15 1.4.3 Phân loại phương pháp sắc kí 16 1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc hợp chất hữu 18 1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR) 18 1.5.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS) 19 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) 19 Chương 2: đối tượng phương pháp nghiên cứu 23 2.1 Phương pháp phân lập hợp chất 23 2.1.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 23 2.1.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 23 2.1.3 Sắc ký cột (CC) 23 2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất 23 2.2.1 Điểm nóng chảy (MP) 23 2.2.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) 24 2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 24 2.2.4 Độ quay cực []D 24 2.3 Dụng cụ thiết bị 24 2.3.1 Dụng cụ thiết bị tách chiết 24 2.3.2 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc 25 2.4 Hoá chất 25 2.5 Chiết phân đoạn phân lập hợp chất 25 Chương 3: Kết thảo luận 27 3.1 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất 27 3.1.1 Hợp chất 1: Stevioside 27 3.1.2 Hợp chất 2: -Sitostorol 28 3.2 Xác định cấu trúc hoá học hợp chất 28 3.2.1 Hợp chất 1: Stevioside 28 3.2.2 Hợp chất 2: -Sitostorol 38 Kết luận 43 Tài liệu tham khảo 45 Danh mục chữ viết tắt []D Độ quay cực Specific Optical Rotation Phổ cộng hưởng từ hạt 13 C NMR H NMR 1 H- H COSY 2D-NMR nhân cacbon 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 1 H- H Chemical Shift Correlation Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR CC Sắc ký cột Column Chromatography DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer EI-MS FAB-MS Phổ khối lượng va chạm electron Electron Impact Mass Spectrometry Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao HR-FAB-MS High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Me Nhóm metyl MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography Danh mục hình vẽ bảng biểu Trang Hình 1.1: Cây cỏ hoa cỏ Hình 1.2.2.1: Một số hợp chất khung kauran ditecpen phân lập từ cỏ Hình 1.2.2.2: Một số hợp chất khung labdane ditecpen phân lập từ cỏ Hình 2.5: Sơ đồ chiết phân đoạn tinh chế hợp chất từ cỏ 26 28 Hình 3.2.1.2: Phổ H-NMR dãn rộng hợp chất 1 29 Hình 3.2.1.3: Cấu trúc hóa học hợp chất 29 Hình 3.2.1.1: Phổ H-NMR hợp chất 13 30 Hình 3.2.1.5: Phổ C-NMR phổ DEPT hợp chất 13 31 Hình 3.2.1.6: Phổ HSQC hợp chất 35 Hình 3.2.1.7: Phổ HMBC hợp chất 36 Hình 3.2.1.8: Các tương tác HMBC hợp chất 37 Hình 3.2.1.9: Phổ khối lượng ESI-MS hợp chất 38 Hình 3.2.2.1: Cấu trúc hố học 39 Hình 3.2.2.2: Phổ 1H-NMR 39 Hình 3.2.1.4: Phổ C-NMR hợp chất Hình 3.2.2.3: Phổ 13 C-NMR 40 Bảng 1: Kết phổ NMR hợp chất 32 Bảng 2: Kết phổ NMR hợp chất 40 Bảng 3: Hai hợp chất phân lập từ cỏ 43 Mở đầu Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ ẩm cao 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15 đến 27 C Đó điều kiện thích hợp cho thực vật phát triển Do hệ thực vật Việt Nam vô phong phú, đa dạng với khoảng 12000 lồi, có tới 4000 lồi nhân dân ta dùng làm thảo dược [7] Điều thực có ý nghĩa to lớn cho phát triển ngành y tế, ngành hoá học số ngành khác Hệ thực vật phong phú coi tiền đề cho phát triển ngành hóa học hợp chất thiên nhiên nước ta Từ ngàn xưa, ông cha ta sử dụng nhiều phương thuốc dân gian từ cỏ để chữa bệnh, bồi bổ thể hay làm hương liệu, phẩm màu Tía tô để giải cảm, Nhân sâm để tăng cường sức đề kháng, Sả để tạo mùi thơm, củ Nâu để nhuộm màu Các phương thuốc y học cổ truyền thể mặt mạnh điều trị bệnh độc tính tác dụng phụ Do có ưu điểm nên ngày người