PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO nHEXANE CỦA LÁ CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del.), HỌ CÚC (Asteraceae)

Khảo sát thành phần hóa học của lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) thu hái tại quận Ninh Kiều, TP. Cần Thơ. Nghiên cứu này chỉ tập trung vào cao n-hexane của lá cây Lá đắng phân lập được 03 hợp chất lần lượt là glumoamide, trans-phytol và spinasterol. Cấu trúc của hợp chất được xác định dựa vào các phương pháp quang phổ hiện đại như: ESI-MS, 1D và 2D NMR và so sánh với tài liệu tham khảo

Trang 1

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN HỬU HẬU NGUYỄN ĐỖ KIỀU LINH

PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO n-HEXANE

CỦA LÁ CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del.),

HỌ CÚC (Asteraceae)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƢỢC

2017

Trang 2

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN HỬU HẬU NGUYỄN ĐỖ KIỀU LINH

PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO n-HEXANE

CỦA LÁ CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del.),

Trang 3

LỜI CẢM ƠN



Trong suốt thời gian học, chúng em đã tích lũy được nhiều kiến thức, kinh nghiệm và kỹ năng bổ ích, nhân đây chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ts Tôn Nữ Liên Hương, người Cô kính yêu luôn hết lòng giảng dạy, quan tâm, dìu dắt chúng em Cô đã tận tình truyền đạt kinh nghiệm, tiếp thêm nguồn động lực khi chúng em nản lòng Ngoài ra, Cô đã tạo cho chúng em mọi điều kiện thuận lợi về vật chất lẫn tinh thần để chúng em hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Quý Thầy Cô Bộ môn Hóa, khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ, những người Thầy, người Cô đã truyền đạt cho chúng em thật nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho chúng

em học tập và hoàn thành khóa luận

Các anh chị, bạn bè và các em sinh viên phòng Hóa hữu cơ - khoa Khoa học Tự nhiên - trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ chúng em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Cuối cùng, chúng em xin chân thành cảm ơn đến ba mẹ, đã luôn quan tâm và động viên, hỗ trợ về mặt vật chất lẫn tinh thần, giúp đỡ chúng em vượt qua rất nhiều trở ngại trong suốt quãng đời sinh viên

Xin chân thành cảm ơn!

Trang 4

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: "Phân lập chất từ cao n-hexane của lá cây Lá đắng (Vernonia

amygdalina Del.), họ Cúc (Asteraceae)"

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hửu Hậu MSSV: B1303919

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (Ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2017

Cán bộ hướng dẫn

Trang 5

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện:

2 Đề tài: "Phân lập chất từ cao n-hexane của lá cây Lá đắng (Vernonia

amygdalina Del.), họ Cúc (Asteraceae)"

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Hửu Hậu MSSV: B1303919

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (Ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2017

Cán bộ phản biện

Trang 6

TÓM TẮT

Khảo sát thành phần hóa học của lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina

Del.) thu hái tại quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ Nghiên cứu này chỉ tập trung

vào cao n-hexane của lá cây Lá đắng phân lập được 03 hợp chất lần lượt là glumoamide, trans-phytol và spinasterol Cấu trúc của hợp chất được xác định dựa vào các phương pháp quang phổ hiện đại như: ESI-MS, 1D và 2D NMR và so sánh với tài liệu tham khảo

Từ khóa: Vernonia amygdalina Del., glumoamide, trans-phytol, spinasterol

Trang 7

ABSTRACT

From chemical constituents of the leaf of the medicinal species Vernonia amygdalina Del collected from Ninh Kieu District, Can Tho City This study only focuses on the n-hexane extract of the leaf of the medicinal species Vernonia amygdalina Del and three compounds were isolated: glumoamide, trans-phytol và spinasterol Their structures were elucidated based on various spectra data (ESI-MS, 1D and 2D NMR spectroscopy) and by comparing with known spectral data.

Keywords: Vernonia amygdalina Del., glumoamide, trans-phytol, spinasterol.

