Nghiên cứu một số thành phần hoá học của cây thiên lý (telosma cordata (burm f ) merrill)

Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ nguồn thực vật này để ứng dụng trong Y học, hóa học và các mục đích khác trong cuộc sống của con người, là một trong n

LờI CảM ƠN

Trước tiên với sự biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn TS Lê Minh Hà người đã hướng dẫn, và chỉ bảo tận tình cho em trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận ở phòng Hóa Công Nghệ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện khoa học công nghệ Việt Nam

Em xin chân thành biết ơn sự giúp đỡ to lớn và quý báu đó

Em cũng xin chân thành cảm ơn tới ban lãnh đạo cùng cán bộ phòng Hóa công nghệ, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận này

Với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn chân thành, em xin cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Văn Bằng, thầy đã định hướng cho em từ những bước đi đầu tiên, hướng dẫn em tận tình trong suốt quá trình học tập tại trường và hoàn thành khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Hoá học-Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo dựng cho em những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường

Hà Nội, tháng 5 năm 2009

Sinh viên

Nguyễn Thị Nguyệt Nga

LờI CAM ĐOAN

Đề tài: “ Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Thiên lý” là công

trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Lê Minh

MụC LụC Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Những chữ viết tắt

Danh mục các hình vẽ và bảng biểu

Trang

Mở đầu 1

CHƯƠNG 1 TổNG QUAN tài liệu 3

1.1 Giới thiệu về thực vật họ Thiên lý 3

1.1.1 Vài nét về họ Thiên Lý 3

1.1.3 Công dụng và tác dụng dược lý của cây Thiên Lý 7 1.2 Tổng quan về phương pháp chiết mẫu thực vật 9

1.2.2 Cơ sở của quá trình chiết 9

1.2.3 Qúa trình chiết thực vật 10

1.3.1 Cơ sở của phương pháp sắc ký 13 13

1.3.2 Phân loại các phương pháp sắc ký 13 13 1.4 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc

của các hợp chất thiên nhiên 17 17

1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) 17 17

1.4.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) 17 17

1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 19 19

CHƯƠNG 2 ĐốI TƯợNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 23 23

2.1 Mẫu thực vật 23 23 2.2 Các dòng tế bào nghiên cứu 23 23

2.3 Phương pháp xử lý mẫu thực vật 23 23

2.4 Các phuơng pháp sắc ký để phân lập các chất từ dịch chiết 23

2.5 Các phương pháp hoá lý để nhận dạng cấu trúc 23 23

2.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính độc tế bào 24 24

3.3.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 28 28

3.3.3 Hoạt tính chống oxi hoá 29 29

3.5 Xác định cấu trúc các hợp chất 31 31

3.5.1 Dữ kiện phổ của kaempferol 3-O-õ-D-glucopyranoside (1) 31 31

3.5.2 Dữ kiện phổ của chất Quercetin 3-O-õ-D-glucopyranoside (3) 31 31

4.1 Thu hái và xác định tên khoa học cây Telosma cordata 33 33

4.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học cặn chiết của Thiên lý 35 35

4.3.1 Kết quả thử hoạt tính độc tế bào 35 36

4.3.2 Kết quả thử hoạt tính chống oxi hoá 36 37

4.4 Chiết tách, phân lập các hợp chất từ cặn chiết metanol

lá cây thiên lý 38 38 4.5 Xác định cấu trúc các chất 38 38 4.5.1 Xác định cấu trúc chất 1 38 38 4.5.2 Xác định cấu trúc chất 2 41 41

DANH MụC NHữNG CHữ VIếT TắT

 D Độ quay cực (Specific Optical Botation)

13

C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Cacbon–13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H- 1 H COSY 1H– 1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều

Two – Pimensional NMR

CC Sắc ký cột (Column Chromatography)

DEPT Distortionless Enhancement By Polarisation Trasfer ESI – MS Phổ khối lượng phun mù điện tử

Electron Spray Ionization Mass Spectranetry

FAB – MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh

Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivily

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR – FAB – MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao

