Nghiên cứu một số thành phần hoá học của cây bách bệnh (eurycoma longifolia jack)

Ngày nay với những phương pháp và thiết bị thử hoạt tính sinh học hiện đại với độ nhạy và độ tin cậy cao người ta có thể kiểm tra hoạt tính sinh học của hàng triệu mẫu dịch chiết từ thực

(EURYCOMA LONGIFoLIA JACK)

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Hà nội – 2009

(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)

Khóa luận tốt nghiệp đại học

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

TS Nguyễn Văn Bằng

Lời cảm ơn

Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện tại phòng xúc tác hữu cơ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Trước tiên, em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo- TS Nguyễn Văn Bằng, khoa Hóa học- Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình, tận tâm hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Em trân trọng cảm ơn và bày tỏ lòng kính trọng tới sự giúp đỡ tận tình của thầy giáo- TS Phan Văn Kiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô trong bộ môn Hóa hữu cơ-Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 và các cán bộ phòng xúc tác hữu cơ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã ủng hộ và tận tình chỉ bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Mặc dù em đã hết sức cố gắng nhưng khóa luận tốt nghiệp vẫn còn một số sai sót Vì vậy, em kính mong nhận được sự góp ý chỉ bảo của các thầy, cô và các bạn sinh viên quan tâm

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2009 Sinh viên

Trần Thị Huyền

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan các kết quả trong khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu

một số thành phần hóa học của cây Bách bệnh” dưới sự hướng dẫn khoa

học của thầy giáo- TS Nguyễn Văn Bằng, là hoàn toàn trung thực, do tôi nghiên cứu ra mà không hề sao chép của ai Nếu có bất kỳ vấn đề gì không đúng tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục hình, sơ đồ và bảng biểu

Trang Mở đầu 1 Chương 1: Tổng quan 3 1.1 Những nghiên cứu tổng quan về cây Bách bệnh………… 3

1.1.1 Thực vật học……… 3

1.1.2 Phân bố, sinh thái……… 4

1.1.3 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Bách bệnh……… 4

1.1.4 Bộ phận dùng ……… 7

1.1.5 Tác dụng dược lý……… 7

1.1.6 Tính vị và công năng……… 7

1.2 Các phương pháp chiết mẫu thực vật……… 7

1.2.1 Chọn dung môi chiết……… 8

1.2.2 Quá trình chiết……… 10

1.3 Các phương pháp sắc ký……… 11

1.3.1 Sắc ký cột……… 12

1.3.2 Sắc ký lớp mỏng……… 13

1.4 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ………

14 1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)……… 14

1.4.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)……… 15

1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear MagnetiResonance Spectroscopy)……… 16

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu 20 2.1 Dụng cụ và thiết bị……… 20

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết……… 20

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc……… 20

2.2 Hóa chất……… 21

2.3 Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất……… 21

2.4 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất……… 24

2.4.1 Hợp chất 1 (11-Dehydroklaineanone) 24

2.4.2 Hợp chất 2 (9-Methoxycanthin-6-one)………… 24

Chương 3: Kết quả và thảo luận 26 3.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (11-Dehydroklaineanone )……… 26

3.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (9-Methoxycanthin-6-one)……… 33 3.3 Tổng hợp các hợp chất đã phân lập được từ cây Bách

Danh mục chữ viết tắt

13

C- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Two-Dimensional NMR

CC Sắc ký cột (Column Chromatography)

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron

Electron Impact Mass Spectrometry

FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh

Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao

High Resolution Fast Atom Bombardment Mass

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

Danh mục hình, sơ đồ và bảng biểu

Trang

Hình 1.1 Cây Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack)……… 3

Hình 1.2 Một số cấu trúc đặc trưng có trong thành phần hóa học của cây Bách bệnh……… 6