Trang 8

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH PHỤ LỤC x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Nội dung nghiên cứu 2

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1Tổng quan thực vật 3

2.1.1 Giới thiệu cây Lá đắng 3

2.1.2 Tên gọi và phân loại thực vật 3

2.1.3 Mô tả thực vật 4

2.2 Tác dụng dược lí của cây Lá đắng 4

2.2.1 Trong y học dân gian của một số quốc gia trên thế giới [2] 4

2.2.2 Hoạt tính sinh học đã được nghiên cứu 5

2.3 Tổng hợp kết quả nghiên cứu của cây Lá đắng 6

2.3.1 Trong nước 6

2.3.2 Ngoài nước 6

2.4 Tổng hợp thành phần hóa học đã được nghiên cứu trên cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) 7

Trang 9

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1Phương tiện nghiên cứu 13

3.1.1 Hóa chất 13

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 13

3.2Phương pháp nghiên cứu 14

3.2.1 Phương pháp cô lập hợp chất 14

3.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 14

3.2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào 14

3.3Thực nghiệm 16

3.3.1 Thu hái và xử lý mẫu 16

3.3.2 Điều chế các loại cao 16

3.3.3 Khảo sát thành phần hóa học cao n-hexane 18

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Xác định cấu trúc hợp chất VA.Hex01 21

4.4 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào 28

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

5.1 Kết luận 29

5.2 Kiến nghị 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

PHỤ LỤC 33

Trang 10

DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Thành phần hóa học đã công bố của cây Lá đắng 7

Bảng 3.1 Kết quả sắc ký nhanh cột khô cao n-hexane 18

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký cột phân đoạn VH6 19 Bảng 4.1 Dữ liệu phổ 1D NMR của VA.Hex01 và so sánh với tài liệu tham

Bảng 4.4 Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết n-hexane của lá cây Lá đắng

(Vernonia amygdalina Del.) 28

Trang 11

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Thân, lá và hoa của cây Lá đắng 4

Hình 3.1 Cấu trúc WST-8; WST-8 formazan và nguyên tắc phát hiện khả năng sống của tế bào với Cell counting kit-8 15

Hình 3.2 Sơ đồ tổng quát điều chế các loại cao từ bột lá cây Lá Đắng 17

Hình 3.3 Bản sắc ký và tinh thể của phân đoạn VH6.1.1 19

Hình 3.4 Bản sắc ký các tiểu phân đoạn của phân đoạn VH8 với hệ dung môi giải ly DC:Me (9:1) 20

Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất VA.Hex01 22

Trang 12

DANH SÁCH PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: CHẤT VÀ BẢN SẮC KÝ 33

Phụ lục 1.1 Chất và bản sắc ký của VA.Hex01 trong các hệ giải ly 33

PHỤ LỤC 2: CÁC PHỔ CỦA VA.Hex01 35

Phụ lục 2.1a Phổ ESI-MS positive của VA.Hex01 35

Phụ lục 2.1b Phổ ESI-MS negative của VA.Hex01 36

Phụ lục 2.2 Phổ 1H NMR của VA.Hex01 37

Phụ lục 2.3a Phổ 1 H NMR giãn rộng của VA.Hex01 38

Phụ lục 2.3b Phổ 1H NMR giãn rộng của VA.Hex01 39

Phụ lục 2.4 Phổ 13C NMR của VA.Hex01 40

Phụ lục 2.5 Phổ 13C NMR giãn rộng của VA.Hex01 41

Phụ lục 2.6 Phổ DEPT của VA.Hex01 42

Phụ lục 2.7 Phổ DEPT giãn rộng của VA.Hex01 43

Phụ lục 3.2a Phổ 1H NMR giãn rộng của VA.Hex03 45

Phụ lục 4.1 Phổ ESI-MS positive của VA.Hex04 51

Phụ lục 4.3a Phổ 1H NMR giãn rộng của VA.Hex04 53

Trang 13

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

13

C NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

1D NMR One Direction Nuclear Magnetic Resonance

1

H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

2D NMR Two Direction Nuclear Magnetic Resonance

HeLa Human cervix cancer

IC50 Half maximal Inhibitory concentration

Trang 14

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Lý do chọn đề tài

Y học thế giới hiện nay đang có xu hướng sử dụng các dược liệu có nguồn gốc từ tự nhiên vì tính thuần khiết thiên nhiên và hầu như là không gây