Hight Resolution Fast Atom Bombardment Mass

Spectrometry

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

Me Nhóm Metyl

NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

Hep- G2 Dòng tế bào ung thư gan (Hepatocelluar carcinoma)

Danh mục các hình vẽ và bảng biểu

Trang

Hình 1.1.a Một số cây họ Thiên lý 4

Hình 1.1.b Một số cây họ Thiên lý 5

Hình 1.1.c Cây Thiên Lý (Telosma coradata (Burm.f.) Merrill) 6

Hình 4.1 Cây Thiên lý (Telosma cordata) 33

Hình 4.2 Cấu trúc của chất 1 40

Hình 4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của chất 1 40

Hình 4.4 Phổ cộng hưởng từ các bon 13C-NMR của chất 1 41

Hình 4.5 Cấu trúc của chất 2 42

Hình 4.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của chất 2 43

Hình 4.7 Phổ cộng hưởng từ các bon 13C-NMR của chất 2 47

Bảng 4.1 Hàm lượng các cặn chiết từ lá cây Thiên lý 34

Bảng 4.2 Kết qủa thử hoạt tính độc tế bào cặn chiết metanol lá cây Thiênlý………36

Bảng 4.3 Kết quả thử hoạt tính chống oxi hoá dịch chiết metanol lá cây Thiên lý………37

Bảng 4.4 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các cặn chiết của T cordata……… 37

Sơ đồ 4.1 Qui trình chiết các phân đoạn từ Telosma cordata 35

Sơ đồ 4.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây T cordata……….38

Mở ĐầU

I Lí do chọn đề tài

Thuốc chữa bệnh là một thành phần không thể thiếu trong cuộc sống Từ

xa xưa cho đến nay, con người đã biết sử dụng cây cỏ vào việc điều trị bệnh Mặc dù các loại thuốc tây y chiếm một phần lớn trong phương pháp điều trị nhưng thuốc có nguồn gốc thảo dược vẫn giữ một vị trí hết sức quan trọng Việt Nam được đánh giá là nước thứ 16 trên thế giới về sự phong phú và

đa dạng sinh vật Trong đó thảm thực vật đa dạng và phong phú vào loại bậc nhất trên thế giới Hiện nay, đã biết 10.386 loài thực vật bậc cao có mạch, dự đoán có thể là 12.000 loài Trong số này, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30% Theo tài liệu của Pháp, trước năm 1952 toàn Đông Dương chỉ biết có 1350 loài cây thuốc nằm trong 160 họ thực vật Sách

“Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của GS Đỗ Tất Lợi (1999) giới thiệu 800 cây con và vị thuốc Sách “Cây thuốc Việt Nam” của Lương Y Lê Trần Đức (1997) có ghi 830 cây thuốc Cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của TS Võ Văn Chi (1997) đã thống kê khoảng 3200 loài cây thuốc, nhưng chắc chắn đây không phải là những con số cuối cùng [1], [2]

Nguyên nhân của sự phong phú đó trước hết là do nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có khí hậu nóng ẩm quanh năm, độ ẩm cao (trên 80%), lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15-270

C thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây cỏ Do đặc điểm khí hậu và vị trí địa lí thuận lợi nên tài nguyên thực vật nước ta vô cùng phong phú và đa dạng Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ nguồn thực vật này để ứng dụng trong Y học, hóa học và các mục đích khác trong cuộc sống của con người, là một trong những nhiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và nền Y học cổ truyền dân tộc với các phương thuốc đông y cùng với y học hiện đại đã và đang có những đóng góp to lớn trong việc phòng và chữa bệnh, tăng cường tuổi thọ cho con người, nâng cao chất lượng cuộc sống Các phương thuốc y học cổ truyền đã thể hiện những mặt mạnh trong điều trị bệnh là ít độc tính và tác dụng phụ Chính vì vậy việc tìm hiểu, nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất trong hệ thực vật nước ta sẽ là

cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và sử dụng cây thuốc một cách hợp lí và mang lại hiệu quả cao