Hình 3.1.a Cấu trúc hóa học của hợp chất 1……… 26

Hình 3.1.b Phổ 1H-NMR của hợp chất 1……… 27

Hình 3.1.c Phổ 13C-NMR của hợp chất 1……… 27

Hình 3.1.d Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của hợp chất 1……… 28

Hình 3.1.e Phổ HSQC của hợp chất 1……… 28

Hình 3.1.f Phổ HMBC của hợp chất 1……… 29

Hình 3.1.g Phổ ESI - MS của hợp chất 1……… 30

Hình 3.2.a Phổ 1H-NMR của hợp chất 2……… 32

Hình 3.2.b Cấu trúc hóa học của hợp chất 2……… 33

Hình 3.2c Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất 2……… 33

Hình 3.2d Phổ 13C-NMR của hợp chất 2……… 35

Hình 3.2.e Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của hợp chất 2……… 35

Bảng 3.1.Kết quả phổ NMR của hợp chất 1 và 11-Dehydroklaineanone……… 31

Bảng 3.2 Kết quả phổ NMR của hợp chất 2 và 9-Methoxycanthin-6-one……… 36

Bảng 3.3 Bảng tổng hợp các hợp chất đã phân lập từ phân đoạn Clorofoc……… 37

Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết các phân đoạn lá cây Bách bệnh……… 21

Sơ đồ 2: Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết……… 22

Mở đầu

Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đóng một vai trò hết sức quan trọng trong đời sống con người Các chất có hoạt tính sinh học được sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho con người, vật nuôi, các thuốc bảo vệ thực vật, các chất kích thích, điều hòa sinh trưởng động thực vật và làm nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm

Không như những nguồn tài nguyên hóa thạch khác (các loại quặng, khoáng vật, dầu mỏ, khí đốt,…) tài nguyên sinh học (cụ thể là tài nguyên thực vật) có thể tái tạo được Bảo vệ và sử dụng hợp lí nguồn tài nguyên này thì nó không bị cạn kiệt, trái lại chúng ta có thể làm phong phú hơn về lượng và chất

để phục vụ con người

Ngày nay với những phương pháp và thiết bị thử hoạt tính sinh học hiện đại với độ nhạy và độ tin cậy cao người ta có thể kiểm tra hoạt tính sinh học của hàng triệu mẫu dịch chiết từ thực vật, các chất được tách sạch từ các dịch chiết trong một thời gian ngắn Bởi vậy đã phát hiện ra nhiều hoạt tính quý giá của nhiều hợp chất thiên nhiên mà trước đây cho là không có hoạt tính Ví dụ: axit betulenic và các dẫn xuất của nó là những hợp chất phổ biến trong một số loài thực vật vừa được phát hiện có hoạt tính chống HIV

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa Độ ẩm cao

C, do khí hậu như vậy nên tài nguyên sinh vật của nước ta vô cùng phong phú và đa dạng, đặc biệt là tài nguyên rừng Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong phú vào loại bậc nhất trên thế giới với khoảng 12000 loài, trong đó có 4000

loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược [1] Đó là một nguồn tài nguyên

dược liệu vô cùng quý giá và cũng là chỉ tiêu nghiên cứu của các nhà khoa học;

là một tiền đề cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta để phục vụ cho con người trong lao động và sản xuất

Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc có giá trị cao của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lí, hiệu quả Trên cơ sở đó, tôi lựa chọn

đề tài: “Nghiên cứu một số thành phần hóa học của cây Bách bệnh

(Eurycoma Longifolia Jack)”

Cây Bách bệnh (Eurycoma Longifolia Jack) thuộc họ Thanh thất (Simaroubaceae) là một trong những đối tượng nghiên cứu quan trọng Bách bệnh được dùng nhiều trong bài thuốc chữa khí hư, huyết kém, ăn uống không tiêu, xương yếu, chân tay đau yếu, rễ cây chữa sốt, sốt rét, chữa ngộ độc và say rượu, giun sán, vỏ cây dùng làm thuốc bổ, chữa ăn uống không tiêu,…