ra tác dụng phụ, hạn chế tối đa việc đưa các hợp chất tổng hợp, bán tổng hợp vào cơ thể người tránh việc tồn dư các chất độc hại gây ảnh hưởng đến sức khỏe Điều này muốn thực hiện đòi hỏi nhà khoa học phải tập trung nghiên cứu tìm ra các hợp chất tự nhiên hữu ích cho con người Với sự phát triển của các kĩ thuật phân tích hiện đại, nhiều hoạt chất được tách chiết từ dược liệu, nghiên cứu xác định cấu trúc và tác dụng dược lí Từ đó phát triển các dược phẩm có chứa hoạt chất từ cây thuốc (tinh chất dược liệu), các chế phẩm này

có giá trị kinh tế lớn hơn nhiều so với các sản phẩm chứa cao thuốc

Việt Nam là một nước đa dạng về khí hậu, thổ nhưỡng và điều kiện thiên nhiên do đó nguồn dược liệu của nước ta vô cùng phong phú và đa dạng, trong

đó cây Lá đắng là một loại cây được biết đến như một loại dược liệu quý được

sử dụng phổ biến trong các bài thuốc dân gian Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các hoạt tính sinh học và dược lý của cây Lá đắng như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ký sinh trùng, diệt sán và côn trùng, kháng sốt rét, kháng ung thư và tác dụng gây độc tế bào ung thư vú, chống gây đột biến, ngừa thai, chống đông máu và huyết khối, giảm đau và hạ sốt, chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ gan, trị đái tháo đường, v.v… Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước về cây Lá đắng còn rất hạn chế

Xuất phát từ thực tiễn trên, việc nghiên cứu và khảo sát thành phần hóa

học của cây Lá đắng là vấn đề đáng quan tâm nên đề tài "Phân lập chất từ

cao n-hexane của lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ Cúc

(Asteraceae)" đã được chọn nghiên cứu

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là phân lập và xác định cấu trúc hóa học

của các hợp chất từ cao n-hexane của lá cây Lá đắng nhằm đóng góp thêm

thông tin về thành phần hóa học của cây

Trang 15

1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ Cúc (Asteraceae), toàn bộ

phần lá được thu hái tại quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu trong quy mô phòng thí nghiệm

Nghiên cứu phân lập, tinh chế các hợp chất từ cao n-hexane

Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

1.4 Nội dung nghiên cứu

Thu nguyên liệu toàn bộ phần lá của cây Lá đắng, tại quận Ninh Kiều,

TP Cần Thơ, rửa sạch, phơi khô (tránh ánh nắng trực tiếp), xay thành bột mịn,

sau đó điều chế cao tổng Methanol (Me) và các cao phân đoạn

Sử dụng các phương pháp sắc ký nhanh-cột khô, sắc ký cột, sắc ký lớp

mỏng với các hệ dung môi thích hợp để phân lập các hợp chất từ cao

Tiến hành phân tích phổ, tìm phổ nghiệm, so sánh với tài liệu tham khảo

từ đó xác định cấu trúc các hợp chất

Viết báo cáo

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đề tài góp phần cung cấp thêm thông tin về đặc điểm nhận dạng, khu

vực phân bố, phương pháp tách chiết, thành phần hóa học của lá cây Lá đắng

để nghiên cứu nguồn nguyên liệu tự nhiên có tiềm năng ứng dụng làm thuốc,

giúp phong phú nguồn dược liệu trong y học cổ truyền Việt Nam

Trang 16

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan thực vật

2.1.1 Giới thiệu cây Lá đắng

Họ Cúc (Asteraceae) là họ lớn nhất trong ngành thực vật có hoa có khoảng

1.620 chi và hơn 23.600 loài Các thành viên thuộc họ này hầu hết là các loại

thảo mộc và cây bụi, rất hiếm loài thân gỗ Chúng được tìm thấy trên khắp thế

giới nhưng phân bố nhiều nhất ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Nam Mỹ,

Bắc Mỹ, Nam Phi, Nam Á, Đông Á, Đông Nam Á [1]