Cây Thiên lý (hay còn gọi là Hoa lý, Dạ lài hương) tên khoa học là

Telosma Cordata (Burm f.) Merrill là cây thuốc được trồng phổ biến ở nước

ta và thường được sử dụng để phục hồi cơ thể do thiếu ngủ, làm tăng cường sinh lực nhanh Cây có nhiều tác dụng dược lý trong dân gian nhưng cho đến nay vẫn ít công trình nghiên cứu về loại thảo dược này

Xuất phát từ những lý do thực tiễn trên và mong muốn làm phong phú

thêm nguồn kiến thức và loại cây này, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành

phần hóa học của cây Thiên lý (Telosma Cordata)”

2 Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu

- Thu hái và xác định tên khoa học cây Thiên lý

- Thăm dò hoạt tính sinh học

- Phân lập một số hợp chất từ lá cây Thiên Lý

- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

đã phân lập được bằng các phương pháp phổ

CHƯƠNG 1 TổNG QUAN tài liệu 1.1 Giới thiệu về thực vật họ Thiên lý

1.1.1 Vài nét về họ Thiên lý [1], [2]

ở Việt Nam, họ Thiên lý (Asclepiadaceae) được biết đến với 21 chi, 41

loài (Võ Văn Chi, 1998), trong đó phần lớn các thực vật đều ở dạng dây leo có

lá mọc đối nhau, thân cây có nhựa mủ mầu trắng [1]

Trong họ Thiên lý, chi Telosma được biết gồm 2 loài: T procumbens

và T cordata Cây T procumbens (Cam thảo Đá Bia) được tìm thấy trong các

khu rừng rậm có độ cao thấp ở Philipin, Việt Nam và Trung Quốc ở Việt Nam, toàn cây được dùng như chất long đờm và dùng thay cho cam thảo do vị

ngọt của nó Cây T cordata (Burm f.) Merrill Việt nam gọi là cây Thiên lý,

được trồng ở nhiều nơi chủ yếu ở miền Bắc để làm cảnh, hoa và lá còn dùng

để ăn Cây còn mọc ở ấn độ, Malaixia, Thái lan, Trung quốc và Philipin Theo

y học dân gian, hoa và lá của nó có tác dụng giải nhiệt, an thần, giúp ngủ ngon và chữa mệt mỏi đau lưng Lá dùng ngoài trị mụn nhọt, các vết loét, trị bệnh trĩ và sa dạ con có kết quả[2]

Ngoài chi Telosma, họ Thiên lý còn được biết đến với chi Dischidia gồm 5 loài: D formosana, D majo, D nummularia , D acuminata và D rafflesiana Việt nam mới chỉ thấy có duy nhất cây D acuminata Cost với tên gọi là tai

chuột hay dây hạt bí, phân bố chủ yếu ở vùng núi Việt nam Theo y học dân gian, toàn cây này được sử dụng để chữa bệnh viêm nhiễm, viêm đường tiết niệu và một số bệnh phụ khoa Cây được dùng dưới dạng thuốc sắc hoặc dùng ngoài lấy lá tươi giã đắp lên vết thương chống viêm nhiễm [2] Dưới đây là một vài hình ảnh minh họa một số cây họ Thiên lý (hình 1.1.a, hình 1.1.b) [14]

1 Cây bông tai 2 Bòng bòng to 3 Gai quả

(Asclepias curassavica) (Calotropis gigantea) (Gomphocarpusfruiticosus)

7 Hà thủ ô trắng 8 Hà thủ ô nam 9 Bạc căn Klein

(Streptocaulon griffithii) (Streptocaulon juventas) (Streptocaulon

kleinii)

10 Tiền quả Spire 11 Tiền quả Wight 12 Đầu đài mảnh

(Toxocarpus sperei) (Toxocarpus wightianus) (Tylophora tenuis)

13 Bòng bòng to trắng 14 Song ly, dây hạt bí 15 Tiết căn, dây không

lá (Calotropis gigantea) (Dischidia acuminata) (Sarcostemma acidum)

