Nghiên cứu thành phần hoá học của cây cẩu tích ( cibotium barometz (l) j SM)

Nguyễn Thị Xuân Mai Lớp K31B - Khoa Hóa học 3 LỜI CẢM ƠN Bản khoá luận tốt nghiệp với đề tài “ Nghiên cứu thành phần hoá học của cây Cẩu tích” được thực hiện và hoàn thành tại trường Đ

Trang 1

Nguyễn Thị Xuân Mai Lớp K31B - Khoa Hóa học 1

Trường đại học sư phạm hà nội 2

Khoa hoá học &&&

Nguyễn thị xuân mai

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây

cẩu tích

(Cibotium barometz (L).J.Sm)

Khoá luận tốt nghiệp đại học

Chuyên nghành: Hoá hữu cơ

Hà nội - 2009

Trang 2

Trường đại học sư phạm hà nội 2

Khoa hoá học &&&

Nguyễn thị xuân mai

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây

cẩu tích

(Cibotium barometz (L).J.Sm)

Khoá luận tốt nghiệp đại học

Chuyên nghành: Hoá hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

TS Nguyễn Văn Bằng

Hà nội - 2009

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Bản khoá luận tốt nghiệp với đề tài “ Nghiên cứu thành phần hoá học

của cây Cẩu tích” được thực hiện và hoàn thành tại trường ĐHSP Hà Nội 2,

Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện khoa học công nghệ Việt Nam

Trước hết em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc Thầy giáo TS Nguyễn Văn Bằng, Khoa Hoá học -Ttrường ĐHSP Hà Nội 2 người đã hướng dẫn, và chỉ bảo tận tình cho em trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, cũng như dạy dỗ em trong suốt quá trình học tập tại trường Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ to lớn và quí báu đó

Em xin chân thành cảm ơn TS Phan Văn Kiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ em trong quá trình thực nghiệm

Em xin gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo cùng cán bộ phòng Hóa công nghệ, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Hoá học-Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo dựng cho em những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường

Hà Nội, tháng 5 năm 2009

Sinh viên Nguyễn Thị Xuân Mai

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài: “Nghiên cứu thành phần hoá học của cây Cẩu tích” là công trình

nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Văn Bằng

Các số liệu, kết quả nêu trong khoá luận là trung thực Các kết quả không trùng lặp với các kết quả đã được công bố

Hà Nội, tháng 5 năm 2009

Sinh viên

Nguyễn Thị Xuân Mai

Trang 5

1.1.2 Phân bố, sinh thái 4

1.1.4 Thành phần hoá học 7

1.1.5 Lược sử nghiên cứu cây Cẩu tích 7

1.2 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 9

1.2.1 Khái niệm phương pháp chiết 9 1.1.2 Cơ sở quá trình chiết 9

Trang 6

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 22

2.3 Các phương pháp sắc ký để phân lập các chất từ dịch chiết 22

2.4 Các phương pháp hoá lý để xác định cấu trúc 22

3.1 Thu hái và xác định tên khoa học cây Cibotium barometz 28

3.2.Điều chế các phần chiết và tinh chế các hợp chất 29

Trang 7

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

 D Độ quay cực (Specific Optical Botation)

13

C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Cacbon–13 Nuclear MagneticResonance Spectroscopy

1

H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H- 1 H COSY 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều

Two – Pimensional NMR

CC Sắc ký cột (Column Chromatography)

DEPT Distortionless Enhancement By Polarisation Trasfer

ESI – MS Phổ khối lượng phun mù điện tử

Electron Spray Ionization Mass Spectranetry

FAB – MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh

Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivily

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR – FAB – MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao

Hight Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

Me Nhóm Metyl

NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry)

Trang 8

Danh mục các hình vẽ và bảng biểu

Trang

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất điển hình đã được

phân lập từ cây Cẩu tích

Hình 3.3.2.h Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 2 40

Sơ đồ 2.6 Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất từ loài Cibotium