Lá đắng có tên khoa học là Vernonia amygdalina Del., thuộc chi

Vernonia, họ Asteraceae, là một trong những loài nổi bật nhất của họ Cúc

Loài này được Delile mô tả khoa học đầu tiên năm 1826 Lá đắng phát triển

chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi đặc biệt là ở Nigeria, Zimbabwe, Nam Phi

và cũng được du nhập vào Tây Phi [1] Ở Việt Nam cây Lá đắng không rõ

xuất hiện từ lúc nào nhưng từ lâu nó đã phát triển trên mọi miền đất nước, được

người dân dùng làm rau ăn và làm thuốc trong dân gian để chữa bệnh

2.1.2 Tên gọi và phân loại thực vật

2.1.2.1 Tên gọi

Tên khoa học: Vernonia amygdalina Del

Tên đồng nghĩa: Gymnanthemum amygdalinum Del

Tên nước ngoài: Bitterleaf, common bitterleaf (English); vernonie,

vernonie commune, ndole (France); sucumadeira, pau fede (Portuguese); Daun

Bismillah (Malaysia), Ewuro (Nigeria)

Chi: Vernonia Loài: Vernonia amygdalina [3]

Trang 17

2.1.3 Mô tả thực vật [2]

Thân: dạng cây bụi hay gỗ nhỏ mọc thẳng đứng, chỉ cao từ 1,5-3 m,

đường kính thân rất nhỏ khoảng 2-4 cm, cây thường phân nhánh ở cành gốc, khi còn non thân cây được phủ một lớp lông trắng mịn về già lớp lông này rụng dần

Lá: lá đơn, mọc xen kẽ, hình mác-mác ngược, một số hình trứng hoặc

elip, nhẵn trên bề mặt, có phần hơi bóng, lông mềm trên gân lá Cuống lá dài 1-4 cm, mép lá có hình răng cưa

Hoa: mọc ra dạng cụm cuối ngọn thân, dạng ngù dày với lá bắc con nhỏ

dài từ 0,1-0,2 cm; có mùi thơm ngọt, một cụm ước khoảng 11-30 bông; bông hình chuông dài 0,2-0,5 cm, trên một cuống nhỏ dài 0,2-0,5 cm, hoa màu trắng kem nhỏ Vành hoa hẹp dần xuống phía dưới, cổ xẻ sâu, thùy hoa có các tuyến hoặc gai nhỏ bên ngoài, bề mặt màu trắng Bộ nhị dài khoảng 4,5-5 cm với 5 nhị hoa trên tràng, bao phấn dạng thẳng đến dạng thẳng hơi mũi mác, dài khoảng 3-4 mm

Hình 2.1 Thân, lá và hoa của cây Lá đắng 2.2 Tác dụng dƣợc lí của cây Lá đắng

2.2.1 Trong y học dân gian của một số quốc gia trên thế giới [2]

Tại Châu Phi, cây dùng để trị đái tháo đường, trị bệnh giun sán, sốt rét, nhuận trường, trợ tiêu hóa, kích thích thèm ăn, hạ sốt, hay trị vết thương

Ở vài vùng tại Nigeria, thân cây dùng làm thanh nhai làm sạch miệng và trị một số bệnh về răng Rễ và lá dùng trị ho, viêm gan, kiểm soát và điều trị tăng huyết áp

Trang 18

Ở Malawi và Uganda, dùng đẩy nhau thai ra ở phụ nữ khi sinh, hỗ trợ co thắt tử cung sau khi sinh, kích thích có sữa và kiểm soát xuất huyết sau sinh

2.2.2 Hoạt tính sinh học đã đƣợc nghiên cứu

Các nghiên cứu về Vernonia amygdalina chứng minh rằng nó có khả

năng kháng ung thư (Izevbigie 2003; Khalafalla et al 2009), kháng khuẩn (Ibrahim et al 2009), kháng oxy hóa (Adaramoye et al 2008), chống nhiễm độc gan (Arhoghro et al 2009), điều tiết cholesteron (Ugwu et al 2010)