Nhiệm vụ của khóa luận

bằng các phương pháp phổ

CHƯƠNG 1: Tổng quan

1.1 Những nghiên cứu tổng quan về cây Bách bệnh.[2]

1.1.1 Thực vật học:

Cây Bách bệnh có tên trong dân gian là cây Mật nhân hay cây Bá

bệnh và tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack

Hình 1.1 Cây Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack)

Bách bệnh thuộc loại cây trung bình, cao 2- 8m, ít phân cành Lá cây dạng kép gồm 21- 25 lá nhỏ sánh đôi đối nhau, hình mác hoặc bầu dục, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt dưới có lông màu trắng xám, cuống lá màu nâu đỏ Cụm hoa mọc ở ngọn thành chùm kép, hoa màu đỏ nâu, mỗi hoa có 5-6 cánh rất nhỏ, hoa nở vào tháng 3-4; cây kết quả vào tháng 5- 6, quả non màu xanh, khi chín đổi sang màu đỏ sẫm, quả hình trứng, dài 1- 2cm, ngang 0,5- 1cm

1.1.2 Phân bố, sinh thái:

Eurycoma Jack là chi nhỏ gồm những đại diện là cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam á Vùng Đông Nam á có 3 loài và một vài dưới loài, trong đó đáng chú ý nhất là loài Bách bệnh phân bố rộng rãi từ Myanmar đến các nước Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, đảo Sumatra ở Việt Nam, Bách bệnh phân bố rải rác ở các tỉnh vùng núi thấp (dưới 1000m) và vùng trung du Các tỉnh Tây Nguyên và miền Trung gặp nhiều hơn các tỉnh phía Bắc

1.1.3 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Bách bệnh

Cây Bách bệnh là cây thuốc nổi tiếng Cây chữa được nhiều chứng bệnh (nên có tên là Bách- nghĩa là 100) Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Bách bệnh nhằm khai thác triệt để tiềm năng y học của cây thuốc quý này Năm 1970, ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về hoá học của cây Bách bệnh, các nghiên cứu này được thực hiện bởi các tác giả L.V Thoi, N.N

Suong [4], kết quả nghiên cứu cho thấy trong thành phần hoá học của cây

2,6-dimethoxybenzoquinone và dihydroeurycomalactone

Năm 1982, các tác giả Muchsin Darise, Hiroshi Kohda, Kenji Mizutani

và Osamu Tanaka [5] đã tiến hành những nghiên cứu về thành phần hoá học

của rễ Bách bệnh, kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy trong thành phần của

rễ cây Bách bệnh có chứa: Eurycomanone, eurycomanol và

giả tại Việt Nam cũng đã có những nghiên cứu tiếp theo về thành phần hoá học của cây Bách bệnh, kết quả nghiên cứu cho thấy trong thành phần cây

Bách bệnh của Việt Nam có eurycomalactone, campesterol;

2,6-dimethoxybenzoquinone và dihydroeurycomalactone, 7-methoxy-

-carboline-1-propionic acid [4]

Năm 1983, nhóm tác giả Muchsin Darise [6] tiến hành các nghiên cứu

-sitosterol; 9-hydroxycanthin-6-one-N-oxide

Năm 1991, Itokawa, H., Kishi, E., Morrita, H [8], tìm thấy có hợp chất mới Eurylen có hoạt tính độc tế bào trong thành phần hoá học của Bách bệnh Cùng thời gian này nhóm tác giả K L Chan, S Lee, T W Sam và d B

-dihydroxyklaineanone từ cây Bách bệnh

Năm 2001, nhóm tác giả Suratwadee Jiwajinda, Vilai Santisopasri [10]

đã nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây Bách bệnh,

đã phân lập được: longilactone; 6-dehydroxylongilactone;