Bảng 3.2 Hàm lượng các cặn chiết từ lá cây Cẩu tích 29

Bảng 2 Tổng hợp kết quả phổ NMR của hợp chất 2 38

Trang 9

Mở đầu

Từ xa xưa, cộng đồng các dân tộc Việt Nam, đặc biệt là cư dân sống ở miền núi cao, ở vùng sâu, vùng xa đã biết sử dụng các sản phẩm thực vật có trong tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh và chăm sóc sức khoẻ cho mình như dùng lá tía tô để giải cảm, nhân sâm để tăng cường sức đề kháng,… Các phương thuốc y học cổ truyền đã thể hiện những mặt mạnh trong điều trị bệnh là ít độc tính và tác dụng phụ Do có nhiều ưu điểm như trên nên ngày nay con người ngày càng quan tâm đến các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao trong thực vật

Giá trị của các hợp chất này không chỉ ở công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, mà còn vì chúng có thể dùng làm các nguyên mẫu hoặc các cấu trúc dẫn đường cho sự phát triển và phát hiện nhiều dược phẩm mới Nghiên cứu thành phần hóa học là con đường ngắn và hiệu quả nhất để tìm kiếm các hoạt chất từ nguồn tài nguyên tái tạo này.[9]

Như chúng ta đã biết, Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, tới 3/4 diện tích của cả nước là núi rừng trùng điệp, cùng với điều kiện khí hậu rất

đa dạng với nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trưng đã tạo cho nước ta có thảm thực vật thiên nhiên vô cùng phong phú, đặc biệt là kho tàng các cây dược liệu Theo thống kê, hiện nay số loài thực vật bậc cao có mạch ở nước ta vào khoảng 12.000-13.000 loài, thì số loài được dùng làm thuốc chiếm tới 4.000 loài [14] Điều này thực sự có ý nghĩa quan trọng cho sự phát triển của ngành y tế, ngành hóa học và một số ngành khác Hệ thực vật phong phú trên được coi là tiền đề cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta

Cây Cẩu tích hay còn được gọi là Kim mao Cẩu tích, có tên khoa học là

Cibotium barometz, là một loài thực vật thuộc họ Lông cu ly (Dicksoniaceae)

Nó được biết đến là một loại cây có mặt trong nhiều bài thuốc để chữa bệnh Ở

Trang 10

Việt Nam loài cây này được biết đến trong các bài thuốc dân gian chữa đau lưng, gân mạch chân khớp khó cử động, can thận hư suy, bổ thận, phong thấp đau nhức xương, tay chân yếu mỏi hoặc bại liệt co quắp Vì cây có hoạt tính sinh học cao, chứa nhiều thành phần hoá học và có nhiều tác dụng dược lý Việc nghiên cứu,thành phần hóa học của cây Cẩu tích ở Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lý, hiệu quả có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng trong sự phát triển của nền y học Việt Nam hiện đại dựa trên các bài thuốc cổ truyền Ở nước ta các tài liệu nghiên cứu về loài thực vật này còn hạn chế, chưa có công trình nào nghiên cứu một cách thống về thành phần hoá học của cây Cẩu tích Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, nên tôi lựa

chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là “Nghiên cứu thành phần hoá học của

cây Cẩu tích “

Mục tiêu của khoá luận văn:

1 Thu hái và xác định tên khoa học cây Cẩu tích

2 Phân lập một số hợp chất từ cây Cẩu tích

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

Trang 11

Trang 12

Hình 1.1 Cây Cẩu tích (Cibotium barometz (L).J.Sm)

Trang 13

Cây có thân thường yếu, nhưng cũng có thể cao 2,5-3m Lá lớn có

cuống dài 1- 2m, màu nâu nâu, ở phía gốc có vẩy hình dải rất dài màu vàng và bóng phủ dày đặc Phiến dài tới 3m, rộng đến 60-80cm Các lá lông chim ở phía dưới hình trái xoan-ngọn giáo dài 30-60 cm Lá lông chim bậc hai hình dải - ngọn giáo, nhọn lại chia thành nhiều đoạn thuôn, hẹp; Mặt trên lá màu lục sẫm, mặt dưới màu lục lơ; trục lá không lông; các gân của các lá chét bậc hai có lông len ở túi bào tử 1 hay 2, có khi 3 hay 4 ở về mỗi bên của gân giữa bậc 3; các túi màu nâu nâu, có hai môi không đều nhau; cái ở ngoài hình cầu, cái ở trong hẹp hơi thuôn

