Các phương pháp sắc kí

2.2.2.1 Đặc điểm chung của các phương pháp sắc kí

Sắc kí là phương pháp vật lý dùng để tách riêng các thành phần ra khỏi hỗn hợp bằng cách phân bố chúng ra hai pha : Một pha có bề mặt rộng gọi là pha tĩnh (hay pha cố định) và pha kia là một chất lỏng hoặc khí gọi là pha động (hay pha di động) di chuyển đi qua pha tĩnh. Trong quá trình sắc kí, pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, quá trình hấp phụ và giải hấp phụ lặp đi lặp lại. Kết quả là các chất có ái lực lớn hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn so với chất tương tác yếu hơn. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.

2.2.2.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ dung dịch gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir :

nn b Cn. . / ( .b C1) Với :

n là lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.

n là lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó. b là hằng số …

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 26 K31A - Hoá

C là nồng độ của dung dịch

2.2.2.3 Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong phương pháp sắc kí, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc kí thành hai nhóm : sắc kí khí và sắc kí lỏng.

2.2.2.3.1 Sắc kí lỏng

Đây là phương pháp sắc kí dùng chất lỏng làm pha động. Trong sắc kí lỏng có các loại cụ thể sau:

a. Sắc kí giấy

Sắc kí giấy là phương pháp phân tích với pha tĩnh là một loại giấy đặc hiệu dùng trong sắc kí. Chất thử được chấm lên giấy rồi triển khai sắc kí bằng dung môi thích hợp trong một bình triển khai kín. Sau khi đã triển khai xong, giấy được làm khô rồi làm hiện màu để xác định các vết chất có trong hỗn hợp chất thử. Trừ các chất có màu có thể phát hiện ngay bằng mắt thường, các chất không màu có thể được phát hiện bằng hai phương pháp :

 Với phương pháp hoá học, người ta dùng các thuốc thử hiện màu đặc trưng cho từng loại hợp chất. Thuốc thử được pha thành dung dịch có nồng độ thích hợp rồi cho tác dụng lên giấy bằng cách phun lên bề mặt giấy hoặc nhúng giấy vào thuốc thử.

 Với phương pháp vật lý, có thể hiện màu bằng cách soi đèn UV nhiều hợp chất hữu cơ hấp thụ được các tia cực tím.

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 27 K31A - Hoá

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tích dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tuỳ theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở các vị trí khác nhau.

Chất hấp phụ thường được sử dụng trong SKLM là Silicagel tráng trên đế

nhôm hay đế thuỷ tinh. Trong quá trình hấp phụ, sẽ xảy ra tranh giành giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ trên bề mặt chất hấp phụ, và khi đạt được cân bằng, mỗi chất tan sẽ ở một vị trí khác nhau trên bản mỏng.

Để tiến hành sắc kí, chất tan được chấm lên bản thành từng vết chấm nhỏ, sấy cho dung môi bay hơi hết rồi triển khai với hệ dung môi thích hợp trong một bình triển khai kín. Để kiểm tra vết chất có thể sử dụng thuốc thử hiện màu hoặc soi bằng đèn UV. Thuốc thử hiện màu có thể là hơi ammoniac hoặc dung dịch axit sunfuric 10%. Để hiện vết người ta nhúng bản vào thuốc thử hoặc phun lên bản mỏng sau đó hơ bản mỏng lên trên bếp điện hoặc sấy nóng để vết xuất hiện từ từ. Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột.

Một hình thức SKLM khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu hợp chất tự nhiên là SKLM điều chế, dùng để điều chế, thu chất trực tiếp. ở phương pháp này, quá trình thực hiện tương tự SKLM và sau khi triển khai xong, soi đèn UV để xác định vết rồi cạo lấy lớp Silicagel chứa chất cần điều chế, tiến hành rửa giải để thu chất.

c. Sắc kí cột (CC)

Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại Silicagel (có kích thước hạt rất khác nhau) pha thường và pha đảo (YMC, ODS, Dianion). Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột thuỷ tinh).

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 28 K31A - Hoá

Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại.

Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì sẽ gây hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất để kích thích dung môi chảy (áp suất trung bình – MPC, áp suất cao – HPLC).

Tỷ lệ đường kính so với chiều cao cột (L/D) phụ thuộc vào yêu cầu tách (phụ thuộc vào lượng chất và chất cụ thể).

Tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi là Rf, với mỗi chất khác nhau giá trị Rf khác nhau. Nhờ sự khác nhau này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.

Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào Silicagel rồi làm khô tơi hoàn toàn rồi sau đó đưa lên cột. Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất vào dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

 Nhồi cột khô: Theo cách này chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô sau đó gõ nhẹ lên thành cột để đưa chất hấp phụ xếp chặt trong cột. Dùng dung môi chạy cột để rửa giải.

 Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 29 K31A - Hoá

Khi chuẩn bị cột cần lưu ý không được để có bọt khí trong cột (nếu có bọt khí sẽ gây nên hiện tượng chảy rối trong cột, và giảm hiệu quả tách). Và cột không được nứt, gãy, rò.

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ

dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Nếu tốc độ chạy quá chậm. Thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.

2.2.2.3.2 Sắc kí khí

Đây là phương pháp sắc kí dùng chất khí làm pha động. Chất thử có thể là

chất khí lỏng hoặc chất rắn được chuyển thành thể bay hơi và nhờ một luồng khí trơ làm chất tải dẫn đi qua pha tĩnh:

+ Nếu pha tĩnh là một chất rắn thì gọi là sắc kí khí – rắn. + Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì gọi là sắc kí khí – lỏng.

 ở sắc kí khí – rắn, chất rắn được dùng là những chất có tính hấp phụ như Silicagel, than hoạt tính, oxit nhôm.

 ở sắc kí khí – lỏng, chất lỏng được phân tán mỏng như một lớp phim trên bề mặt một chất rắn trơ gọi là nền.

Khi chất thử được khí tải dẫn đi qua pha tĩnh, chúng bị tách riêng ra tuỳ theo hệ số phân bố của mỗi thành phần trong hỗn hợp chất thử đối với pha tĩnh.

2.2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Khi đã phân lập được một hợp chất hữu cơ, điều quan trọng là phải xác định được cấu trúc của chúng. Để có thể thực hiện được điều này cần phân tích bằng nhiều phương pháp kết hợp với nhau

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 30 K31A - Hoá

Đối với chất rắn kết tinh thì điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan trọng, nó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất. Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0.50C thì có thể xem sản phẩm kết tinh đã tinh khiết. Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp rất xa so với điểm chảy lý thuyết thì chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết và phải tinh chế và kết tinh lại.

Trong nhiều trường hợp, với việc xác định được điểm chảy có thể đưa ra được kêt luận hoặc đưa ra nhận định sơ bộ về hợp chất cần nghiên cứu bằng cách đem đi so sánh, đối chiếu với các tài liệu đã có sẵn.

2.2.3.2 Phổ hồng ngoại

Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng

10000 – 100000 cm-1 và biến thành năng lượng của dao động phân tử.

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa trên sự khác nhau của các dao động của

các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của các tia hồng ngoại. Như vậy phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của hai dạng năng lượng là năng lượng dao động và năng lượng quay.

Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng tương đối của các nguyên tử, liên kết và vào cấu trúc hình học của chúng. Với mỗi hợp chất khác nhau chứa các liên kết khác nhau thì sự hấp thụ hồng ngoại là khác nhau. Dựa trên những đặc điểm này mà ta có thể xác định được các nhóm chức trong hợp chất hữu cơ bằng cách đo và phân tích phổ hồng ngoại.

Dựa vào sự hấp thụ đặc trưng của các nhóm chất mà có thể chia hồng ngoại

thành ba vùng : Vùng sóng ngắn từ 4000 – 1300 cm-1, vùng sóng dài từ 909 – 650cm-1, và vùng sóng trung bình từ 1600 - 1300 cm-1

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 31 K31A - Hoá

Trong vùng sóng ngắn các nhóm chức hữu cơ bị hấp thụ là OH, NH, CO,…

Nếu không có dải hấp thụ trong vùng 1850 – 1540 cm-1

là không có nhóm CO, không có dải hấp thụ ở 3650 – 3200 cm-1

là không có nhóm OH phenol hoặc ancol. Các hợp chất thơm hoặc tạp thơm thường có dải hấp thụ nằm trong khoảng 1600 – 1300 cm-1.

