Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ ngọt = (STEVIA REBAUDIANA (BERTONI) HEMSLEY )

cây cỏ ngọt ở Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách thích hợp, hiệu quả có ý nghĩa thực tiễn đối với sự phát triển của nền y học Việt Nam hiện đại dựa trên các

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA HOÁ HỌC

***************

Nguyễn duy công

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA CÂY CỎ NGỌT

(Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hoá Hữu Cơ

Hà Nội 2009

Em xin trân trọng cảm ơn TS Phan Văn Kiệm – Viện hoá học các

Hợp chất thiên nhiên - Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thiện khoá luận

Em xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo trong Khoa Hoá Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và các cán bộ Viện hoá học các Hợp chất thiên nhiên - Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã ủng hộ và tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp này dù rất cố gắng nhưng em vẫn không tránh khỏi một số sai sót Vì vậy, em kính mong nhận được sự góp

học-ý chỉ bảo của các thầy, cô và các bạn sinh viên quan tâm

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2009

Sinh viên

Nguyễn Duy Công

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả trong khoá luận này là trung thực Các kết quả không trùng với các kết quả đã được công bố

Sinh viên

Nguyễn Duy Công

Mục lục

Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các hình vẽ và bảng biểu

Trang

Mở đầu 1

Chương 1: Tổng quan 3

1.1 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây cỏ ngọt 3

1.1.1 Thực vật học 3

1.1.2 Phân bố, sinh thái 4

1.1.3 Bộ phận dùng 4

1.1.4 Tác dụng dược lý 4

1.1.5 Tính vị, công năng 6

1.1.6 Công dụng 6

1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây cỏ ngọt 7

1.2.1 Giới thiệu chung 7

1.2.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học 8

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 11

1.3.1 Chọn dung môi chiết 12

1.3.2 Quá trình chiết 14

1.4 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ 15

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí 15

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí 15

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí 16

1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 18

1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR) 18

1.5.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS) 19

1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) 19

Chương 2: đối tượng và phương pháp nghiên cứu 23

2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 23

2.1.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 23

2.1.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 23

2.1.3 Sắc ký cột (CC) 23

2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 23

2.2.1 Điểm nóng chảy (MP) 23

2.2.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) 24

2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 24

2.2.4 Độ quay cực []D 24

2.3 Dụng cụ và thiết bị 24

2.3.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết 24

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc 25

2.5 Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất 25

Chương 3: Kết quả và thảo luận 27

3.1 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất 27

3.1.1 Hợp chất 1: Stevioside 27

3.1.2 Hợp chất 2: -Sitostorol 28

3.2 Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất 28

3.2.1 Hợp chất 1: Stevioside 28

3.2.2 Hợp chất 2: -Sitostorol 38

Kết luận 43

Tài liệu tham khảo 45

Danh mục các chữ viết tắt

[]D Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 1

H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Two-Dimensional NMR

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron

Electron Impact Mass Spectrometry

FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh

Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

Danh mục các hình vẽ và bảng biểu

Trang

Hình 1.2.2.1: Một số hợp chất khung kauran ditecpen đã được phân

Hình 3.2.1.9: Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 1 38

Mở đầu

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ ẩm cao trên 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15 đến 270C Đó là điều kiện rất thích hợp cho thực vật phát triển Do vậy hệ thực vật Việt Nam vô cùng phong phú, đa dạng với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược [7] Điều này thực sự có ý nghĩa to lớn cho sự phát triển của ngành y tế, ngành hoá học và một số ngành khác Hệ thực vật phong phú trên được coi như là tiền đề cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta

Từ ngàn xưa, ông cha ta đã sử dụng nhiều phương thuốc dân gian từ cây

cỏ để chữa bệnh, bồi bổ cơ thể hay làm hương liệu, phẩm màu như lá Tía tô

để giải cảm, Nhân sâm để tăng cường sức đề kháng, Sả để tạo mùi thơm, củ Nâu để nhuộm màu Các phương thuốc y học cổ truyền đã thể hiện những mặt mạnh trong điều trị bệnh là ít độc tính và ít tác dụng phụ Do có những ưu điểm như trên nên ngày nay con người ngày càng quan tâm đến các hợp chất

có hoạt tính sinh học cao trong thực vật và động vật Về lâu dài đối với sự phát triển các dược phẩm mới thì các hợp chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò quan trọng, nó là khởi đầu cho việc tổng hợp nên các loại thuốc mới có tác dụng tốt hơn

