Nghiên cứu một số thành phần hoá học của cây chạc chìu (tetracera scandens)

Năm 2004, trong một cuộc khảo sát của một nhóm tác giả ở cả Việt Nam và Nhật Bản với đối tượng là 96 cây thuốc dân tộc với khoảng 288 dịch chiết khác nhau đã nhận thấy các phần dịch chiế

TS Nguyễn tiến đạt

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Phan Văn Kiệm đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn

TS Nguyễn Văn Đạt cùng các cán bộ phòng xúc tác hữu cơ đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong quá trình hoàn thành khoá luận

Em cũng xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Bằng và các thầy giáo, cô giáo khoa hoá học trường đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ em trong thời gian học tập, tu dưỡng tại

trường

Dù có nhiều cố gắng nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, kính mong sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô và bạn đọc để khoá luận của em được hoàn chỉnh hơn

Hà Nội, tháng 5 năm 2009

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong khoá luận là trung thực Các kết quả không trùng với bất cứ công trình đã được công bố Tôi xin chịu trách nhiệm trước lời cam đoan của tôi

Sinh viên

Phùng thị lan anh

======================================================================================================

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 4

K31A - Hoá

======================================================================================================

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 5

K31A - Hoá Mục lục Trang Lời cảm ơn Lời cam đoan mục lục Những chữ viết tắt Danh mục các hình và các bảng Mở đầu……… 1

Chương 1: tổng quan……… … … 3

1.1 Sơ lược về họ Sổ và Chi tetracera……… 3

1.2 Sơ lược về cây Chạc chìu 3

1.2.1 Giới thiệu chung……… 3

1.2.2 Hình thái thực vật và phân bố……… 5

1.2.3 Tác dụng dược lý của cây Chạc chìu……… 5

1.2.4 Thành phần hoá học có trong Chạc chìu ……… 7

1.3 Tổng quan về lớp chất flavonoid ……… …… 7

1.3.1 Giới thiệu chung về flavonoid ……… 7

1.3.2 Cấu trúc và phân loại ……… 9

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu……… 10

2.1 Đối tượng nghiên cứu……… 10

2.2 Các phương pháp nghiên cứu ……… 10

2.2.1 Phương pháp chiết ……… 10

2.2.2 Các phương pháp sắc kí ……… 14

======================================================================================================

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 6

K31A - Hoá 2.2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ ……… 18

Chương 3: Thực Nghiệm……… ……… 22

3.1 Phương pháp tách chiết……… ……… 22

3.2 Các phương pháp phổ……… ……… 22

3.3 Phân lập các chất……… 22

3.3.1 Quá trình phân lập các chất……… 22

3.3.2 Một số thông số vật lý của hai hợp chất thu được trong cây Chạc chìu 3

Chương 4: kết quả và thực nghiệm 25

4.1 Xác định cấu trúc hoá học của hai hợp chất thu được trong cây Chạc chìu 25

Kết luận……… 36

Tài liệu tham khảo……… 37

HSQC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

EI – MS Phổ khối lượng bắn phá bằng điện tử

ESI – MS Phổ khối lượng phun mù điện tử

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

======================================================================================================

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 9

K31A - Hoá Danh mục các hình và các bảng Trang I Danh mục các hình: Hình 1.1: Cây Chạc chìu ……… 4

Hình 4.1.1: Phổ ESI-MS của 1 ……… 27

Hình 4.1.2: Phổ 1H-NMR của 1……… 27

Hình 4.1.3: Phổ 13 C-NMR của 1……… 28

Hình 4.1.4: Phổ DEPT của 1……… 28

Hình A: Cấu trúc hoá học của Quercetin……… 29

Hình 4.1.5: Phổ ESI-MS của 2 ……… 32

Hình 4.1.6: Phổ 1 H-NMR của 2 ……… 33

Hình 4.1.7: Phổ 13 C-NMR của 2 ……… 34

Hình 4.1.8: Phổ DEPT của 2 ……… 35

Hình B: Cấu trúc hoá học của 2 35

II Danh mục các bảng: Bảng 1.2.4a: Năm isoflavone có trong cây Chạc chìu……… 7

Bảng 4.1: Số liệu phổ 1 H và 13C-NMR của 1 ……… 25

Bảng 4.2: Số liệu phổ 1 H và 13C-NMR của 2 ……… 30-31

đã được khoa học y dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng Nhiều loại thuốc được chiết xuất từ dược liệu Việt Nam như Rutin, D Strophantin, berberin, Palmatin, các sản phẩm tinh dầu … đã được sử dụng rộng rãi trong nước