Ngoài ra, V amygdalina chứa một lượng đáng kể các lipid, nhiều acid amin

thiết yếu và chất xơ (Eleyinmi et al 2008) Nó cũng chứa một lượng khá lớn carbohydrate, vitamin C và caroteinoids (Ejoh et al 2007) Nhiều nguyên tố vi lượng như canxi, sắt, kali, mangan, đồng và coban cũng chứa một lượng đáng

kể trong loài này (Eleyinmi et al 2008)

Nghiên cứu của Solomon M Abay và cộng sự cho thấy hoạt tính ngăn

chặn sự truyền nhiễm của ký sinh trùng sốt rét plasmodium từ dịch chiết

ethanol và nước của lá cây Lá đắng [4]

Thử nghiệm tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Singapore cho thấy dịch chiết ethanol-nước của lá cây Lá đắng có hoạt tính ức chế sự gia tăng của 2 dòng tế bào ung thư vú ở người: MCF-7 và MDA-MB-231 [5]

Nghiên cứu tại Khoa Dược và Chất độc học, Đại học Nnamdi Azikiwe, Nigeria được tiến hành trên 2 bệnh nhân ung thư cho thấy bột lá và dịch chiết

từ lá của cây Lá đắng có tác dụng chống ung thư biểu mô, chống béo phì, đái tháo đường và phòng ngừa miễn dịch [6]

Nghiên cứu tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Singapore các hợp chất 1,5-dicaffeoyl quinic acid, dicaffeoyl quinic acid, chlorogenic acid và

luteolin-7-O-glucoside được phân lập từ dịch chiết ethanol của cây Lá đắng có

hoạt tính chống đái tháo đường khi thử nghiệm trên chuột [7]

Nghiên cứu của David A Akinpelu tại Khoa Vi sinh, Đại học Obafemi Awolowo, Nigeria ghi nhận dịch chiết methanol của lá cây Lá đắng có hoạt

tính kháng một số vi khuẩn: Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus [8]

Trang 19

2.3 Tổng hợp kết quả nghiên cứu của cây Lá đắng

Năm 1972, E O Arene đã tách được 7,24(28)-Stigmastadien-3β-ol [10]

Năm 1983, Iraj Ganjian và cộng sự đã phân lập được vernodalin, varnodalol và 1 sesquiterpen lacton mới là 11,13-dihydrovarnodalin [11] Laekeman và các cộng sự cũng cô lập được vernolepin từ quả Lá đắng [12] Năm 1991, Hajime Ohigashi và cộng sự đã cô lập được vernonioside A1

Năm 1994, Godwin O Igile và cộng sự đã cô lập được 3 flavone là

luteolin, luteolin 7-O-β-glucuronoside, luteolin 7-O-β-glucoside [16]

Năm 1995 nhóm nghiên cứu này cũng cô lập được 2 steroid glycoside mới: vernonioside D và E [17]

Năm 2010, Olatunde Owoeye và cộng sự đã phân lập được epivernodalol

có hoạt tính chống lại dòng tế bào HT-114 (u hắc tố da) [18] Xuan Luo và các cộng sự cũng phân lập được vernodalinol có hoạt tính ức chế sự phát triển của

tế bào ung thư vú (MCF-7) [19]

Năm 2015, M M Zenebe và cộng sự đã cô lập được hợp chất MM-4 (3-amino-5-methylhex-5enyl 3-amino-6-methylhept-6-enyl terephthalate) [20] Annamarria Sinisi và các cộng sự cũng tìm ra được 3 sesquiterpen lacton mới: 14-O-methylvernodile, 3ʹ-deoxyvernodalol, vernomygdalin và

5 sesquiterpen lacton đã biết: vernodile, 11,13-dihydrovernodile, 3ʹ-hydrovernodile, vernodalol và 12-methoxyvernolepin [21]

Năm 2016, Olga Quasie và cộng sự đã phân lập được 4 steroid saponin mới: vernoamyoside A, B, C và D [22]

Trang 20

2.4 Tổng hợp thành phần hóa học đã đƣợc nghiên cứu trên cây Lá

đắng (Vernonia amygdalina Del.)