Vùng sóng dài đặc trưng cho các hấp thụ của dao động biến dạng. Nếu không có dải hấp thụ trong khoảng 909 – 605 cm-1

là hợp chất không có cấu trúc thơm. Các hấp thụ của dao động biến dạng của vòng thơm và biến dạng C – H ngoài mặt phẳng của các hợp chất thơm và tạp thơm xuất hiện với cường độ mạnh và thường có liên quan đến nhóm thế của các hợp chất. Nếu có dải hấp thụ rộng với cường độ mạnh thì rất có thể có mặt các dime của axit cacboxilic, của amin, amit. Nếu có các dải ở gần 1000 cm-1

thì rất có thể có cấu trúc olefin.

Vùng sóng trung bình được gọi là vùng chỉ vân tay vì nó được dùng để so

sánh hình dạng các dải hấp thụ với mẫu chuẩn xem có đồng nhất hay không. Ví dụ: Nếu có dải hấp thụ OH ở 3550 – 3200 cm-1

thì vị trí dải hấp thụ C – O tại đây sẽ giúp ta phân biệt được chi tiết hơn về cấu trúc của phenol hoặc ancol đó.

2.2.3.3 Phổ tử ngoại khả kiến

Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến của hợp chất hữu cơ phụ

thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Sự hấp thụ ấy gây ra sự chuyển dịch các điện tử từ obitan ở trạng thái cơ bản lên các obitan có năng lượng cao hơn ở trạng thái kích thích. Tuy nhiên chỉ có một số dạng cấu trúc trong hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ ấy nên việc ứng dụng phổ UV cũng chỉ giới hạn trong một số lớp chất mà chủ yếu là các chất có cấu trúc dây nối đôi liên hợp.

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 32 K31A - Hoá

Đặc điểm của phổ tử ngoại là phổ của một chất phức tạp có thể giống với

phổ của một chất đơn giản nếu hai chất ấy có cùng một nhóm cấu trúc giống nhau. Chính vì thế phổ tử ngoại thường được dùng để xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ một cách sơ bộ.

2.2.3.4 Phổ khối lượng

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử

chất nghiên cứu dưới sự bắn phá của một chùm ion từ bên ngoài.

Phổ MS còn cho các pic ion mảnh và dựa vào đó người ta có thể xác định

được cơ chế phân mảnh và từ đó dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều các loại phổ khối lượng và các phương pháp chủ yếu vẫn thường dùng là:

 Phổ EI – MS ( Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy): dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm electron bắn phá có năng lượng khác nhau. Thông thường là 70eV.

 Phổ ESI – MS (Electron Spray Ionization Mass Spectryscopy): gọi là phổ phun mù điện tử, phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn so với phổ EI – MS . Do đó dữ liệu phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp dễ bị phá vỡ.

2.2.3.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Cộng hưởng từ hạt nhân Nuclear Magnetic Resonance (NMR) là một

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 33 K31A - Hoá

nguyên tử định hướng theo từ trường của một nam châm vĩnh cửu. Do tương tác của các spin này với một điện từ trường bổ sung, các hạt nhân chuyển lên một mức năng lượng cao hơn. Tín hiệu sinh ra do sự thay đổi vị trí từ trạng thái có mức năng lượng cao xuống trạng thái có mức năng lượng thấp hơn được ghi lại và cường độ của tín hiệu tỷ lệ với mức chênh lệch năng lượng giữa các trạng thái.

Đối với hoá học các hợp chất thiên nhiên, hai phổ NMR phổ biến nhất là phổ cộng hưởng từ proton 1

H-NMR và phổ cộng hưởng từ cac-bon 13C-NMR. Trong phổ 1

H-NMR, hai thông số quan trọng là tích phân và hằng số liên kết. Chỉ số tích phân cho ta biết số lượng tương đối của proton còn hằng số liên kết đặc trưng cho sự tương tác của các proton với nhau.

Phổ 13

C-NMR cho biết thông tin về số lượng nguyên tử cac-bon trong cấu trúc chất, ngoài ra còn có phổ DEPT cho biết những vạch tín hiệu nào là CH3; CH2; CH hay C. Từ đó cho phép dự đoán khung cấu trúc của hợp chất nghiên cứu.

Chương 3 Thực nghiệm

======================================================================================================

Phùng Thị Lan Anh 34 K31A - Hoá