và xuất khẩu Tuy nhiên nguồn tài nguyên thiên nhiên ấy vẫn chứa đựng nhiều bí

ẩn và là mục tiêu nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước

Ngày nay trên các nước, nhất là các nước phát triển, với tốc độ nghiên cứu ồ

ạt cộng với sự hỗ trợ của khoa học kĩ thuật phát triển, những nước này đang lâm vào tình trạng kiệt quệ về tài nguyên thiên nhiên và có xu hướng tập trung nghiên cứu khám phá tài nguyên thiên nhiên của những nước nghèo Chính vì vậy nghiên cứu và khai thác những nguồn tài nguyên thực vật trong nước một kho dược liệu khổng lồ đang chờ được khám phá hiện đang là vấn đề cấp bách không chỉ ở nước

ta Với sự phong phú và đa dạng sinh học, tài nguyên thực vật nước ta hứa hẹn sẽ

là nơi phát triển nhiều hợp chất chứa các hoạt tính quý báu giúp ích cho yêu cầu về các loại thuốc mới, hiệu quả và đặc hiệu trong điều trị những căn bệnh hiểm nghèo hiện nay

Cây Chạc chìu là một cây thuốc quý, được sử dụng rộng rãi trong dân gian

để chữa nhiều bệnh như ghẻ lở, bệnh lậu, phù thũng có nguồn gốc từ gan và thận

có tác dụng hạ nhiệt, trị sốt, bổ máu Ngoài ra cây còn được dùng để trị các bệnh như viêm ruột, kiết lị, tắc kinh ở phụ nữ

ở Việt Nam chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu một cách có hệ thống hoá học và hoạt tính sinh học của cây thuốc này Do đó chúng tôi đã lựa

chọn đối tượng nghiên cứu cho đề tài này là: “Nghiên cứu một số thành phần

hoá học của cây Chạc chìu (tetracera scandens (L.) Merr)’’

Nội dung chủ yếu của khóa luận gồm:

1 Nghiên cứu tách chiết các chất sạch từ cây Chạc chìu

2 Nghiên cứu xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất thu được

1.1 Sơ lựơc về họ Sổ và chi tetracera

Họ Sổ ( Dilleniaceae) là một họ gồm những loài cây gỗ đứng thẳng hoặc dây

leo thân gỗ Lá đơn, mọc cách, có gân bên song song và nổi rõ Hoa thường lưỡng

tính; lá đài thường 5; đôi khi nhiều hơn tới 20, xếp xoăn, bền, lợp lên nhau rất rõ;

cánh hoa thường 5, thường gấp nếp trong nụ và sớm rụng; nhị thường nhiều,

thường hợp thành 5 bó ( số nhị ở mỗi bó rất thay đổi, có khi chỉ có 1 nhị; có khi

các bó tiêu giảm đến chỉ còn 1 bó và nằm lệch về một bên, thành ra hoa có thể là

không đều do bộ nhị), phát triển theo kiểu li tâm Lá noãn thường nhiều và rời

Hiện nay theo ước tính họ Sổ có 18 chi gồm khoảng 530 loài, phổ biến ở

vùng nhiệt đới, ít ở cận nhiệt đới của 2 bán cầu ở Việt Nam có 2 chi chủ yếu là

Dillenia và Tetracera

Chi Tetracera là 1 chi thuộc họ Sổ có khoảng 50 loài khác nhau Riêng ở

Việt Nam có khoảng 5 loài gồm T akara; T India; T loureiri; T sarmentosa và

T scandens [Phạm Hoàng Hộ 1999, Watson 2006]

1.2 Sơ lược về cây Chạc chìu

1.2.1 Giới thiệu chung

Tên khoa học :