Hình 1.1.b Một số cây họ Thiên lý

1.1.2 Giới thiệu về cây Thiên Lý [1], [2], [5]

* Cây Thiên lý (Telosma cordata (Burm f.) Merrill) [2]

Thiên lý còn gọi là cây hoa lý hay dạ lài hương

Tên khoa học : Telosma cordata (Burm f.) Merrill

Thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae)

Hình 1.1.c Cây Thiên lý ( Telosma coradata (Burm f.) Merrill) Thiên lý là một loài cây nhỏ, mọc leo, thân hơi có lông, nhất là ở những

bộ phận còn non Lá hình tim, thuôn, khía mép ở khoảng 5-8mm về phía cuống, đầu lá nhọn, có lông trên các gân lá Phiến lá dài 6-11cm, rộng 4-7,5cm, cuống cũng có lông, dài 12-20mm Hoa khá to, nhiều, màu vàng xanh lục nhạt rất thơm mọc thành xim dạng tán ở nách lá, có cuống to, hơi có lông dài

10-22mm, mang nhiều tán mọc mau liền với nhau Qủa là những đại dài 9,5cm; rộng 12-14mm Hạt dài 1,5cm, có mào lông dài 3cm ( Hình 1.1.c)

* Phân bố, sinh thái

Chi Telosma gồm một số loài là dây leo quấn, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu á ở Việt Nam,

có 2 loài, đều là cây thuốc và rau ăn

Thiên lý phân bố từ các tỉnh phía Nam Trung Quốc bao gồm cả đảo Hải Nam đến Việt Nam, Lào, Campuchia và một số nước khác ở Đông Nam á ở Việt Nam, Thiên lý được trồng rải rác khắp các tỉnh thuộc

đồng bằng và trung du Bắc Bộ Còn được trồng làm cảnh ở các thành phố

Thiên lý là cây ưa sáng và ưa ẩm, sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới Nhiệt độ trung bình từ 210C đến

240C, rụng lá vào mùa đông Do đó ở các vùng núi cao trên 1500 m như Sapa,

do có nhiệt độ quanh năm thấp nên không trồng được loại cây này Hàng năm, vào tháng 3- 4 từ các phần thân cành đã rụng lá, mọc ra nhiều chồi non Khi chồi nảy mầm sinh trưởng nhanh sau 2 tháng đã có chiều dài gần 2m Hoa Thiên lý xuất hiện ngay sau khi cây mọc chồi, đồng thời ra lá non Hoa nở rộ trong thời gian 15- 20 ngày, thụ phấn nhờ côn trùng, thường là loại kiến đen chui vào ăn mật hoa Thiên lý ra hoa nhiều, nhưng ít khi đậu quả, trừ những cây trồng lâu năm ở nơi dãi nắng Hạt có mào lông, phát tán nhờ gió

Thiên lý có khả năng tái sinh dinh dưỡng khoẻ về mùa đông, cây thường bị chặt đốn bớt phần thân, cành già, phần còn lại tiếp tục tái sinh

* Bộ phận dùng: Lá, rễ, thu hái quanh năm Hoa lấy vào mùa hè và quả vào

mùa thu đông, phơi hay sấy khô

1.1.3 Công dụng và tác dụng dược lý của Thiên Lý [1], [5]

* Công dụng:

Hoa Thiên lý còn gọi là dạ lý hương, dạ lài hương Người ta đã phân tích

thành phần dinh dưỡng có trong hoa Thiên lý như chất xơ là 3%, chất đạm 2,8%, và gồm chất bột đường, các vitamin như C, B1, B2, PP và tiền vitamin

A (caroten), cùng các khoáng chất cần cho cơ thể như calcium, phospho, sắt, đặc biệt là kẽm (Zn) có hàm lượng khá cao, vì vậy cây Thiên lý cả lá non, ngọn và hoa đều là thực phẩm quý có tác dụng bổ dưỡng giúp trẻ chóng lớn, lại giúp người già giảm được chứng phì đại tuyến tiền liệt, làm tăng cường sức đề kháng cho người Cây được trồng làm cảnh, cho leo giàn để làm thuốc

và lấy rau ăn Người ta thường dùng hoa Thiên lý xào hay nấu canh ăn bổ, mát giúp ngủ ngon, không trằn trọc, bớt đi đái đêm và đỡ mệt mỏi, đau lưng