Theo tài liệu [28] công bố hiện nay có khoảng 60% - 70% các loại thuốc chữa bệnh đang được lưu hành hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên

Cây cỏ ngọt được biết đến là một loại cây có hoạt tính sinh học cao, chứa nhiều thành phần hoá học và có nhiều tác dụng dược lý Tác dụng quan trọng nhất của cây cỏ ngọt là chữa bệnh đái tháo đường, bệnh béo phì, cao huyết áp Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hoá học và tác dụng dược lý của

cây cỏ ngọt ở Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách thích hợp, hiệu quả có ý nghĩa thực tiễn đối với sự phát triển của nền y học Việt Nam hiện đại dựa trên các phương thuốc cổ truyền

Do đó tôi đã chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là:

“Nghiên cứu thành phần hoá học của cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana

Hình 1.1: Cây cỏ ngọt và hoa của cây cỏ ngọt

Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5 – 0,6 m và có khi cao tới 1 m Thân cứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh

Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn dài

5 -7 cm, rộng 1 - 1,5 cm, có 3 gân, 4 – 6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm, cuống lá rất ngắn

Hoa lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn

Quả bế, không có mào lông, hạt không có nội nhũ

Mùa hoa: tháng 5 - 9

1.1.2 Phân bố, sinh thái [7]

Chi Stevia Cav Không có một đại diện nào ở vùng Châu á Cỏ ngọt đang được trồng phổ biến ở Việt Nam hiện nay, được nhập nội từ một nước Nam

Mỹ (nguồn gốc ở Paraguay) năm 1988

Cỏ ngọt là cây ưa ẩm và ưa sáng, có thể chịu bóng hoặc ưa bóng vào thời

kỳ cây con Vốn là cây ở vùng nhiệt đới, cỏ ngọt trồng ở Việt Nam sinh trưởng và phát triển tốt vào vụ xuân - hè Về mùa đông, cây có hiện tượng rụng lá và hơi tàn lụi Cây ra hoa, quả nhiều hàng năm Tuy nhiên, người ta thường áp dụng cách nhân giống bằng cắm cành

1.1.3 Bộ phận dùng [7]

Phần trên mặt đất của cây cỏ ngọt Thu hái lúc cây xum xuê

1.1.4 Tác dụng dược lý [7]

1.1.4.1 Tác dụng hạ đường huyết: thành phần steviosid trong lá cây

cỏ ngọt có tác dụng làm đường huyết giảm rõ rệt ở thỏ, chuột cống trắng và bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường

1.1.4.2 Tác dụng giãn mạch: Steviosid có tác dụng làm giãn tĩnh

mạch toàn thân rõ rệt

1.1.4.3 Tác dụng trên thận và huyết áp: thành phần steviosid trong lá

cây cỏ ngọt có tác dụng làm tăng lưu lượng huyết tương qua thận (RPF), tăng tốc độ lọc cầu thận (GFR), hạ huyết áp, tăng bài niệu và tăng thải trừ natri

1.1.4.4 Tác dụng tránh thai: Nghiên cứu của PLANAS (năm 1968)

đã thông báo , cho chuột cống trắng cái và đực uống nước có 5% cao cỏ ngọt thấy có tác dụng ngừa thai Nhưng trong những năm 70, bốn nhóm thực

1.1.4.5 Tác dụng kháng khuẩn: Cao lá cỏ ngọt có tác dụng đối với

Pseudomonas aeruginosa và Proteus vulgaris Chưa thấy tài liệu công bố về tác dụng trên các vi khuẩn Streptococcus inutans, Lactobacillus plantarum và Lactobacillus casei là những vi khuẩn có liên quan đến quá trình sún răng ở trẻ em, vì hiện nay có dùng steviosid thay thế đường trong chế biến bánh kẹo

1.1.4.6 Liều dùng an toàn ở người: Nồng độ steviosid trong một số

nước giải khát ở Nhật Bản là 0,005 – 0,007% Nếu một ngày uống 1 lit thì lượng steviosid đưa vào cơ thể là 0,05 – 0,07g tương ứng với khoảng 1g lá cỏ ngọt Điều đó có thể được chấp nhận vì là liều an toàn, đã được Nhà nước Nhật cho phép