Tetracera scandens (L.) Merr

Hoa mọc thành chùm ở kẽ lá hay ở ngọn cành gồm nhiều hoa nhỏ màu trắng

Quả có lông, chứa 1-2 hạt, áo hạt có rìa màu đỏ

Mùa hoa vào tháng 6-8, mùa quả tháng 7-9 hàng năm

1.2.2.2 Phân bố

Chạc chìu phân bố chủ yếu ở các nước nhiệt đới Châu á, có mặt rộng rãi ở

hầu hết các nước đông Nam á, ấn độ, trung quốc ở Việt Nam, cây mọc phổ biến ở

các tỉnh thuộc vùng núi thấp ( nhỏ hơn 1000 m) và trung du

Cây ưa sáng và chịu hạn, mọc ở vùng rừng thứ sinh, ven rừng núi đá vôi,

hoặc đồi cây bụi Cây ra hoa hàng năm, xung quanh gốc cây mẹ có các cây con

mọc từ hạt

Chạc chìu là đối tượng chặt bỏ khi tu bổ rừng, song phần còn lại vẫn có khả

năng tái sinh chồi mới

1.2.3 Tác dụng dược lý của cây chạc chìu [Đỗ Huy Bích 2004, Đỗ Tất Lợi

1999, Võ Văn Chi 1997]

1.2.3.1 Công dụng

Theo y học dân tộc chạc chìu có vị chát, hơi chua, tính bình, mát có tác dụng

tán ứ, hoạt huyết, thu liễm, cố tinh Trong đông y, chạc chìu được dùng để chữa tê

thấp, ứ huyết, bạch đới ở phụ nữ, thông tiểu, chữa phù thận do gan, lá lách sưng to

Còn dùng làm thuốc bổ và tẩy máu ở Trung Quốc còn dùng dây chiều chữa viêm

ruột, kiết lị, di tinh

1.2.3.2 Tác dụng dược lý

Dùng nước sắc để rửa vết thương

Dịch của cây dùng chữa đau mắt và chữa rắn cắn

Một số bài thuốc trong Đông y có chạc chìu:

 Chữa phong thấp, gân xương đau nhức, khớp xương sưng đau: Dây chiều, huyết giác, cỏ xước hay ngưu tất, tổ rồng, tầm xuân, kim cang, dây đau xương, dây chìa vôi (ngâm nước vo gạo sau 1 đêm), sao vàng (mỗi vị 15-20 gam), sắc uống Hoặc dùng dây chiều phối hợp với dây gắm, thổ phục linh, cà gai leo, dây đau xương, ngũ gia bì

 Chữa kiết lị, đau bụng, đi ngoài ra máu: Dùng rễ sắc uống

 Chữa vết thương, lở loét, chảy nước vàng: Sắc lấy nước đặc rửa vết thương

 Chữa phụ nữ tích huyệt, u xơ gan hoặc gan lách sưng cứng: Dùng u Chạc chìu, ngải máu ( mỗi vị 20g) hồi, xạ can (mỗi vị 12g), sắc uống

 Chữa man di tinh, nữ bạch đới: Dây chiều, rễ bươm bướm, bạc san, cẩu tích, mỗi vị 20g, sắc uống

Mặc dù đông y, chạc chìu đã được dùng làm thuốc chữa bệnh từ lâu nhưng cho đến nay mới có rất ít nghiên cứu cụ thể về tác dụng sinh học của nó Năm

2004, trong một cuộc khảo sát của một nhóm tác giả ở cả Việt Nam và Nhật Bản với đối tượng là 96 cây thuốc dân tộc với khoảng 288 dịch chiết khác nhau đã nhận thấy các phần dịch chiết MeOH, MeOH – H2O ( 1:1 ), H2O của chạc chìu có tác dụng ức chế Xanthine Oxydase, một Enzim xúc tác cho sự hình thành axit Uric trong cơ thể gây nên bệnh Gout và các bệnh liên quan đến khớp như thấp khớp, viêm khớp [Nguyen 2004]

1.2.4 Thành phần hoá học có trong Chạc chìu

Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hoá học của Chạc chìu Năm 2008, lần đầu tiên một nhóm nghiên cứu ở Hàn Quốc, với mẫu thực vật thu hái ở Việt Nam, đã phân lập và xác định được cấu trúc 5 isoflavone từ phân đoạn EtOAc của dịch chiết MeOH Đó là các dẫn xuất của Genistein:

1.3 Tổng quan về lớp chất flavonoid

1.3.1 Giới thiệuchung về flavonoid

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phân bố rộng rãi nhất trong tự nhiên Nói chung flavonoid không có trong thực vật bậc thấp Theo quá trình tiến hoá thực vật, flavonoid bắt đầu xuất hiện ở 2 loại tảo vòng (lớp Charophyceae)