* Tác dụng dược lý :

Hoa và lá được dùng trị viêm kết mạc cấp và mãn tính, viêm giác mạc, mờ đục màng mắt, viêm kết mạc do bệnh sởi Lá dùng ngoài giã đắp lên các mụn nhọt, vết loét, trị lòi dom và sa dạ con Rễ cây được dùng để chữa đái buốt có máu hoặc có cặn trắng

Đông y cho rằng hoa Thiên lý có vị ngọt tính bình, giải nhiệt, chống rôm sảy, là một vị thuốc an thần, làm ngủ ngon giấc, tư bổ tâm, thận, bớt đi đái đêm, đỡ mệt mỏi đau lưng, có tính chống viêm và làm tan màng mộng, thúc đẩy chóng lên da non, được sử dụng trị liệu trong các chứng như viêm kết mạc cấp và mãn, viêm giác mạc và mờ đục màng mắt, viêm kết mạc do sởi, trị giun kim

Sau đây là một số các bài thuốc dân gian từ cây hoa Thiên lý :

- Phòng rôm sảy ngày hè: Hằng ngày nấu canh hoa Thiên lý ăn Với trẻ có thể nghiền lá và hoa Thiên lý ra nấu lẫn với bột khi cho trẻ ăn dặm

- Trị giun kim: Lấy lá Thiên lý non nấu canh cho trẻ ăn liền từ 7-10 ngày sẽ hiệu quả

- Chữa lòi dom, sa dạ con: Lấy 1 nắm lá Thiên lý rửa sạch, giã nát cho vào muối ăn 5%, vắt lấy nước cốt tẩm vào bông rịt vào hậu môn, hay âm hộ ngày thay 1- 2 lần, sử dụng liền 5- 7 ngày sẽ có tác dụng co dần phần dom hay dạ con lòi ra

- Làm giảm đau mình mẩy, nhức xương cốt: Hằng ngày lấy hoa Thiên lý xào với thịt bò hoặc chấm với muối vừng ăn sẽ có tác dụng

- Làm thư giãn sau các buổi làm việc căng thẳng, người khoan khoái, ngủ dễ ngon giấc, đỡ mệt mỏi, giảm tiểu đêm: Hằng ngày lấy hoa Thiên lý nấu canh

- Chữa đinh nhọt: Lấy lá cây Thiên lý 30-50g giã nhỏ đắp vào chỗ mụn nhọt, ngày thay 1 lần, vài ba ngày sẽ khỏi

- Chữa đái buốt, đái ra máu, đái dắt, cặn trắng: Lấy rễ Thiên lý từ 10-20g sắc lấy nước uống 2-3 lần trong ngày

1.1.4 Các nghiên cứu về cây Thiên lý ở Việt nam và trên thế giới

Cho đến nay, trên thế giới chúng tôi chưa thấy có một nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Thiên lý ở Việt Nam, theo GS Đỗ Tất Lợi và GS Ngô Văn Thu khảo sát sơ bộ thấy trong rễ

và lá Thiên lý có alcaloid và chúng tôi là nhóm đầu tiên đặt vấn đề nghiên cứu

về loài cây này

1.2 Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật [9], [11]

1.2.1 Phương pháp chiết

* Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly

các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hòa tan với nó

* Mục đích của chiết

+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu

+ Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên

1.2.2 Cơ sở của quá trình chiết

Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hòa tan lẫn với nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng

Quá trình chiết dựa trên đinh luật Nerst:

KA= CA/ CB KA: hằng số phân

bố

CA, CB: nồng độ các chất hòa tan trong chất lỏng A, B không hòa tan lẫn vào nhau

1.2.3 Quá trình chiết thực vật

a, Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác

nhau Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp, người ta không chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phải phối hợp một tỷ lệ nhất định