1.1.2 Phân bố, sinh thái [15]

Chi Cibotium Kaulf Có khoảng 10 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

châu Mỹ và châu á Trong đó Cẩu tích là loài có vùng phân bố tương đối rộng, bao gồm Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Lào, Malaysia, ấn Độ, Philippin

và Indonesessia

ở Việt Nam, Cẩu tích phân bố tập trung ở các tỉnh miền núi phía bắc: Hà Giang, Lai Châu, Yên Bái, Lào Cai, Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Cạn ở Miền Nam, cây chỉ thấy ở một số vùng núi cao, như Ngọc Linh (Kontum, Quảng Nam), Lang Bian (Lâm Đồng), và Bi Đúp (ĐắcLắc)

Cẩu tích là cây ưa ẩm và có thể chịu bóng Cây thường mọc thành từng đám hoặc thành những quần thể gần như thuần loại ở ven rừng hoặc dọc theo các bờ khe suối Độ cao thường thấy từ 600m (ở Miền Bắc) hoặc ở 800m (ở Miền Nam) đến 1600m Cẩu tích mọc nơi đất ẩm và nhiều mùn Thân rễ mọc vùi sát mặt đất hoặc nổi hẳn lên mặt đất Những cây già, thân rễ lớn (1-3kg) thường có hiện tượng hóa gỗ nhiều và mục rỗng ở giữa Cây sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm Mỗi năm mọc lên từ 3-5 lá Sinh sản bằng bào tử Bình thường cây Cẩu

Trang 14

tích không đẻ nhánh, nhưng nếu thân rễ bị chặt, phần còn lại có khả năng tiếp tục tái sinh

Trữ lượng Cẩu tích ở Việt Nam tương đối dồi dào ở những điểm có cây mọc tập trung, có thể khai thác từ 1-3 tấn thân rễ tươi trên một hecta Nhu cầu trong nước mỗi năm khoảng vài trăm tấn Những năm gần đây (1992-1998) loại dược liệu này bị khai thác ồ ạt (hàng ngàn tấn) để xuất khẩu qua biên giới Hiện tượng khai thác và phá rừng làm nương rẫy, đã làm cho các vùng phân bố của cây Cẩu tích bị thu hẹp Thêm vào đó là quá trình sinh sản bằng bào tử (đặc điểm chung của quyết thực vật) rất phức tạp Từ một cây Cẩu tích con đến khi khai thác được, có thể là 10 năm

1.1.3 Công dụng [15]

* Thu hái và chế biến

Thu hoạch thân rễ quanh năm, tốt nhất vào mùa thu - đông, cắt bỏ rễ con và

cuống lá, cạo hết lông vàng để riêng Rễ củ đã cạo hết lông, rửa sạch, thái phiến hay cắt từng đoạn dài 4-10mm, phơi hay sấy khô Cần bảo quản nơi khô ráo Khi dùng tẩm dược liệu với rượu để một đêm rồi sao vàng

Thân rễ có màu nâu hay nâu hơi hồng, đường kính 2-5cm, dài 4-10cm,

mặt ngoài gồ ghề, chỗ lồi, chỗ lõm, xung quanh còn dính ít lông màu vàng nâu, chất cứng khó cắt, khó bẻ gẫy khi khô, vị đắng ngọt Cẩu tích dễ bị mốc, cần bảo quản nơi khô ráo

*Tính vị, công năng

Cẩu tích có vị đắng ngọt, tính ẩm, có tác dụng bổ can thận, mạnh gân

xương, trừ phong thấp

*Tác dụng dược lý

Trang 15

Người ta đã nghiên cứu tác dụng chống viêm, ức chế chủ yếu giai đoạn viêm cấp tính, cả tác dụng gây động dục kiểu Oestrogen Lông cẩu tích có tác dụng cầm máu có tính cơ học bằng cách hút huyết thanh của máu và giúp cho sự tạo máu

cục, làm cho máu chóng đông

*Công dụng

Thân rễ Cẩu tích có tác dụng trị thấp khớp, tay chân nhức mỏi, đau lưng, đau dây thần kinh, người già đi tiểu tiện nhiều lần, phụ nữ khí hư bạch đới Ngày dùng 10-20g dạng thuốc sắc Người bị bệnh thận hư nhiệt, nước tiểu vàng không nên dùng

Ngoài ra, thân rễ Cẩu tích còn có tác dụng chữa đau dây thần kinh hông, chứng đi đái dắt, đi đái suốt không cầm được, phụ nữ có thai đau khắp lưng người