Chaca thuộc ngành Rêu (Bryophyta) và theo dòng tiến hoá, sự phân bố flavonoid

ngày càng nhiều và đa dạng

Trong thực vật hạt trần (Gymnosperm) có tương đối ít dạng flavonoid, hợp chất có tính đặc trưng là Biflavon, ngoài ra có ít flavon, flavonol và flavanonol là

các dẫn xuất C6 – hoặc C8 – Metyl

Trong thực vật hạt kín (Angiospermae), sự tiến hóa của flavonoid đạt đến

đỉnh cao và dẫn đến sự hình thành các nhóm flavonoid mới như Neoflavonoid, Auron, chromanocumaran…

Sự tiến hoá của flavonoid liên quan đến quá trình tiến hoá thực vật Từ các loài có gỗ sơ khai đến các loài cây bụi đã phát triển dẫn đến 3 sự thay đổi quan trọng về mặt cấu trúc flavonoid:

 Sự biến mất proanthoxyanidin trong lá

 Sự mất 3 nhóm OH ở vòng B

 Sự thay thế flavonol (quercetin) bởi flavon (luteonin)

Các dẫn xuất 8_Hydroxy của kaemferol và quercetin thấy phổ biến trong

Magnoliopsida (phân lớp Ngọc Lan), Rocidae (phân lớp Hoa hồng) và Dilleniae

(phân lớp Sổ), trong khi các dẫn xuất 6_Hydroxy tương ứng lại phân bố rộng trong phân lớp Cúc là phân lớp đã phát triển hơn so với các phân lớp trên về mặt tiến hoá thực vật

Cho đến nay đã có hơn 4000 flavonoid được tìm thấy từ thực vật Ban đầu chúng được phát hiện với vai trò là các sắc tố của thực vật vào mùa thu khi các loài

Như vậy flavonoid đặc trưng cho các loài sinh vật bậc cao song song với sự phân bố axit xinamic và lignin trong cây Flavonoid có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây như hoa, quả, rễ, thân, lá… và khu trú ở thành tế bào Nó tham gia vào sự tạo thành màu sắc của cây, đặc biệt là hoa

1.3.2 Cấu trúc và phân loại

Flavonoid là một nhóm hợp chất polyphenol, đa dạng về cấu trúc hoá học và tác dụng sinh học Chúng có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt trong các

tế bào thực vật quang hợp, chúng đóng vai trò là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản kiểu C6 – C3 – C6 với 2 vòng benzen A, B gắn với nhau qua dị vòng C Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxy tự do hoặc đã thay thế một phần Vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính axit Các polyphenol

có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxy để tạo thành các phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các Oza (dạng Glycozit) hoặc Protein

Dựa vào sự biến đổi trạng thái oxy hoá của phần C3 mà người ta phân loại Flavonoid thành 13 nhóm nhỏ bao gồm: flavon, flavonol, flavanon, flavanonol, isoflavonoid, chacon, dihydrochancon, auron, anthocyanidin, catechin, leucoanthocyanidin, rotenoid, neoflavonoid

Đối tượng nghiên cứu

Cây Dây chiều được thu hái vào tháng 09 năm 2007 tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc Mẫu cây được TS Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá học các hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các phương pháp nghiên cứu

Phương pháp chiết

Đặc điểm chung

a Khái niệm

Cơ sở của quá trình chiết

Cơ sở của quá trình chiết là dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không tan vào nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong pha lỏng

Quá trình chiết dựa trên định luật phân bố Nerst:

2.2.1.3.1 Hợp chất tự nhiên trong cây

Dựa vào chức năng sinh học, người ta chia các hợp chất trong cây thành hai nhóm lớn:

 Chất chuyển hoá sơ cấp (primary metabolite)

 Chất chuyển hoá thứ cấp (secondary metabolite)

Chất chuyển hoá thứ cấp là những chất mà vai trò chủ yếu của chúng không phải để nuôi sống và phát triển cây cỏ, chúng có thể có ở cây này và vắng mặt ở cây kia Có rất nhiều giả thiết về vai trò của chúng trong thực vật Có ý kiến cho rằng chúng là những chất thải, góp phần giải độc cho cây (ancaloid, tinh dầu), góp phần bảo vệ chống các tác nhân làm hại cây (flavonoid, saponin, tinh dầu, terpenoid…) v.v…

Do có tác dụng sinh lý và dược lý như tác dụng kháng sinh, diệt nấm, tác dụng ức chế hoặc gây độc đối với tế bào, tác dụng kích thích hoặc ức chế sinh trưởng và các tác dụng khác mà các chất trao đổi bậc hai là đối tượng nghiên cứu quan trọng trong các lĩnh vực như y dược học, nông nghiệp