Thông qua các tài liệu nghiên cứu cho thấy rằng thành phần hoá học của

V amygdalina chứa saponin, flavonoid, alkaloid, terpene, steroid, courmarin,

phenolic acid, lignan, xanthon, anthraquinon, edotide và sesquiterpen

Bảng 2.1 Thành phần hóa học đã công bố của cây Lá đắng

(amu) Sesquiterpen lacton

Trang 26

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Hóa chất

Dung môi (Chemsol, Việt Nam), n-hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol, acetone và methanol

Vanillin, H2SO4 đậm đặc và nước cất dùng để pha thuốc thử hiện vết

Na2SO4 được dùng để làm khan dung môi

Silica gel 60 (Merck) cỡ hạt (0,040-0,063 mm) dùng cho sắc ký pha thường và sắc kí lớp mỏng dùng silica gel GF254 (Merck)

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Máy cô quay chân không Heidolph

Bản silica gel 60 F254 Merck tráng sẵn

Máy soi UV bước sóng 254 nm và 365 nm

Cân phân tích OHAUS PA214 và cân kỹ thuật GM 612

Tủ sấy Ecocell

Tủ hút

Bếp điện dùng để sấy bản mỏng Blacker ®

Phễu, đũa thủy tinh, giấy lọc

Các loại cột sắc ký có đường kính (Φ) và chiều dài (l) khác nhau

 Phễu, đũa thủy tinh, giấy lọc

Các thiết bị ghi phổ: phổ ESI-MS ghi trên máy Agilent Technogies, phổ NMR ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance tần số 500 MHz

Trang 27

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số hóa lý đặc trưng như màu sắc, dạng tinh thể, hằng số Rf, hấp thu quang phổ, khả năng hòa tan trong các loại dung môi,…

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm Các loại phổ 1D NMR, 2D NMR, ESI-MS được đo tại Phòng NMR-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Ngoài ra còn kết hợp với những dữ liệu phổ trong tài liệu tham khảo để đề nghị cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được

3.2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia

Hoa Kỳ (National Cancer Institute-NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển

hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro Các dòng tế bào ung thư nghiên

cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính [28]

Trang 28

Hình 3.1 Cấu trúc WST-8; WST-8 formazan và nguyên tắc phát hiện khả

năng sống của tế bào với Cell counting kit-8

Trang 29

3.3 Thực nghiệm

3.3.1 Thu hái và xử lý mẫu

Nguyên liệu được sử dụng là lá cây Lá đắng được thu hái tại phường An

Khánh, quận Ninh Kiều - TP Cần Thơ và được định danh bởi Ts Đặng Minh Quân, Bộ môn Sinh, Khoa Sư phạm, Đại học Cần Thơ Toàn bộ phần lá cây

Lá đắng sau khi thu hái về được rửa sạch bụi bẩn và loại bỏ lá hư, dập Tiến hành làm khô bằng cách phơi gió trong bóng râm, nguyên liệu sau khi khô được xay nhuyễn thành bột mịn (14,5 kg)

3.3.2 Điều chế các loại cao

Bột lá (14,5 kg) được cho vào các túi vải, buộc kín miệng, sau đó chiết kiệt với methanol bằng phương pháp ngâm dầm Sau thời gian khoảng 24 giờ, dịch chiết được lọc loại bã, tiến hành cô quay thu hồi dung môi Tiếp tục thực hiện quá trình trên nhiều lần để chiết kiệt các chất từ mẫu bột nguyên liệu, thu được cao tổng dạng sệt có khối lượng 2 kg

Hiệu suất điều chế cao tổng: H1 = 100% =

100% = 13,79% Cao tổng hòa tan với nước cất theo tỉ lệ cao:nước (1:1) (v/v), tiến hành phương pháp chiết lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần, dịch chiết từng phân đoạn sau đó được thu hồi dung môi để thu được các cao tương

ứng lần lượt là n-hexane (350 g), dichloromethane (16 g), ethyl acetate (36 g)

và n-butanol (125 g) Quy trình chiết tách được tóm tắt như hình 3.2

Hiệu suất thu hồi cao thành phần từ cao tổng (m = 2000 g):