Lông vàng phủ xung quanh thân rễ Cẩu tích dùng đắp các vết thương, vết đứt tay chân để cầm máu Các lông đó hút huyết thanh của máu và giúp cho sự tạo máu cục, làm cho máu chóng đông

Theo một số tài liệu nước ngoài, thân rễ Cẩu tích được dùng làm thuốc

bổ, thuốc giun và trị đau lưng Những lông vàng hoặc có màu nâu nhạt phủ quanh thân rễ có tác dụng cầm máu nhanh, khi áp dụng thích hợp gây cầm máu mao mạch theo cơ chế cơ học

*Một số phương thuốc từ cây Cẩu tích

1 Chữa phong thấp, chân tay tê bại liệt không muốn cử động:

Dùng Cẩu tích 20g, ngưu tất 8g, mộc qua 12g, tang chi 8g, tùng tiết 4g, tục đoạn 8g, tần giao 12g, quế chi 4g, nước 600ml Sắc thành 250ml, chia 2 lần uống trong ngày

2 Chữa thận hư, sống lưng mỏi, đái luôn, vãi đái, bạch đới, di tinh:

Trang 16

Dùng Cẩu tích 15g, thục địa 12g, đỗ trọng dây 10g, dây tơ hang ( sao) 8g, kim anh 8g Sắc uống hàng ngày

3 Chữa phong thấp đau nhức xương, tay chân yếu mỏi hoặc bại liệt co quắp:

Dùng Cẩu tích 15g, tục đoạn 12g, cốt toái bổ 12g, đương quy 10g, xuyên khung 4g, bạch chỉ 4g Sắc uống hàng ngày

4 Bổ thận: Can thận bất túc, đau mỏi thắt lưng tiểu tiện luôn, phụ nữ đới

hạ :

Dùng Cẩu tích 16g, ngưu tất, thỏ ty tử, sơn thù du, lộc giao (chưng), đỗ trọng mỗi thứ 12g, thục địa 16g sắc uống hàng ngày

5 Viêm cột sống tăng sinh có gai do can thận bất túc:

Dùng Cẩu tích, bạch thược, thục địa, nhục thung dung, ngưu tất, cốt toái

bổ mỗi thứ 15g; sơn thù du, câu kỷ tử, nữ trinh tử, đương quy mỗi thứ 10g; kê huyết đằng 30g; mộc hương 6g sắc uống ngày 1 thang

6 Chữa đau lưng, mỏi gối do thận hư yếu:

Dùng Cẩu tích 20g, rễ gối hạc 12g, củ mài 20g, bổ cốt toái 16g, dây đau xương 12g, tỳ giải 16g, đỗ trọng 16g Thêm nước, sắc uống hàng ngày

7 Chữa đau nhức ngang lưng:

Dùng Cẩu tích 15g, ngưu tất 10g, đỗ trọng 10g, mộc qua 6g, nước 600ml Sắc còn 200ml, chia làm 3 lần uống trong ngày Có thể thêm 20ml rượu vào nước sắc khi uống thuốc, nếu người bệnh uống được rượu

Trang 17

1.1.5 Lược sử nghiên cứu cây Cẩu tích

Cẩu tích là một cây thuốc quý, tuy nhiên, trên thế giới hiện vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của loài cây này được công

bố Năm 1980, nhóm nghiên cứu của tác giả Murakami T [1] công bố sự phân

lập và xác định cấu trúc của onitin (1) và ba dẫn xuất của nó là onitin-2’-O-

-D-glucopyranoside (2), onitin-2’-O--D-allopyranoside (3) và pterosin R (4) Đến

năm 1982, nhóm nghiên cứu này tiếp tục công bố sự phân lập và xác định cấu

trúc của hợp chất 28,22-Hopanolide (5) [2] Tiếp theo, các hợp chất -sitosterol, stearic acid, daucosterol, protocatechuic acid, và axit caffeic tiếp tục được phân lập từ loài cẩu tích vào năm 1996 [3] Năm 2001, Zhang C và Wang Z công bố

thêm hợp chất 5-hydroxymethyl-2-furancarboxaldehyde (6) từ loài này [4] Năm

2002, các nhà khoa học Hàn Quốc tìm ra hợp chất mới octadecadienoyl)-3-O-[-D-galactopyranosyl-(1''-6')-O--D-galactopyranosyl] glycerol, và đặt tên là shinbarometin [5] Gần đây nhất, nhóm nghiên cứu của tác giả công bố thêm sự phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất alternariol