1.1.4.7 Độc tính cấp: Cho chuột uống steviosid với liều 2g/kg không

thấy có chuột chết và cũng không thấy có biểu hiện độc sau 2 tuần theo dõi

1.1.4.8 Độc tính bán cấp: Cho chuột cống trắng ăn với liều dùng

hàng ngày 0,5g/kg trong 56 ngày các thông số theo dõi gồm cân nặng, các chỉ tiêu huyết học, các chỉ tiêu hoá sinh và xét nghiệm tổ chức học gan đều bình thường

- Độ thanh thải inulin không thay đổi, chứng tỏ chức năng lọc cầu thận không bị ảnh hưởng

- Độ thanh thải của glucose tăng, chứng tỏ chức năng tái hấp thu của ống lượn gần bị suy giảm, một phần glucose không được tái hấp thu và đã bị thải trừ qua nước tiểu

- Độ thanh thải steviosid cao hơn độ thanh thải inulin, chứng tỏ

steviosid còn bị thải trừ qua niêm mạc của ống thận

- Ngoài ra, steviosid cong gây bài niệu tăng thải natri niệu và làm tăng

độ thanh thải của paraaminohippuric

c Tiêm dưới da cho chuột cống trắng với liều 1,5g/kg, kết quả thấy:

- Những thay đổi giống thí nghiệm trên là tăng nồng độ urê và creatinin trong huyết thanh, thấy glucose trong nước tiểu

- Ngoài ra về tổ chức bệnh học, thấy có biến đổi hình thái ở tế bào niêm mạc ống lượn gần Những tổn thương này là do hoạt động của 2 enzym phosphatase kiềm và gama-glutamyl-transpeptidase tăng lên Những enzym này khu trú chủ yếu ở điểm bàn chải của tế bào ống lượn gần

1.1.4.10 Khả năng gây đột biến:

a Nhiều thí nghiệm nghiên cứu khả năng gây đột biến trên các chủng Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1538 và TM 677, hoặc trên chủng Escherichia coli WP2 đều xác định cao cỏ ngọt, steviosid và steviol là aglycon của steviosid không gây đột biến

b Có nghiên cứu cho biết một số chất chuyển hoá của steviosid lại có thể gây đột biến Mặc dù steviosid không bị chuyển hoá trong cơ thể và thải trừ nguyên vẹn qua nước tiểu Song người ta lo ngại một số tạp khuẩn vùng màng tràng có thể phân giải được steviosid

1.1.5 Tính vị, công năng [7]

Cỏ ngọt có vị ngọt rất đậm, có ích cho người đái tháo đường và người béo phì, thuốc ít độc

1.1.6 Công dụng [7]

1.1.6.1 Chữa đái tháo đường: Cỏ ngọt và steviosid có vị ngọt sẽ làm

giảm nhu cầu chất đường và chất bột của người bệnh, vì thế sẽ làm giảm đường huyết Liều dùng theo thử nghiệm ở Braxin là mỗi lần 0,25g steviosid (hoặc 2,5g lá cỏ ngọt), ngày 4 lần Uống nhiều ngày

1.1.6.2 Chữa béo phì: Cỏ ngọt và steviosid có vị ngọt sẽ làm giảm

nhu cầu chất đường và chất bột của cơ thể, nên cũng có tác dụng chữa béo phì Liều dùng 0,5 – 1g steviosid chia ra 3 – 4 lần trong ngày Uống nhiều ngày

1.1.6.3 Lá cỏ ngọt hoặc steviosid thường dùng làm chất điều vị cho các loại trà thuốc, trà túi lọc: Tỷ lệ lá cỏ ngọt hoặc steviosid trong đó thường

thấp Tại Việt Nam, cũng đã có một số chế phẩm trà thuốc có cỏ ngọt như:

- Trà actisô - stevia

- Trà sâm quy – stevia có sâm khu 5, tam thất, đương quy, thục địa, táo, long nhã, ngũ gia bì và cỏ ngọt