Năm 2002, Hooi Hoon Ang, Yukio Hitotsuyanagi [11] đã phân lập

được Eurycolactone E, Eurycolactone F, Eurycolactone B và Eurycomalactone

Năm 2003, nhóm tác giả Ping Chung Kuo và cs [12] đã phân lập và xác

định cấu trúc hoá học được 3 hợp chất mới: n-pentyl-carboline-1-propionate; 5-hydroxymethyl-9-methoxycanthin-6-one và 1-hydroxy-9-methoxycanthin-6-one và 9-methoxycanthin-6-one; canthin-6-one đã biết từ cây Bách bệnh Các hợp chất phân lập được đã được tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc

tế bào in vitro và hoạt tính chống sốt rét in vitro Kết quả thử nghiệm cho

thấy hợp chất 9-methoxycanthin-6-one; canthin-6-one thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư phổi và dòng tế bào ung thư vú

Hình 1.2 Một số cấu trúc đặc trưng có trong thành phần hoá học của cây Bách bệnh

O

O

HO

O HO

HO

OH OH

HO

OH OH

HO

OH OH O

OH OH

HO

OH OH

O

3  ,18-dihydroeurycomanol

O O

O OH

O OH

12-Epi-11-dehydroklaineanone

O O

OH HO

OH

OH O

Longilactone

O O

OH HO

O

OH O

O

Eurycolactone F

1.1.4 Bộ phận dùng: Rễ cây, thân cây, quả, vỏ cây, lá cây

1.1.5 Tác dụng dược lý [1]

- Cao chiết từ Bách bệnh có tác dụng kháng kí sinh trùng sốt rét trong

thử nghiệm nuôi cấy in vitro

- Bách bệnh có tác dụng tăng dục, có mối tương quan giữa hoạt tính kích thích sinh dục nam và lượng nội tiết tố sinh dục nam trong huyết thanh Thân và rễ Bách bệnh làm tăng lượng testosteron trong huyết thanh động vật,

rễ làm tăng testosteron nhiều hơn thân cây

- Một chế phẩm thuốc gồm 3 dược liệu: Bách bệnh, Trâm bầu và Xấu hổ

có độc tính cấp diễn và trường diễn thấp Thuốc có tác dụng lợi mật rõ rệt và không làm thay đổi thành phần của mật ở Chuột lang Thuốc làm thải trừ BSP

của gan Thỏ so với đối chứng

- Chế phẩm thuốc này có tác dụng làm chậm quá trình hư biến của gan Chuột cống trắng gây nên do carbon tetraclorid Nó cũng làm tăng sự tái tạo của tế bào gan Chuột nhắt trắng trong mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm

1.1.6 Tính vị và công năng [2]

Rễ thường dùng nhất để chữa khí hư, huyết kém, ăn uống không tiêu, trong ngực có cục tích, gân đờ, xương yếu, tay chân đau yếu

Nhân dân thường dùng rễ chữa sốt, sốt rét, chữa ngộ độc và say rượu, giun sán Vỏ, thân làm thuốc bổ, chữa ăn uống không tiêu, nôn

Quả dùng để chữa tiêu chảy, lá dùng để nấu nước tắm, trị ghẻ, ngứa

1.2 Các phương pháp chiết mẫu thực vật [4,5]

Sau khi tiến hành thu hái và sấy mẫu, tùy thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực vừa phải…)

mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.2.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp người ta không chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phối hợp một tỉ lệ nhất định để tạo

ra một hệ thống dung môi mới Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận Nó cần hòa tan những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất khác có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylnitrat

và tributylphotphat Những chất này có thể hòa lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa

Metanol và clorofoc thường chứa dioctylphtalat, [di-(2- etylhexyl) phtalat hoặc bis- 2- etylhexyl- phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật Chất này còn thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Clorofoc, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây ( như lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…)

với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm khác Tương tự như vậy sự có mặt của một lượng nhỏ axit Clohidiric (HCl) cũng có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước, hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác Bởi vì Clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi khô thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào

Trái lại, clorofoc khả năng phân cực thấp hơn, có thể rửa, giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng sẽ bị hòa tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước dường như có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết Ví dụ trechlonolide A thu được từ

metyl hóa khi đun nóng với methanol chứa một ít axit và quá trình phân hủy

1- hydroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythroxylum novogranatense được

chiết trong metanol nóng

Người ta thường ít khi sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây

mà thay vào đó là dung dịch nước của metanol

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit

dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây ra phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit- bazơ có thể tạo ra những sản phẩm mong muốn Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự thủy phân chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không

hơn

1.2.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dưới đáy để tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi có thể nóng hoặc lạnh Trước kia, máy chiết ngâm đòi hỏi là phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thủy tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ và sau đó chất chiết được lấy ra Cần lưu ý, sau một quá trình chiết 3 lần dung môi, cặn thu được sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau Bởi vì khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra khỏi bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Dragendorff và tác nhân Mayer Cũng vậy, các Flavonoid thường là những hợp chất màu và bởi vậy khi dịch chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu là đã rửa hết những chất này trong quá trình chiết Khi chiết các chất béo, nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó

sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết trong trường hợp các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể được sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy tùy thuộc mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp

1.3 Các phương pháp sắc ký [4,5]

Phương pháp tách chất bằng sắc ký được bắt đầu từ năm 1903 Năm

1903 nhà bác học người Nga Txvet đã dùng cột nhôm ôxit để tách các picmem của lá cây thành các chất riêng biệt Ông đã giải thích hiện tượng này bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên là phương pháp sắc ký (chromatography) Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung

và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

Sắc ký bao gồm pha tĩnh và pha động Trên thế giới hiện nay phổ biến là

sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ như: silica gel,

lỏng), hay chất khí (sắc ký khí ) Pha động được dùng trong sắc ký lỏng là các dung môi hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực hơn, và ngược lại chất ít phân cực sẽ tan tốt trong dung môi kém phân cực hơn Có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi theo dãy tăng dần độ phân cực của dung môi như sau: ete dầu hỏa, xiclohexan, cacbontetraclorua, xylen, toluen, benzen, clorofoc, metylenclorua, axeton, dioxan, etylaxetat, piridin, propanol, metanol, axit axetic

Nguyên tắc căn bản được sử dụng trong phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp phụ Độ phân cực của dung môi tăng dần từ ete dầu hỏa đến nước Tùy thuộc vào cách tiến hành sắc

ký mà người ta chia ra thành các phương pháp sắc ký chủ yếu như sau:

1.3.1 Sắc ký cột

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silica gel (độ hạt khác nhau) pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Dianion, v.v… Chất hấp phụ được nhồi vào cột (có thể cột bằng

thủy tinh hay cột bằng kim loại inox, nhưng phổ biến nhất là cột thủy tinh)

Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa

lý thuyết càng lớn và do đó khả năng tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm Trong một số trường hợp, khi lực trọng trường không đủ lớn thì gây hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng và thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi được của dung môi

so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (dao động từ 1/5 đến 1/10), còn nếu tách tinh thì yêu cầu tỷ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách ( tức là tùy thuộc vào sự

1/30

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến người ta phải tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột Nếu tách tinh, thì người ta hay đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với một lượng tối thiểu Việc nhồi cột (bằng chất

- Một là nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để cho chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy qua cột đến khi cột trong suốt

- Hai là nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được lắc đều trong dung môi chạy cột trước, sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết

- Việc chuẩn bị cột hết sức quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả tách Yêu cầu cột không được có bọt khí bên trong (điều này gây nên hiện tượng chảy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gẫy

- Tốc độ dòng chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Tuy nhiên nếu tốc

độ dòng chảy thấp quá sẽ làm kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thủy tinh Ngoài việc sử dụng SKLM để định hướng cho sắc ký cột, người ta còn sử dụng SKLM để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng silica gel rồi giải hấp bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn

tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch axit sufuric 10%

1.4 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [3]

Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng hợp chất

mà người ta sử dụng những phương pháp phổ cụ thể Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta còn phải dựa vào các phương pháp bổ xung khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh…

1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Chính vì vậy, việc phân tích phổ hồng ngoại là nhằm chỉ rõ nguồn gốc các vân hấp phụ cơ bản trên phổ, từ đó cho biết các nhóm nguyên tử trong phân tử (đặc biệt là nhóm chức) và rút ra những kết luận về cấu trúc phân tử, ví dụ như dao động

, N-H

được gọi là vùng vân tay được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mặc dù vậy lượng chất cần để thực hiện phép đo phổ này (nghiền và ép viên với KBr bằng máy ép thủy lực dưới áp suất 13-15 atm) lại cần từ 2- 3mg

và khó thu hồi lại Chính vì vậy, thông thường đối với các hợp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ nhân hay phổ khối lượng

1.4.2.Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS)

Nói một cách đơn giản máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện

ba nhiệm vụ cơ bản là: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí; tạo ra các ion phân tử và ion mảnh từ khí đó; phân tách các ion đó rồi lại ghi tín hiệu theo tỷ

lệ khối lượng trên điện tích (m/ze) của chúng Bởi vì e là điện tích của một electron, được lấy là 1, nên các ion có z >1 là rất nhỏ, do đó tỷ số m/z thường chính là khối lượng của ion Vì thế phổ thu được có tên là phổ khối lượng viết tắt là phổ MS (Mass Spectroscopy)

Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này

là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học của các hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng Những phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:

+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectrometry) dựa vào

sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác nhau phổ biến là 70 eV

+ Phổ ESI (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) gọi là phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá

vỡ

+ Phổ FAB (Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do

đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử

+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectrometry), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao

Kết quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức cộng của hợp chất hữu cơ

Phân tích phổ khối lượng là quy kết cho mỗi pic trên phổ một mảnh phân tử xác định và chỉ ra sự tạo thành ion mảnh đó, từ đó rút ra những kết luận về cấu tạo của phân tử

Hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký kết hợp với khối phổ Phương pháp này đặc biệt hiệu quả khi sử dụng thư viện phổ để

so sánh nhận dạng các hợp chất Có thể sử dụng phương pháp sắc ký khí- khối phổ viết tắt là GC-MS (Gas Chromatography – Mass Spectrometry) cho các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu, trên cơ sở nối ghép máy sắc ký khí với máy phổ khối lượng Toàn bộ hệ thống GC-MS được nối với máy tính để tự động điều khiển hoạt động của hệ, lưu trữ và xử lý số liệu Ngoài ra còn sử dụng phương pháp sắc ký lỏng-khối phổ, viết tắt là LC-MS (Liquid Chromatogroply – Mass Spectrometry) cho các hợp chất khác Sắc ký lỏng phân giải cao là một phương pháp hữu hiệu để phân tách các hỗn hợp phức tạp, đặc biệt là khi nhiều hợp phần trong hỗn hợp đó có độ phân cực lớn (nhất

là phân tích thuốc trong ngành dược) Ưu điểm của hệ thống LC – MS cũng giống như hệ thống GC – MS ở hệ thống LC –MS người ta phải áp dụng những kỹ thuật đặc biệt để loại những dung môi phân cực dùng cho sắc ký lỏng trước khi chuyển sang máy phổ khối lượng Toàn bộ quá trình vận hành

1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên lí chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ cacbon)

từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin- spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling)

a) Phổ 1 H- NMR (Proton Magnetic Resonance Spectroscopy)

xác định trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hóa học khác nhau Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất

b) Phổ 13 C- NMR (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo

C- NMR cũng được tính bằng ppm với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton ( từ 0 ppm đến 240 ppm)