ngày quan tâm đến hợp chất có hoạt tính sinh học cao thực vật động vật Về lâu dài phát triển dược phẩm hợp chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò quan trọng, khởi đầu cho việc tổng hợp nên loại thuốc có tác dụng tốt Theo tài liệu [28] công bố có khoảng 60% - 70% loại thuốc chữa bệnh lưu hành giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên Cây cỏ biết đến loại có hoạt tính sinh học cao, chứa nhiều thành phần hố học có nhiều tác dụng dược lý Tác dụng quan trọng cỏ chữa bệnh đái tháo đường, bệnh béo phì, cao huyết áp Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hố học tác dụng dược lý H×nh 3.2.1.6: Phổ HSQC hợp chất Hình 3.2.1.7: Phổ HMBC cđa hỵp chÊt Tương tác HMBC từ proton anome H-1’ (5,25) sang cacbon cacbonyl C-1’ (175,70) khẳng định vị trí liên kết đơn vị đường glucose thứ cacbon C-19 Đơn vị đường glucose thứ hai xác định liên kết với cacbon C-13 tín hiệu tương tác HMBC từ proton H-1” (4,45) sang cacbon C-19 (84,72) Tín hiệu tương tác xa H-C từ proton H-1’’’ (4,36) sang cacbon C-2” (82,59) nhận phổ HMBC cho phép xác định vị trí liên kết đơn vị đường thứ ba vào cacbon C-2” đơn vị đường thứ hai OH HO HO HO O O O OH O OH HO CH3 CH2 OH HO HO O OH3C O OH Hình 3.2.1.8: Các tương tác HMBC hợp chất Từ tất kiện phổ trên, với phù hợp hoàn toàn số liệu NMR so với số liệu công bố hợp chất stevioside [1] + số liệu phổ khối lượng ESI-MS m/z 827,2 [M +Na] tương ứng với công thức phân tử C38H60O18 cho phép xác định xác hợp chất stevioside, thành phần hóa học cỏ Hình 3.2.1.9: Phổ khối lượng ESI-MS hợp chất 3.2.2 Hợp chất 2: -Sitosterol Hợp chất phân lập dạng tinh thể hình kim màu trắng Phổ NMR có dạng phổ chung hợp chất sterol có nối đơi nhóm hydroxyl Phổ H-NMR xuất tín hiệu nhóm metyl có hai nhóm metyl bậc ba 0,68 (3H, s), 1,01 (3H, s), tín hiệu doublet 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,83 (3H, d, J = 7,3 Hz), 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz), tín hiệu triplet 0,84 (3H, t, J = 7,5 Hz) Tín hiệu nhóm oximetin 3,54 (tt, J = 5,1, 11,7 Hz) nối đôi vị trí 5,37 (br d, J = 5,1 Hz) 26 22 18 24 20 27 17 28 19 HO Hình 3.2.2.1: Cấu trúc hố học Hỡnh 3.2.2.2: Phổ 1H-NMR 29 13 Hình 3.2.2.3: Phổ C-NMR Bảng 2: Kết phổ NMR hợp chất C C [2] C (125MHz) 37,27 37,67 31,64 32,05 71,77 72,19 42,29 42,70 140,76 141,17 121,69 122,50 31,92 32,32 H (500MHz) 3,54 (tt, J = 5,1, 11,7 Hz) 5,37 (br d, J = 5,1 Hz) a 31,92 32,32 50,15 50,55 10 36,51 36,91 11 21,10 21,49 12 39,80 40,19 13 42,33 42,73 14 56,78 57,18 15 24,31 24,71 16 28,25 28,65 17 56,08 56,48 18 11,89 12,26 0,68 (3H, s) 19 19,39 19,79 1,01 (3H, s) 20 36,15 36,55 21 18,80 19,18 22 33,96 34,36 23 26,11 26,51 24 45,85 46,25 25 29,18 29,57 26 19,82 20,24 0,83 (3H, d, J = 7,3 Hz) 27 19,05 19,44 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz) 28 23,08 23,48 29 11,99 12,39 Đo CDCl3, b125MHz, c500MHz 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz) 0,84 (3H, t, J = 7,5 Hz) Phổ 13 C-NMR cho thấy có 29 cabon, xuất 01 cacbon oximetin 01 liên kết đôi khẳng định tín hiệu cộng hưởng 72,19 (C-3) 141,17 (C-5)/122,50 (C-6) Như vậy, hợp chất steroit có nối đơi nhóm hydroxyl So sánh kiện phổ NMR với hợp chất -sitosterol [2] cho thấy trùng khớp tất vị trí tương ứng Từ kiện nêu trên, hợp chất nhận dạng -sitosterol, hợp chất sterol phổ biến thực vật Kết luận Trong thời gian làm khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu thành phần hoá học cỏ (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley )” Tôi tiến hành nghiên cứu thành phần hố