Trang 30

Hình 3.2 Sơ đồ tổng quát điều chế các loại cao từ bột lá cây Lá Đắng

Cao Ea (36 g)

- Cô đuổi dung môi

- Hòa với nước cất

- Chiết kiệt với n-hex

- Chiết kiệt với DC

- Chiết kiệt với Ea

- Chiết kiệt với n-BuOH

Trang 31

3.3.3 Khảo sát thành phần hóa học cao n-hexane

Cao n-hexane (150 g) sử dụng phương pháp sắc ký nhanh cột khô, chất

hấp phụ là silica gel 60 Hệ dung môi giải ly cột là Hex (100%) tăng dần độ phân cực bằng Ea và MeOH Theo dõi quá trình chạy cột bằng SKLM hiện vết bằng thuốc thử vaniline/H2SO4 (5%), sấy bản mỏng Các mẫu cho kết quả SKLM giống nhau (màu vết và Rf) được gom thành một phân đoạn, thu được

10 phân đoạn chính (VH1-VH10)

Bảng 3.1 Kết quả sắc ký nhanh cột khô cao n-hexane

Trang 32

3.3.3.1 Khảo sát phân đoạn VH6

Tiểu phân đoạn VH6 (15,26 g) được tinh chế tiếp tục bằng sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel 60 Dung môi giải ly cột Ea 100%, sau đó tăng dần độ phân cực bằng MeOH Theo dõi cột bằng SKLM gom các hũ giống nhau về màu vết và Rf thu được 4 phân đoạn VH6.1–VH6.4, trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký cột phân đoạn VH6

Tiểu phân đoạn VH6.1 tiếp tục được sắc ký cột với hệ dung môi tăng dần

độ phân cực Hex:Ea (10:90; 5:95; 0:100) thu được 3 phân đoạn VH6.1.1–VH6.1.3

Hình 3.3 Bản sắc ký và tinh thể của phân đoạn VH6.1.1

Tiểu phân đoạn VH6.1.1 tiếp tục được sắc ký cột với hệ dung môi DC:Me (95:5), kết quả thu được VA.Hex01 (13 mg) sạch, dạng tinh thể vô định hình màu trắng Sắc ký lớp mỏng giải ly với hệ dung môi C:Me (9:1) và hiện hình trong thuốc thử vanilline/H2SO4 cho vết tròn màu hồng có Rf = 0,48

Trang 33

3.3.3.2 Khảo sát phân đoạn VH8

Phân đoạn VH8 (11,6 g) được tinh chế tiếp tục bằng sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel 60 Hệ dung môi giải ly cột tăng dần độ phân cực từ Hex:Ea (5:95; 0:100), Ea:Me (95:5; 90:10; 85:15) và MeOH Gom các hũ giống nhau được 7 phân đoạn VH8.1–VH8.7

Hình 3.4 Bản sắc ký các tiểu phân đoạn của phân đoạn VH8 với hệ dung môi

giải ly DC:Me (9:1) Tiểu phân đoạn VH8.2 (89 mg) cho 2 vết màu tím rõ đẹp trên bản sắc ký nên được tiếp tục khảo sát bằng sắc ký cột với hệ dung môi tăng dần độ phân cực DC:Me (100:0; 90:10), MeOH (100%) Gom các hũ giống nhau được 4 phân đoạn VH8.2.1–VH8.2.4

Tiểu phân đoạn VH8.2.1 (20 mg) tiếp tục được tinh sạch bằng sắc ký cột với hệ dung môi Hex:DC (5:5) thu được hợp chất VA.Hex03 (8 mg) sạch, dạng chất dầu, không màu Sắc ký lớp mỏng giải ly với hệ dung môi Hex:Ea (7:3) và hiện hình trong thuốc thử vanilline/H2SO4 cho vết tròn màu tím

có Rf = 0,6

Tiểu phân đoạn VH8.2.2 (15 mg) tiếp tục được tinh sạch bằng sắc ký cột với hệ dung môi Hex:DC (5:5) thu được hợp chất VA.Hex04 (3 mg) sạch, dạng tinh thể vô định hình màu trắng Sắc ký lớp mỏng giải ly với hệ dung môi Ea 100% và hiện hình trong thuốc thử vanilline/H2SO4 cho vết tròn màu tím có Rf = 0,67