- Trà nhân trần, thảo quyết minh, cỏ ngọt

- Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và cỏ ngọt

1.1.6.4 Chữa cao huyết áp: Hàng ngày uống trà sotevin

1.1.6.5 Dùng thay thế đường săcharose: Trong công nghiệp thực

phẩm để làm chất điều vị cho bánh mứt kẹo, nước giải khát

1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây cỏ ngọt

1.2.1 Giới thiệu chung

Cây cỏ ngọt từ lâu đã được sử dụng như là một chất tạo ngọt tự nhiên không chứa calo.Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây cỏ ngọt đã được tiến hành từ lâu và đã xác định thành phần chính tạo ra vị ngọt là các đitecpen glycosit trong đó chủ yếu là stevioside và các dẫn xuất kauran ditecpen tương tự Hàm lượng stevioside trong cỏ ngọt là 3 – 20% tuỳ theo giống và các điều kiện trồng trọt, thu hoạch

Hợp chất stevioside có độ ngọt gấp 300 lần so với đường sucrose và tập trung chủ yếu ở phần lá cây Nghiên cứu về hàm lượng các chất stevioside trong cỏ ngọt đầu tiên được công bố năm 1955: stevioside (5-10% trọng lượng khô), rebaudioside A (2-4%), rebaudioside C (1-2%) và dulcoside A (0,4-0,7%) [26] Sau đó một nhóm nghiên cứu Nhật Bản đã phân lập và xác định cấu trúc của stevioside, rebaudioside A, rehbaudioside B và steviobioside bằng các phương pháp phổ [13] Về sau các hợp chất này cũng được phân lập bởi các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới [12, 16, 21]

1.2.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học

1.2.2.1 Một số hợp chất khung kauran ditecpen

-D-Rebaudioside B: R1 =  , R2 =  -D-Glucopyranosyl-(1->2)-[  -D- glucopyranosyl-(1->3)]-  -D-glucopyranoside

Rebaudioside C: R1 =  -D-glucopyranoside, R2 =  Rhamnopyranosyl-(1->2)-  -D-glucopyranosyl-(1->3)-  -D- glucopyranoside

-L-Rebaudioside D: R1 =  -D-glucopyranosyl-(1->2)-  glucopyranoside, R2 =  -D-Glucopyranosyl-(1->3)-[  -D- glucopyranosyl-(1->2)]-  -D-glucopyranoside

-D-Rebaudioside E: R1 = R2 =  -D-glucopyranosyl-(1->2)-  glucopyranoside

-D-Rebaudioside F: R1 =  -D-glucopyranoside, R2 =  Glucopyranosyl-(1->3)-[  -D-xylopyranosyl-(1->2)]-  -D- glucopyranoside

-D-Dulcoside A: R1 =  -D-glucopyranoside, R2 =  -L- rhamnopyranosyl-(1->2)-  -D-glucopyranoside

Steviobioside: R1 =  , R2 =  -L-Rhamnopyranosyl-(1->2)-  -D- glucopyranoside

Hình 1.2.2.1: Một số hợp chất khung kauran ditecpen đã được phân lập từ

cây cỏ ngọt

Các ent – Kauren diterpen glycosid: steviosid(2,2 – 18,5%), rebaudiosid

A, B, C, D E, dulcosid, steviobiosid Các thành phần này có vị ngọt ở các mức độ khác nhau

1.2.2.2 Một số hợp chất khung labdane ditecpen

OH OH O

OH

CH2OH HO

Sterebin G

OH OH

Ngoài khung kauran ditecpen, trong cây cỏ ngọt còn chứa các đitecpen

thuộc nhóm labdane Một loạt hợp chất khung này đã được phân lập và được

đặt tên dạng sterebin [14, 17, 18]

Các labdan diterpen gồm: jihanol, austroinulin, acetylaustroinulin

1.2.2.3 Hoạt tính sinh học

Các hợp chất đitecpen này được biết đến có nhiều hoạt tính sinh học rất hấp dẫn Về độc tính khi được dùng làm chất tạo ngọt, stevioside có độ độc rất thấp khi nghiên cứu trên chuột thí nghiệm với liều lượng LD50 khoảng 10 g/kg thể trọng [25]