học có cỏ phương pháp sắc ký kết hợp bao gồm sắc ký cột nhồi silicagel pha thường, sắc ký cột nhồi silicagel pha đảo sắc ký lớp mỏng điều chế thu hai chất là:  Hợp chất 1: Stevioside  Hợp chất 2: -Sitosterol Đồng thời sử dụng phương pháp phổ đại bao gồm phổ cộng 13 hưởng từ hạt nhân chiều ( H-NMR, C-NMR, DEPT 135, DEPT 90) phổ khối lượng để xác định cấu trúc hoá học hợp chất Bảng 3: Hai hợp chất phân lập từ cỏ Hợp chất 1: Stevioside HO HO 4'" Công thức phân tử C38H60O18 Điểm chảy 238-239 oC MS: 827,2 [M +Na]+ HO 3'" 2'" 5'" OH 1'" HO O 12 11 13 16 14 OH 18 HO HO O 5' 1' 2' 3' 10 H H O 19 6' 4' OH O 15 OH O 6" 5" 6'" 20 1" O 4" 3" 2" O 17 OH 26 Hợp chất 2: -Sitosterol Công thức phân tử 22 24 C29H50O Điểm chảy 136-137 oC 18 19 20 17 27 29 28 HO Các kết nghiên cứu khơng đóng góp vào việc làm sáng tỏ thành phần hoá học cỏ ngọt(Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley) mà giải thích tác dụng chữa bệnh định hướng nghiên cứu nhằm khai thác có hiệu nguồn tài nguyên dược liệu nước TàI LIệU THAM KHảO Boonkaewwan [1] C, Ao M, Toskulkao C, Rao MC Specific immunomodulatory and secretory activities of stevioside and steviol in intestinal cells J Agric Food Chem 2008, 56, 3777-84 Boonkaewwan C, Toskulkao C, Vongsakul M Anti-Inflammatory and [2] Immunomodulatory Activities of Stevioside and Its Metabolite Steviol on THP-1 Cells J Agric Food Chem 2006, 54, 785-789 Chatsudthipong V, Muanprasat C Stevioside and related compounds: [3] therapeutic benefits beyond sweetness Pharmacol Ther 2009, 121, 4154 Chen TH, Chen SC, Chan P, Chu YL, Yang HY, Cheng JT [4] Mechanism of the hypoglycemic effect of stevioside, a glycoside of Stevia rebaudiana Planta Med 2005, 71, 108-113 Curi R, Alvarez M, Bazotte RB, Botion LM, Godoy JL, Bracht A [5] Effect of Stevia rebaudiana on glucose tolerance in normal adult humans Braz J Med Biol Res 1986, 19, 771-4 Dacome A S., Silva, Cecilia C C., Costa E M., Fontana J D., Adelmann J., and Costa S C., Sweet diterpenic glycosides balance of a [6] new cultivar of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni: Isolation and quantitative distribution by chromatographic, spectroscopic, and electrophoretic methods, Process Biochemistry, 40, 3587-3594 (2005) [7] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễ Tập Trần Toàn, Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tập I, trang 495-498 (2004) Ferreira EB, de Assis Rocha Neves F, da Costa MA, Prado WA, de [8] Araỳjo Funari Ferri L, Bazotte RB Comparative effects of Stevia rebaudiana leaves and stevioside on glycaemia and hepatic gluconeogenesis Planta Med 2006, 72, 691-696 Ghanta S, Banerjee A, Poddar A, Chattopadhyay S Oxidative DNA [9] damage preventive activity and antioxidant potential of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni, a natural sweetener J Agric Food Chem 2007, 55, 10962-10967 [10] Goad J L and Akihisa T., Analysis of sterols, Blackie Academic and Professional Pub., First edition, p.378 (1997) Jeppesen PB, Gregersen S, Rolfsen SE, Jepsen M, Colombo M, Agger [11] A, Xiao J, Kruhứffer M, Orntoft T, Hermansen K Antihyperglycemic and blood pressure-reducing effects of stevioside in the diabetic GotoKakizaki rat Metabolism 2003, 52, 372-378 Kennelly EJ Sweet and non-sweet constituents of Stevia rebaudiana [12] (Bertoni) Bertoni In: Kinghorn AD (Ed.), Stevia, the genus Stevia Medicinal and aromatic plants-Industrial profiles, Vol 19 Taylor and Francis, London and NewYork, pp 68-85 (2002) [13] Kohda