Trang 34

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định cấu trúc hợp chất VA.Hex01

Hợp chất VA.Hex01 (13 mg) dạng tinh thể vô định hình, màu trắng; tan

tốt trong C:Me (5:5); SKLM cho vết tròn màu hồng trong thuốc thử

vanillin/H2SO4, giá trị Rf = 0,48 với hệ dung môi C:Me (9:1) (Phụ lục 1.1)

Phổ ESI-MS ở dạng positive cho mũi ion phân tử giả với m/z:

[M+H]+ = 682,6; [M-CH2+H]+ = 668,6; dạng negative cho mũi ion phân tử

giả với m/z: [M+2H2O-H]- = 716,6; [M+2H2O-CH2-H]- = 702,5 cho phép xác

định công thức phân tử là C42H83O5N (681 amu) (Phụ lục 2.1a; 2.1b)

Phổ 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 &MeOD, δ H ppm) (Phụ lục 2.2; 2.3a;

2.3b) của VA.Hex01 cho thấy:

- Tín hiệu của proton ở δH 7,49 ppm (1H; d; 9) đặc trưng cho proton gắn

trực tiếp với nitrogen (>NH)

- Tín hiệu ở δH 5,39 ppm (2H; m) cho thấy tín hiệu của hai proton olefin

(–CH=CH–) trên mạch béo

- Tín hiệu ở δH 4,1 ppm (1H; m) là tín hiệu proton của (>CH–NH)

- Tín hiệu ở δH 4,03 ppm (1H; dd; 3,8; 8,3) thể hiện cho proton của

(>CH–C=O)

- Tín hiệu ở δH 3,8 ppm (1H; dd; 4,0; 11,5) và δH 3,71 ppm (1H; dd; 5,0;

11,5) là tín hiệu của hai proton nhóm methylene loại (–CH 2–OH)

- Tín hiệu ở δH 3,53 ppm (2H; m) là hai proton có cùng tín hiệu của nhóm

(>CH–OH)

- Tín hiệu ở vùng từ trường cao δH 1,26-2,01 ppm cho thấy sự hiện diện

của nhiều nhóm methylene (–CH 2–) trong mạch

- Tín hiệu ở δH 0,87 ppm (6H; t; 6,5) thể hiện cho proton của hai nhóm

methyl (–CH 3) cuối mạch

Phổ 13

C NMR (125 MHz, CDCl 3 &MeOD, δ C ppm) (Phụ lục 2.4; 2.5)

kết hợp với DEPT90 và DEPT135 (Phụ lục 2.6; 2.7) cho thấy VA.Hex01

có 42 carbon thể hiện qua các mũi tín hiệu sau:

- Một tín hiệu carbon tứ cấp tại δC 175,9 ppm ứng với carbon của nhóm

carbonyl (>C=O) (C-1′)

- Hai tín hiệu ở δC 130,3 và 129,9 ppm là tín hiệu của hai carbon olefin

(–CH=CH–) (C-7′; C-8′)

Trang 35

- Ba tín hiệu ở δC 75,8; 72,4 và 72,2 ppm là tín hiệu của ba carbon

(>CH–OH) (C-3; 4; 2′)

- Một tín hiệu ở δC 61,3 ppm là tín hiệu của carbon (>CH2–OH) (C-1)

- Một tín hiệu ở δC 51,8 ppm là tín hiệu của carbon (>CH–) gắn trực tiếp

Từ những dữ liệu phổ nêu trên kết hợp với tài liệu tham khảo đã công bố

[24, 25] trình bày trong bảng 4.1 giúp nhận danh hợp chất VA.Hex01 là

(2ʹR,7ʹE)–2ʹ–hydroxy–N–[(2S,3S,4R)–1,3,4–trihydroxy–hexadecan–2–

yl]hexacos–7ʹ–enamide (tên thông thường là glumoamide)

Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất VA.Hex01

Định dạng
Số trang	71
Dung lượng	3,22 MB