Dịch chiết cũng như các chất tách được từ cỏ ngọt có tác dụng mạnh trong việc điều khiển quá trình chuyển hoá glucozơ và insulin trong cơ thể Theo Chen và cộng sự, stevioside với liều 0,5 mg/kg làm giảm lượng đường glucozơ trong máu đồng thời hạn chế sự kháng insulin ở chuột bị tiểu đường [4] Tác giả Ferreira cũng chỉ ra rằng dịch chiết nước cỏ ngọt (20 mg/kg/ngày) cũng có tác dụng làm ức chế quá trình chuyển hoá glucozơ trong gan trên chuột thí nghiệm [8] Trước đó vào năm 1986, Curi đã thử nghiệm tác dụng của dịch chiết nước cỏ ngọt trên một nhóm người tình nguyện Kết quả cho thấy với dịch chiết 5 g lá dùng liên tục trong 3 ngày, hàm lượng đường glucozơ trong huyết tương giảm rõ rệt [5] Các nghiên cứu này mở ra khả năng ứng dụng cỏ ngọt trong việc chữa trị bệnh tiểu đường và các bệnh liên quan đến sự chuyển hoá glucozơ Ngoài ra, cùng với tác dụng giảm đường huyết, stevioside còn có tác dụng hạ huyết áp trên lô chuột bị tiểu đường [11]

Tác dụng chống ung thư và chống viêm của cỏ ngọt cũng được nghiên cứu chi tiết trên mô hình chuột thí nghiệm gây u bằng 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) Các hợp chất tách được từ cây này gồm stevioside, rebaudiosides A và C, và dulcoside A ức chế mạnh quá trình gây viêm đồng thời hỗn hợp các hợp chất này ngăn ngừa tốt sự hình thành ung thư da trên chuột với liều 1,0 và 0,1 mg/con [27]

Mới đây, tác giả Boonkaewwan cũng cho thấy tác dụng chống viêm của stevioside và steviol thông qua quá trình ngăn ngừa sự tổng hợp TNF-ỏ và IL-1õ với nồng độ khá thấp (0,01-0,2 mM) Cả hai hợp chất này đều có khả năng ngăn chặn sự phát triển của 3 dạng tế bào T84, Caco-2 và HT29 Hoạt tính này được biết có liên quan đến quá trình ức chế yếu tố phiên mã NF-kB [1]

Hợp chất stevioside còn được sử dụng trong trị liệu chữa ỉa chảy hiệu quả Khởi nguồn từ kết quả nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng virut

của dịch chiết nóng cây cỏ ngọt cho thấy tác dụng diệt mạnh chủng E coli là

nguyên nhân gây ra bệnh ỉa chảy [24] Các nghiên cứu tiếp sau đó khẳng định tác dụng và khả năng ứng dụng rất cao của cỏ ngọt cũng như nhóm chất stevioside trong việc chữa trị ỉa chảy [19, 20, 23]

Ngoài các hợp chất đitecpen, trong cây cỏ ngọt còn chứa lớp chất phenol và flavonoit Tác giả Ghanta đã định lượng được hàm lượng nhóm chất này trong dịch chiết etyl axetat là tương đương 0,86 mg axit galic và 0,83 mg quercetin trên 1 mg Bằng phân tích LC-MS và phổ NMR, nhóm tác giả đó nhận dạng được sự có mặt của quercetin-3-O-arabinoside, quercitrin, apigenin, apigenin-4-O-glucoside, luteolin, and kaempferol-3-O-rhamnoside Dịch chiết methanol và etyl axetat cho thấy có khả năng diệt các gốc tự do bằng phương pháp thử DPPH và lipid peroxidation Nghiên cứu này chứng tỏ cây cỏ ngọt còn là một dược liệu thiên nhiên chống oxy hoá hiệu quả [9]

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Thông thường các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn

thận

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy

Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa

Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chlorofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa

[di-(2-Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phẩn ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác Vì chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom

Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có nhứng đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết [10] Thí dụ trechlonolide A thu được từ Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong methanol nóng

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit

dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho

quá trình chiết tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sực và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi

có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau

Như vậy tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

1.4 Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và

hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.4.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất

hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh

sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai

pha động và pha tĩnh ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc

với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

.

n b C n

b C







n - lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n∞ - lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào

đó

b - hằng số

C - nồng độ của chất bị hấp phụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái

khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra

thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

1.4.3.1 Sắc ký cột (C.C)

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm

các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion… Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp nếu lực trọng

trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất

quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là

Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf này

mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 – 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ

số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương

pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất

vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gẫy, dò

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.4.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định

hướng cho sắc ký cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica

gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu

chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các

phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các phương pháp sắc kí so sánh…

1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl

là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1…

1.5.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của

phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học các hợp chất Hiện nay có rất nhiều

loại phổ khối lượng, những phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự

phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV

- Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ

phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn pha thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá

vỡ