Hiroshi, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki, Kuniko Murakami and Osamu Tanaka New sweet diterpene glucosides from Stevia rebaudiana Phytochemistry, 1976, 15, 981-983 McGarvey BD, Attygalle AB, Starratt AN, Xiang B, Schroeder FC, [14] Brandle JE, Meinwald J New non-glycosidic diterpenes from the leaves of Stevia rebaudiana J Nat Prod 2003, 66, 1395-1398 McGarvey BD, Attygalle AB, Starratt AN, Xiang B, Schroeder FC, [15] Brandle JE, Meinwald J New non-glycosidic diterpenes from the leaves of Stevia rebaudiana J Nat Prod., 2003, 66, 1395-1398 [16] Ogawa T et al., Total synthesis of stevioside Tetrahedron, 1980, 36, 2641-2648 Oshima Y, Jun-ichi Saito, Hiroshi Hikino Sterebins A, B, C and D, [17] bisnorditerpenoids of Stevia rebaudiana leaves Tetrahedron, 1986, 42, 6443-6446 Oshima Yoshiteru, Jun-Ichi Saito, Hitoshi Hikino, Sterebins E, F, G [18] and H, diterpenoids of Stevia rebaudiana leaves Phytochemistry, 1988, 27, 624-626 Pariwat, P., Homvisasevongsa, S., Muanprasat, C., & Chatsudthipong, [19] V (2008) A natural plant-derived dihydroisosteviol prevents cholera toxin-induced intestinal fluid secretion J Pharmacol Exp Ther 324, 798−805 Shiozaki, K., Fujii, A., Nakano, T., Yamaguchi, T., & Sato, M (2006) [20] Inhibitory effects of hot water extract of the Stevia stem on the contractile response of the smooth muscle of the guinea pig ileum Biosci Biotechnol Biochem 70, 489−494 Starratt Alvin N, Christopher W Kirby, Robert Pocs, James E [21] Brandle, Rebaudioside F, a diterpene glycoside from Stevia rebaudiana Phytochemistry, 2002, 59, 367-370 Starratt AN, Kirby CW, Pocs R, Brandle JE Rebaudioside F, a [22] diterpene glycoside from Stevia rebaudiana Phytochemistry 2002 Feb;59(4):367-70 Takahashi,K.,Matsuda,M.,Ohashi, K., Taniguchi,K., Nakagomi,O., [23] Abe, Y., et al (2001) Analysis of anti-rotavirus activity of extract from Stevia rebaudiana Antiviral Res 49, 15−24 Tomita, T., Sato, N., Arai, T., Shiraishi, H., Sato, M., Takeuchi, M., et al (1997) Bactericidal activity of a fermented hot-water extract from [24] Stevia rebaudiana Bertoni towards enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 and other food-borne pathogenic bacteria Microbiol Immunol 4, 1005−1009 Toskulkao C, Chaturat L, Temcharoen P, Glinsukon T Acute toxicity [25] of stevioside, a natural sweetener, and its metabolite, steviol, in several animal species Drug Chem Toxicol 1997, 20, 31-44 [26] Wood HB, Allerton R, Diehl HW, Fletcher HG Stevioside I The structure of the glucose moieties J Org Chem 20, 875−883 (1955) Yasukawa K, Kitanaka S, Seo S Inhibitory effect of stevioside on [27] tumor promotion by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate in twostage carcinogenesis in mouse skin Biol Pharm Bull 2002, 25, 14881490 [28] Peter J.Houghton and Lu Ming Lian, Triterpenes From Desfontainia spinosa, Phytochemistry, Vol.25(8), 1939-1944(1986) ... tài cho khoá luận tốt nghiệp là: Nghiên cứu thành phần hoá học cỏ (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley) ” Luận văn tập trung nghiên cứu thành phần hoá học từ cỏ bao gồm nội dung là: Sử dụng phương... 1.2 Thành phần hố học hoạt tính sinh học cỏ 1.2.1 Giới thiệu chung Cây cỏ từ lâu sử dụng chất tạo tự nhiên không chứa calo.Các nghiên cứu thành phần hoá học cỏ tiến hành từ lâu xác định thành phần. .. Đặc điểm, tính vị cơng dụng cỏ 1.1.1 Thực vật học. [7] Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley Hä: Cóc (Asteraceae) Hình 1.1: Cây cỏ hoa cỏ Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5 – 0,6