Trong các hợp chất hữu cơ có tính chất hoá lý rất khác nhau, chúng tồn tại ở dạng hoà tan trong nước, dầu béo hoặc tinh dầu Các chất hoà tan trong nước (dịch

tế bào) là các hidrocacbon phân tử bé (monosacarit, oligosacarit), một số polysacarit (pectin, gôm), các glycozit (saponin, flavonoid…), muối ancaloid của các axit hữu cơ, axit hữu cơ, axit amin, muối amin Các chất tan trong dầu béo và tinh dầu là các hydrocacbon, monoterpen, secquiterpen, sterol, carotenoid và các dẫn xuất phenyl propanoid Dầu béo và tinh dầu được khu trú trong các bộ phận riêng biệt của cây như ở hạt (dầu béo), ở hạch tiết của lá, vỏ thân (tinh dầu)

Ngoài ra trong cây còn chứa các muối vô cơ Các muối vô cơ này ít tham gia vào tác dụng sinh lý của dược liệu, tuy nhiên đây chính là các nguồn nguyên tố vi lượng không thể thiếu đối với cây cỏ ở một số loài, các muối vô cơ cũng có một

======================================================================================================

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 23

K31A - Hoá

số tác dụng như tác dụng lợi tiểu của muối Kali (Natri) trong dâu ngô, tác dụng trị

vi khuẩn của lưu huỳnh trong họ Cải, tác dụng trị bướu cổ của các hợp chất iod của các loại tảo biển

Mặt khác trong cây cũng có mặt các loại enzyme, do đó trong quá trình nghiên cứu, nếu không khống chế sự hoạt động của các enzyme này thì các glycozit có thể bị thuỷ phân một phần hoặc toàn phần làm thay đổi tính phân cực,

do đó thay đổi độ hoà tan của hợp chất trong dung môi

2.2.1.3.2 Chọn dung môi chiết

Các hợp chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau, dung môi dùng cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận với các đặc điểm

là cần phải hoà tan tốt những chất đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), những dung môi này cần được chưng cất trước khi sử dụng vì nếu lẫn các chất khác sẽ làm ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Một số chất dẻo lẫn trong dung môi như

diankylphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrat, tributylphosphat… do trong quá trình sản

xuất hay bảo quản sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật Cloroform, etanol và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa…

Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được triệt để hơn các thành phần có trong tế bào Ngược lại, khả năng phân cực của chloroform thấp hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào

Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp, vì vậy khi chiết với ancol thì các chất này sẽ bị

Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau:

 Quá trình chiết sử dụng bình chiết Soxhlet

Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra, dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và để tiết kiệm dung môi

Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra (chiết nguội) Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật vì nó không đòi hỏi nhiều công sức Thông thường bình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục vì mẫu được ngâm trong dung môi khoảng 24h sau đó lấy chất chiết ra Việc kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một số cách như :

+ Với các ancanoid, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các hợp chất này

bằng sự tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như : Dragendorff, Mayer… + Với các flavonoid, do chúng thường là các chất màu nên khi dịch chảy ra không còn màu cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết

+ Trong trường hợp các lacton của secquiterpen và các glycozit trợ tim phản

ứng Kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho

======================================================================================================

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 25

K31A - Hoá

phản ứng với anilin axetat cho biết sự xuất hiện của các hydrocacbon và từ

đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy tuỳ thuộc vào mục đích cần lấy chất gì để lựa chọn dung môi thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao nhất

2.2.2 Các phương pháp sắc kí

2.2.2.1 Đặc điểm chung của các phương pháp sắc kí

Sắc kí là phương pháp vật lý dùng để tách riêng các thành phần ra khỏi hỗn hợp bằng cách phân bố chúng ra hai pha : Một pha có bề mặt rộng gọi là pha tĩnh (hay pha cố định) và pha kia là một chất lỏng hoặc khí gọi là pha động (hay pha di động) di chuyển đi qua pha tĩnh Trong quá trình sắc kí, pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, quá trình hấp phụ và giải hấp phụ lặp đi lặp lại Kết quả là các chất có ái lực lớn hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn so với chất tương tác yếu hơn Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí

2.2.2.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động

và pha tĩnh ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ dung dịch gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir :

nn b Cn / ( b C1)