2-O-(9Z,12Z-(7), 24-methylene cycloartanol (8), (24R)-stigmast-4-en-3-one (9),

(3R)-des-O-Me lasiodiplodin, protocatechuic aldehyde từ cây cẩu tích [6]

Dưới đây chúng tôi trình bày cấu trúc hóa học của một số hợp chất điển hình đã được phân lập từ cây Cẩu tích :

OH

O R

5

Trang 18

CH3

OH

Trang 19

1.2 Các phương pháp chiết mẫu thực vật [10], [11]

1.2.1 Khái niệm phương pháp chiết

* Khái niệm: chiết là quá trình tách và phân ly

các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan

trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hòa

tan với nó

* Mục đích của chiết:

+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một

thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung

môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên

cứu và được gọi là chiết làm giàu

+ Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để

tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp

với điều kiện thích hợp Thường dùng trong phân tách

các hợp chất tự nhiên

1.2.2 Cơ sở của quá trình chiết

Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất

trong hai chất lỏng không hòa tan lẫn với nhau Sự

phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các

Trang 20

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác

nhau Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp, người ta không chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phải phối hợp một tỷ lệ nhất định để tạo

ra một hệ thống dung môi mới Tuy nhiên nhiều thành phần tan trong nước ít được quan tâm Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận Nó cần hoà tan những chất chuyển hoá thứ cấp trong nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Nếu chúng có lẫn các tạp chất khác có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như đianlkylphatalat, tri-n-butyl-axetylhidrat và tributylphotphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa

Methanol và chlorofooc thường chứa dioctylphatalat [đi-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này có thể làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật Chất này còn thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây

Clorofooc, metylen, clorit, và methanol là những dung môi thường sử dụng trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây (như: lá , thân ,rễ , củ , hoa)

Những tạp chất của Clorofooc như CH2Cl2 , CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancoloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác

Tương tự như vậy sự có mặt của một lượng nhỏ axit HCl cũng có thể gây

ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác Bởi vì Clorofooc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo léo cẩn thẩn ở nơi

Trang 21

thông thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen Clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn Clorofooc

Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo

Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào

Trái lại, Clorofooc khả năng phân cực thấp hơn, có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng sẽ bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước dường như có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết

Có hai quá trình chiết lỏng - lỏng khác nhau: chiết không liên tục (chiết đoạn) và chiết liên tục

* Chiết lỏng- rắn

Trang 22

Chiết lỏng-rắn được áp dụng để tách các chất phân tích ra khỏi mẫu vật rắn (thực vật, đất, các mẫu sinh học ) bằng dung môi thích hợp Chất phân tích trong mẫu vật rắn thường nằm ở thành nang nhỏ hoặc phân tán trong chất rắn, vì vậy cần nghiền nhỏ để tăng bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất phân tích Tùy thuộc vào tính phân cực của chất cần tách ta lựa chọn dung môi chiết, bắt đầu từ những dung môi hidrocacbon nhẹ đối với những chất ít phân cực đến những dung môi phân cực lớn như đietyl ete, axeton, etanol kể cả nước đối với những chất phân cực Qúa trình chiết lỏng - rắn có thể tiến hành theo phương pháp chiết đoạn hay chiết liên tục

* Chiết pha rắn

Chiết pha rắn là quá trình chiết bao gồm một pha rắn và một pha lỏng Các cấu tử cần quan tâm và các chất cản trở nằm trong pha lỏng Khi cho chảy qua cột nhồi chất hấp lưu, các cấu tử cần quan tâm được lưu giữ lại trên chất hấp lưu, còn các chất cản trở không bị lưu giữ được thải loại ra khỏi cột theo dòng chảy, sau đó chất cần quan tâm được rửa giải ra khỏi cột nhờ dung môi thích hợp, hay ngược lại các chất cản trở được lưu giữ trên chất hấp lưu còn các cấu tử cần quan tâm không bị lưu giữ chảy ra khỏi cột

c Quá trình chiết

Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau:

* Phương pháp 1: Quá trình chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết

Soxhlet: đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi

* Phương pháp 2: Chiết ngâm

Trang 23

Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra (chiết nguội) Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian

Thông thường bình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục, bởi mẫu được ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ, sau lấy chất chiết ra Cần lưu ý, sau khi chiết 3 lần dung môi, cặn thu được hầu như không còn chứa những chất gì nữa Việc kết thúc quá trình được xác định bằng một số cách như:

- Với các ancaloit, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này bằng sự tạo kết tủa với những tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer

- Với các flavonoit thường là những chất màu, nên khi dịch chảy ra mà không có màu thì cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết

- Trong trường hợp các lacton của sequitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng Kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat, sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và

từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy tuỳ thuộc mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp, và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao

1.3 Các phương pháp sắc ký [12], [13]

Phương pháp tách chất bằng sắc ký được bắt đầu từ năm 1903 Năm 1903 nhà bác học người Nga Taxvet đã dùng cột nhôm oxít để tách các picmen của lá cây thành các chất riêng biệt Ông đã giải thích hiện tượng này bằng ái lực hấp phụ khác của các sắc tố và đặt tên là phương pháp sắc ký (Chromatograply) Năm 1931 Vinterstin và Lederer đã dùng phương pháp của Taxvet tách carotin thô thành  ,  carotin và nhận thấy giá trị của phương pháp về phương pháp điều chế, phương pháp này mới được nghiên cứu và phát triển nhanh chóng

Trang 24

Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay Chúng được sử dụng để phân lập và xác định các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất tồn tại trong thiên nhiên nói riêng

Sắc ký bao gồm pha tĩnh và pha động Trên thế giới hiện nay phổ biến là

sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ, như silica gel, YMC, CDS , Al2O3 ) Còn pha động được dùng trong sắc ký lỏng là các dung môi hữu cơ , trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực lớn, và ngược lại chất ít bị phân cực sẽ tan tốt hơn trong dung môi kém phân cực hơn Có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi theo dãy tăng dần độ phân cực của dung môi như sau: Ete dầu hoả, xiclohexan, cacbontetraclorua, xylen, toluene, benzen, clorofoc, metylen clorua, axeton, đioxan, etylaxetal, piridin, propanol, methanol, axít axetic

1.3.1 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và pha tĩnh ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

n=n#bC/(1+bC)

n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n#: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó b: hằng số; C: nồng độ

1.3.2 Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong phương pháp sắc kí pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc kí thành các nhóm lớn: sắc kí

Trang 25

khí và sắc kí lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc kí người ta chia thành các phương pháp sắc kí chủ yếu sau:

a Sắc ký cột (CC)

Đây là phương pháp phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silica gel (độ hạt khác nhau) Pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianoin Chất hấp phụ được nhồi vào cột Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng nó phản ánh số đĩa lý thuyết càng lớn và do đó khả năng tách càng cao và ngược lại

Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm Trong một số trường hợp khi lực trọng trường không đủ lớn thì gây nên hiện tượng tắc cột Khi đó người ta phải sử dụng áp suất với áp suất trung bình (HPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ giữa chiều cao cột (L) so với đường kính cột cột (D) rất quan trọng và thể hiện khả năng tách của cột tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi được của dung môi gọi

là Rf, với mỗi chất sẽ có một Rf khác nhau

Chính nhờ vào sự khác nhau về Rf mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (từ 1/5 đến 1/10) còn nếu tách tinh thì yêu cầu tỷ lệ này cao hơn và tuỳ thuộc vào hệ số tách (tức là tùy thuộc vào sự khác nhau về R f của các chất), hệ số này dao động trong khoảng 1/20 đến 1/30)

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào hiện tượng và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương

Trang 26

pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy khô thì phổ biến là người ta phải tẩm chất vào siica gel rồi làm khô, tới khi hoàn toàn rồi đưa lên cột

Nếu tách tinh, người ta hay đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan trọng có 2 cách đưa chất hấp phụ lên cột

+ Một là nhồi cột khô, theo cách này chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để cho chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy qua cột đến khi cột trong suốt

+ Hai là nhồi cột ướt: Tức là chất hấp phụ được lắc đều trong dung môi, chạy cột trước sau đó đưa dầu vào cột đến khi đủ lượng cần thiết

Việc chuẩn bị cột hết sức quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả tách Yêu cầu cột không được có bọt khí bên trong (điều này gây nên hiện tượng chảy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và các cột không được nứt, gãy Tốc