để tạo ra một hệ dung môi mới Tuy nhiên nhiều thành phần tan trong nước ít được quan tâm Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận Nó cần hoà tan những chất chuyển hoá thứ cấp trong nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Nếu chúng có lẫn các tạp chất khác có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như đianlkylphatalat, tri-n-butyl-axetylhidrat và tributylphotphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa

Metanol và clorofoc thường chứa đioctylphatalat [đi-(2- etylhexyl) phtalat hoặc bis-2- etylhexyl-phtalat] Chất này có thể làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật Chất này còn thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây

Clorofoc, điclometan và metanol là những dung môi thường sử dụng trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như (lá, thân, rễ, củ, hoa)

Những tạp chất của clorofoc như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác

Tương tự như vậy sự có mặt của một lượng nhỏ axít HCl cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác Bởi vì clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo léo cẩn thẩn ở nơi thông thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc Điclometan ít độc hơn và dễ bay hơi hơn Clorofoc

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon

Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào

Trái lại, clorofoc khả năng phân cực thấp hơn, có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng sẽ bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước dường như có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ

bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng metanol trong suốt quá trình chiết

* Chiết lỏng- lỏng

Chiết lỏng- lỏng là một kĩ thuật tách đơn giản nhất và trung thực nhất Nó được sử dụng để làm sạch hoặc để tách một cấu tử riêng hoặc một loại các cấu tử khỏi mẫu mẹ Mẫu rắn hoặc lỏng được chiết bằng dung môi hữu cơ thích hợp Đối với các mẫu nước dung môi chiết phải không tan trong nước Độ phân cực của dung môi nằm trong một khoảng rộng từ các ankan như pentan, hexan, hoặc xiclohexan đến nitrobenzene và n-butanol, cũng như các dung môi có clo (đặc biệt là điclometan, clorofom) là một thuận lợi cho việc tách

Có hai quá trình chiết lỏng- lỏng khác nhau: chiết không liên tục (chiết đoạn) và chiết liên tục

* Chiết lỏng- rắn

Chiết lỏng- rắn được áp dụng để tách các chất phân tích ra khỏi mẫu vật rắn (thực vật, đất, các mẫu sinh học…) bằng dung môi thích hợp Chất phân tích trong mẫu vật rắn thường nằm ở thành nang nhỏ hoặc phân tán trong chất rắn, vì vậy cần nghiền nhỏ để tăng bề mặt tiếp xúc giữa dung môi

và chất phân tích Tuỳ thuộc vào tính phân cực của chất cần tách ta lựa chọn dung môi chiết, bắt đầu từ những dung môi hidrocacbon nhẹ đối với những chất ít phân cực đến những dung môi phân cực lớn như đietyl ete, axeton, etanol kể cả nước đối với những chất phân cực Qúa trình chiết lỏng- rắn có thể tiến hành theo phương pháp chiết đoạn hay chiết liên tục

* Chiết pha rắn

Chiết pha rắn là quá trình chiết bao gồm một pha rắn và một pha lỏng Các cấu tử cần quan tâm và các chất cản trơ nằm trong pha lỏng Khi cho chảy qua

cột nhồi chất hấp lưu, các cấu tử cần quan tâm được lưu giữ lại trên chất hấp lưu, còn các chất cản trở không bị lưu giữ được thải loại ra khỏi cột theo dòng chảy, sau đó chất cần quan tâm được rửa giải ra khỏi cột nhờ dung môi thích hợp, hay ngược lại các chất cản trở được lưu giữ trên chất hấp lưu còn các cấu

tử cần quan tâm không bị lưu giữ chảy ra khỏi cột

c, Qúa trình chiết

Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau:

* Phương pháp 1: Quá trình chiết sử dụng một

loại thiết bị là bình chiết Soxhlet: đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra Dùng thiết bị này

để chiết nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi

* Phương pháp 2: Chiết ngâm

Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra (chiết nguội) Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức

và thời gian

Thông thường bình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục, bởi mẫu được ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ, sau lấy chất chiết ra Cần lưu ý, sau khi chiết 3 lần dung môi, cặn thu được hầu như không còn chứa những chất

gì nữa Việc kết thúc quá trình được xác định bằng một số cách như:

- Với các ancaloit, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này bằng sự tạo kết tủa với những tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, Mayer

- Với các flavonoit thường là những chất màu, nên khi dịch chảy ra mà không có màu thì cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết

- Trong trường hợp các lacton của sesquitecpen

và các glicozit trợ tim, phản ứng kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat, sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy tuỳ thuộc mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp, và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao

1.3.Tổng quan về các phương pháp sắc ký [7], [12], [13]

Phương pháp tách chất bằng sắc ký được bắt đầu từ năm 1903 Năm

1903 nhà bác học người Nga Taxvet đã dùng cột nhôm oxít để tách các picmen của lá cây thành các chất riêng biệt Ông đã giải thích hiện tượng này bằng ái lực hấp phụ khác của các sắc tố và đặt tên là phương pháp sắc ký (Chromatograph) Năm 1931 Vinterstin và Lederer đã dùng phương pháp của Taxvet tách carotin thô thành ,  carotin và nhận thấy giá trị của phương pháp về phương pháp điều chế, phương pháp này mới được nghiên cứu và phát triển nhanh chóng

Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay Chúng được sử dụng để phân lập và nhận dạng các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất tồn tại trong thiên nhiên nói riêng

Sắc ký bao gồm pha tĩnh và pha động Trên thế giới hiện nay phổ biến là

sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ như silicagel, YMC, CDS, Al2O3…) Còn pha động được dùng trong sắc ký lỏng là các dung môi hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực lớn, và ngược lại chất ít bị phân cực sẽ tan tốt hơn trong dung môi kém phân cực hơn Có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi theo dãy tăng dần độ phân cực của dung môi như sau: Ete dầu hoả, xiclohexan, cacbontetraclorua, xylen, toluene, benzen, clorofoc, metylen clorua, axeton, đioxan, etylaxetat, piridin, propanol, metanol, axit axetic

1.3.1 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và pha tĩnh ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh

có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc ký thành các nhóm lớn: sắc ký khí và sắc ký lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc ký người ta chia thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

a, Sắc ký cột

Đây là phương pháp phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silicagen (độ hạt khác nhau) Pha thường cũng như pha đảo YMC, ODS, Đianoin Chất hấp phụ được nhồi vào cột Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng nó phản ánh số đĩa lý thuyết càng lớn và do đó khả năng tách càng cao và ngược lại

Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm Trong một số trường hợp khi lực trọng trường không đủ lớn thì gây nên hiện tượng tắc cột Khi đó người ta phải sử dụng áp suất với áp suất trung bình (HPC) và áp suất cao (HPLC)

Trong sắc ký cột, tỷ lệ điều kiện cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng và thể hiện khả năng tách của cột tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc ký, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi được của dung môi gọi là

Rf, với mỗi chất sẽ có một Rf khác nhau

Chính nhờ vào sự khác nhau về Rf mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (từ 1/5 đến 1/10) còn nếu tách tinh thì yêu cầu tỷ lệ này cao hơn và tuỳ thuộc vào hệ số tách

Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào hiện tượng và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là người ta phải tẩm chất vào siicagen rồi làm khô, tới khi hoàn toàn rồi đưa lên cột Nếu tách tinh, người ta hay đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan trọng có 2 cách đưa chất hấp phụ lên cột

+ Một là nhồi cột khô, theo cách này chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để cho chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy qua cột đến khi cột trong suốt

+ Hai là nhồi cột ướt: Tức là chất hấp phụ được lắc đều trong dung môi, chạy cột trước, sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết

Việc chuẩn bị cột hết sức quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả tách Yêu cầu cột không được có bọt khí bên trong (điều này gây nên hiện tượng chảy dồn trong cột và giảm hiệu quả tách) các cột không được nứt, gãy Tốc độ dòng của dung môi cũng ảnh hưởng đến kết quả tách Nếu tốc dộ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Tuy nhiên nếu tốc độ dòng chảy thấp quá sẽ làm kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

b, Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagen trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài việc sử dụng SKLM để định hướng cho sắc ký cột, người ta còn sử dụng SKLM để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, sau khi chạy sắc ký, người ta có thể tạo riêng silicagel rồi giải

hiện trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch axit sunfuric 10%

1.4 Tổng quan chung về các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [4], [8]

Cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất

mà người ta sử dụng những phương pháp phổ cụ thể nào Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các chất phải dựa vào các

phương pháp bổ xung khác nhau như chuyển hoá hoá học

1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

Phổ hồng ngoại được xác định dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Chính vì vậy việc phân tích phổ hồng ngoại là nhằm chỉ rõ nguồn gốc các vân hấp phụ cơ bản trên phổ Từ đó cho biết các nhóm nguyên tử trong phân tử (đặc biệt là nhóm chức) và rút ra những kết luận về cấu trúc phân tử, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong nhóm hyđrôxyl là 3300-3450cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750cm-1, của nhóm ete C-O-C trong khoảng 1020-1100 cm-1, của nhóm C=C trong khoảng 1630-1650 cm-1

, N-H (3400-3500cm-1) v.v Đặc biệt vùng dưới 700cm-1

được gọi là vùng vân tay được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mặc dù vậy lượng chất cần thiết để thực hiện phép đo phổ này tương đối lớn Chính vì vậy thông thường đối với các hợp chất thiên nhiên thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng

1.4.2 Phổ khối lƣợng(Mass Spectroscopy)

Nói một cách đơn giản máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện 3 nhiệm vụ cơ bản là: Chuyển chất nghiên cứu thành thể khí, tạo ra các ion phân tử và ion mảnh Từ khí đó, phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo

tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/zc) của chúng Bởi vì electron là điện tích của một electron, được lấy là 1 nếu các ion có Z >1 là rất nhỏ Do đó tỷ số m/z thường chính là khối lượng của ion vì thế phổ thu được có tên là phổ khối lượng viết tắt là phổ MS

Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hoá học của hợp chất thiên nhiên Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác nhau mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng Những phương pháp chủ yếu được nêu dưới đây

+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectrometry) dựa vào

sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV

+ Phổ ESI (Electron Spray Ionization Mass Spectometry) gọi là phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá

+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy) cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao Kết quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức cộng của hợp chất hữu cơ

Phân tích phổ khối lượng là quy kết cho mỗi pic trên phổ 1 mảnh phân

tử xác định và chỉ ra sự tạo thành ion mảnh đó, từ đó rút ra những kết luận về cấu tạo phân tử

+ Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký kết hợp với khối phổ Phương pháp này đặc biệt hiệu quả khi sử dụng thư viện phổ để so sánh nhận dạng các hợp chất Có thể sử dụng phương pháp sắc

ký khí-khối phổ viết tắt là GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectrometry) cho các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu trên cơ sở nối ghép máy sắc ký khí với máy phổ khối lượng Toàn bộ hệ thống GC-MS được nối với máy tính để

tự động điều khiển hoạt động của hệ, lưu trữ và xử lí số liệu Ngoài ra còn sử dụng phương pháp sắc ký lỏng- khối phổ, viết tắt là LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) cho các hợp chất khác Sắc ký lỏng phân giải cao là một phương pháp hữu hiệu để phân tách các hỗn hợp phức tạp Đặc biệt là khi nhiều hợp phần trong hỗn hợp đó có độ phân cực lớn (nhất là phân tích thuộc trong ngành dược) Ưu điểm của hệ thống LC-MS cũng giống như hệ thống GC-MS ở hệ thống LC-MS người ta phải áp dụng những kỹ thuật đặc biệt để loại những dung môi phân cực dùng cho sắc ký lỏng trước khi chuyển sang máy phổ khối lượng Toàn bộ quy trình vận hành

và ghi kết quả được tự động điều khiển bởi computer

1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear

Magnetic Resonance Spectroscopp, NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ biến hiện đại và