Với :

n là lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n là lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

b là hằng số …

2.2.2.3 Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong phương pháp sắc kí, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc kí thành hai nhóm : sắc kí khí và sắc kí lỏng

được phát hiện bằng hai phương pháp :

 Với phương pháp hoá học, người ta dùng các thuốc thử hiện màu đặc trưng cho từng loại hợp chất Thuốc thử được pha thành dung dịch có nồng độ thích hợp rồi cho tác dụng lên giấy bằng cách phun lên bề mặt giấy hoặc nhúng giấy vào thuốc thử

 Với phương pháp vật lý, có thể hiện màu bằng cách soi đèn UV nhiều hợp chất hữu cơ hấp thụ được các tia cực tím

b Sắc kí lớp mỏng

======================================================================================================

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 27

K31A - Hoá

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tích dung dịch chất phân tích

di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tuỳ theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở các vị trí khác nhau Chất hấp phụ thường được sử dụng trong SKLM là Silicagel tráng trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Trong quá trình hấp phụ, sẽ xảy ra tranh giành giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ trên bề mặt chất hấp phụ, và khi đạt được cân bằng, mỗi chất tan sẽ ở một vị trí khác nhau trên bản mỏng

Để tiến hành sắc kí, chất tan được chấm lên bản thành từng vết chấm nhỏ, sấy cho dung môi bay hơi hết rồi triển khai với hệ dung môi thích hợp trong một bình triển khai kín Để kiểm tra vết chất có thể sử dụng thuốc thử hiện màu hoặc soi bằng đèn UV Thuốc thử hiện màu có thể là hơi ammoniac hoặc dung dịch axit sunfuric 10% Để hiện vết người ta nhúng bản vào thuốc thử hoặc phun lên bản mỏng sau đó hơ bản mỏng lên trên bếp điện hoặc sấy nóng để vết xuất hiện từ từ Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột

Một hình thức SKLM khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu hợp chất tự nhiên là SKLM điều chế, dùng để điều chế, thu chất trực tiếp ở phương pháp này, quá trình thực hiện tương tự SKLM và sau khi triển khai xong, soi đèn UV để xác định vết rồi cạo lấy lớp Silicagel chứa chất cần điều chế, tiến hành rửa giải để thu chất

Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại Silicagel (có kích thước hạt rất khác nhau) pha thường và pha đảo (YMC, ODS, Dianion) Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột thuỷ tinh)

Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì sẽ gây hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất để kích thích dung môi chảy (áp suất trung bình – MPC, áp suất cao – HPLC)

Tỷ lệ đường kính so với chiều cao cột (L/D) phụ thuộc vào yêu cầu tách (phụ thuộc vào lượng chất và chất cụ thể)

Tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi là Rf, với mỗi chất khác nhau giá trị Rf khác nhau Nhờ sự khác nhau này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp

Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào Silicagel rồi làm khô tơi hoàn toàn rồi sau đó đưa lên cột Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất vào dung môi chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

 Nhồi cột khô: Theo cách này chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô sau đó gõ nhẹ lên thành cột để đưa chất hấp phụ xếp chặt trong cột Dùng dung môi chạy cột để rửa giải

 Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Nếu tốc độ chạy quá chậm Thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

2.2.2.3.2 Sắc kí khí

Đây là phương pháp sắc kí dùng chất khí làm pha động Chất thử có thể là chất khí lỏng hoặc chất rắn được chuyển thành thể bay hơi và nhờ một luồng khí trơ làm chất tải dẫn đi qua pha tĩnh:

+ Nếu pha tĩnh là một chất rắn thì gọi là sắc kí khí – rắn

+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì gọi là sắc kí khí – lỏng

 ở sắc kí khí – rắn, chất rắn được dùng là những chất có tính hấp phụ như Silicagel, than hoạt tính, oxit nhôm

 ở sắc kí khí – lỏng, chất lỏng được phân tán mỏng như một lớp phim trên bề mặt một chất rắn trơ gọi là nền

Khi chất thử được khí tải dẫn đi qua pha tĩnh, chúng bị tách riêng ra tuỳ theo hệ số phân bố của mỗi thành phần trong hỗn hợp chất thử đối với pha tĩnh

2.2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Khi đã phân lập được một hợp chất hữu cơ, điều quan trọng là phải xác định được cấu trúc của chúng Để có thể thực hiện được điều này cần phân tích bằng nhiều phương pháp kết hợp với nhau

2.2.3.1 Đo điểm chảy