độ dòng của dung môi cũng ảnh hưởng đến kết quả tách Nếu tốc dộ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Tuy nhiên nếu tốc độ dòng chảy thấp quá sẽ làm kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

b Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài việc sử dụng SKLM để định hướng cho sắc ký cột, người ta còn sử dụng SKLM để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, sau khi chạy sắc ký, người ta có thể tạo riêng silica gel rồi giải hấp bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện trên bản

Trang 27

mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc

sử dụng dung dịch axit sunfuric 10%

1.4 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [16]

Cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất mà người

ta sử dụng những phương pháp phổ cụ thể nào Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các chất phải dựa vào các phương pháp bổ xung khác nhau như chuyển hoá hoá học,kết hợp với các phương pháp sắc ký so

sánh…

1.4.1.Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

Phổ hồng ngoại được xác định dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Chính vì vậy việc phân tích phổ hồng ngoại là nhằm chỉ rõ nguồn gốc các vân hấp phụ cơ bản trên phổ

Từ đó cho biết các nhóm nguyên tử trong phân tử (đặc biệt là nhóm chức) và rút

ra những kết luận về cấu trúc phân tử, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH

tự do trong nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1, của nhóm ete C-O-C trong khoảng 1020-1100 cm-1, của nhóm C=C trong khoảng 1630-1650 cm-1, N-H (3400-3500 cm-1) v.v Đặc biệt vùng dưới 700 cm-1 được gọi là vùng vân tay được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mặc dù vậy lượng chất cần thiết để thực hiện phép đo phổ này ( được nghiền và ép viên mỏng với KBr bằng máy

ép thủy lực dưới áp suất khoảng 13-15 at ) lại cần từ 2-3 mg và khó thu hồi lại Chính vì vậy thông thường đối với các hợp chất thiên nhiên thì phổ hồng ngoại

Trang 28

được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ hạt nhân hay phổ khối lượng

1.4.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)

Nói một cách đơn giản máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện 3 nhiệm vụ cơ bản là: Chuyển chất nghiên cứu thành thể khí, tạo ra các ion phân

tử và ion mảnh Từ khí đó, phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/ze) của chúng Bởi vì e là điện tích của một electron, được lấy là 1 nếu các ion có Z>1 là rất nhỏ Do đó tỷ số m/z thường chính là khối lượng của ion vì thế phổ thu được có tên là phổ khối lượng viết tắt

+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectrometry) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chum ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV

+ Phổ ESI (Electron Spray Ionization Mass Spectometry) gọi là phổ phun

mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI – MS , do đó phổ thu đựơc chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

+ Phổ FAB (Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử

Trang 29

+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Ressolution Mass Spectroscopy) cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao Kết quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức cộng của hợp chất hữu cơ

Phân tích phổ khối lượng là quy kết cho mỗi pic trên phổ 1 mảnh phân tử xác định và chỉ ra sự tạo thành ion mảnh đó, từ đó rút ra những kết luận về cấu tạo phân tử

+ Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc

ký kết hợp với khối phổ Phương pháp này đặc biệt hiệu quả khi sử dụng thư viện phổ để so sánh nhận dạng các hợp chất Có thể sử dụng phương pháp sắc

ký khí - khối phổ viết tắt là GC-MS (Gass Chromatography Mass Spectrometry) cho các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu trên cơ sở nối ghép máy sắc ký khí với máy phổ khối lượng Toàn bộ hệ thống GC-MS được nối với máy tính để tự động điều khiển hoạt động của hệ, lưu trữ và xử lí số liệu Ngoài ra còn sử dụng phương pháp sắc ký lỏng-khối phổ, viết tắt là LC-MS (Liquid Chromatogroply Mass Spectrometry) cho các hợp chất khác Sắc ký lỏng phân giải cao là một phương pháp hữu hiệu để phân tách các hỗn hợp phức tạp Đặc biệt là khi nhiều hợp phần trong hỗn hợp đó có độ phân cực lớn (nhất là phân tích thuộc trong ngành dược) Ưu điểm của hệ thống LC-MS cũng giống như hệ thống GC-MS

ở hệ thốngL-MS người ta phải áp dụng những kỹ thuật đặc biệt để loại những dung môi phân cực dùng cho sắc ký lỏng trước khi chuyển sang máy phổ khối lượng Toàn bộ quy trình vận hành và ghi kết quả được tự động điều khiển bởi computer

Định dạng
Số trang	59
Dung lượng	1,87 MB