PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE CỦA LÁ CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina Del.), HỌ CÚC (Asteraceae)

Từ dịch chiết lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) thu hái tại quận Ninh Kiều, TP. Cần Thơ phân lập được 02 hợp chất lần lượt là apigenin 7-O-β-glucoside và luteolin 7-O-β-glucoside. Cấu trúc của hợp chất được xác định dựa vào các phương pháp quang phổ hiện đại như: 1D NMR và 2D NMR và so sánh với tài liệu tham khảo.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE

CỦA LÁ CÂY LÁ ĐẮNG

(Vernonia amygdalina Del.), HỌ CÚC (Asteraceae)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

PHÂN LẬP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETATE

CỦA LÁ CÂY LÁ ĐẮNG

(Vernonia amygdalina Del.), HỌ CÚC (Asteraceae)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts TÔN NỮ LIÊN HƯƠNG

2017

i

LỜI CẢM ƠN - -

Luận văn tốt nghiệp sẽ không thể hoàn thành nếu thiếu sự khuyến khích, động viên của rất nhiều cá nhân Tôi muốn nhân cơ hội này để bày tỏ sự cảm

ơn chân thành đối với họ

Đầu tiên, tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Ts Tôn Nữ Liên Hương,

vì những chỉ dẫn của Cô, lòng kiên nhẫn và sự quan tâm sâu sắc Sự hướng dẫn tận tình trong suốt quá trình thực hiện là động lực giúp tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn này

Các anh, chị và các bạn phòng Hóa Hữu Cơ, với sự quan tâm chân thành

và những lời động viên, khuyến khích là một phần không thể thiếu Tôi chân thành cảm kích

Và hơn nữa, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến gia đình vì đã luôn luôn ủng hộ tôi và tình yêu thương dạt dào đối với tôi Những hỗ trợ trên đã giúp tôi vượt qua khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn!

ii

Trường Đại Học Cần Thơ

Khoa Khoa Học Tự Nhiên

Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: Ts Tôn Nữ Liên Hương

2 Đề tài: “Phân lập chất từ cao ethyl acetate của lá cây Lá đắng (Vernonia

amygdalina Del.), họ Cúc (Asteraceae)”

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Huyền Trang MSSV: B1304116 Lớp: Hóa Dược 2 Khóa: 39

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN:

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2017

Cán bộ hướng dẫn

Tôn Nữ Liên Hương

iii

Trường Đại Học Cần Thơ

Khoa Khoa Học Tự Nhiên

2 Đề tài: “Phân lập chất từ cao ethyl acetate của lá cây Lá đắng (Vernonia

amygdalina Del.), họ Cúc (Asteraceae)”

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Huyền Trang MSSV: B1304116 Lớp: Hóa Dược 2 Khóa: 39

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN:

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

 Những vấn đề còn hạn chế:

c Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài:

d Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2017

Cán bộ phản biện

iv

TÓM TẮT

Từ dịch chiết lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) thu hái tại quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ phân lập được 02 hợp chất lần lượt là apigenin 7-O-β-glucoside và luteolin 7-O-β-glucoside Cấu trúc của hợp chất được xác định dựa vào các phương pháp quang phổ hiện đại như: 1D NMR và 2D NMR và so sánh với tài liệu tham khảo

Từ khóa: Vernonia amygdalina Del., apigenin 7-O-β-glucoside và luteolin 7-O-β-glucoside

v

ABSTRACT

This work describes the isolation and characterization of two compounds, including apigenin 7-O-β-glucoside và luteolin 7-O-β-glucoside from the ethyl acetate extract of the leaf of the medicinal species Vernonia amygdalina Del collected from Ninh Kieu District, Can Tho City The chemical structures were elucidated based on various spectra data (1D NMR and 2D NMR spectroscopy) and by comparing with known spectral data

Keywords: Vernonia amygdalina Del., apigenin 7-O-β-glucoside và luteolin 7-O-β-glucoside

vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH PHỤ LỤC x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan thực vật 3

2.1.1 Đại cương về cây Lá đắng 3

2.1.2 Tên gọi 3

2.1.3 Phân loại thực vật 3

2.1.4 Mô tả thực vật 4

2.2 Tổng hợp kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 5

2.2.1 Trong nước 5

2.2.2 Ngoài nước 5

2.2.3 Tổng hợp thành phần hóa học đã được nghiên cứu trên cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) 6

2.3 Các nghiên cứu về dược tính của cây Lá đắng 15

vii

2.3.1 Y học dân gian 15

2.3.2 Hoạt tính sinh học theo nghiên cứu hiện đại 15

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Phương tiện nghiên cứu 17

3.1.1 Hóa chất 17

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 17

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.2.1 Phương pháp cô lập chất 17

3.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 18

3.3 Thực nghiệm 18

3.3.1 Thu hái và xử lí mẫu 18

3.3.2 Điều chế các loại cao 18

3.3.3 Khảo sát cao Ea 20

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Xác định cấu trúc hợp chất VA.Ea02 21

4.2 Xác định cấu trúc hợp chất VA.Ea03 24

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27

5.1 Kết luận 27

5.2 Kiến nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

viii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học đã công bố của cây Lá đắng 6

Bảng 2.2 Lá đắng theo y học cổ truyền của một số quốc gia trên thế giới [2] 15 Bảng 3.1 Kết quả sắc ký nhanh-cột khô cao Ea 20

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký phân đoạn VE3 20

Bảng 4.1 Dữ liệu phổ của hợp chất VA.Ea02 22

Bảng 4.2 Dữ liệu phổ 1D NMR của VA.Ea02 và so sánh với tài liệu 23

Bảng 4.3 Dữ liệu phổ của hợp chất VAEa.03 25

Bảng 4.4 So sánh dữ liệu phổ của VA.Ea03 với tài liệu tham khảo 26

ix

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Lá, hoa, thân của cây Lá đắng 4

Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát điều chế các loại cao từ bột lá cây Lá đắng 19

Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất VA.Ea02 23

Hình 4.2 Cấu trúc hóa học của VA.Ea03 24

x

DANH SÁCH PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1 35

Phụ lục 1.1 SKLM hiện hình với Fe3+ 5%/ethanol của VA.Ea02 (1, 2, 3) 35

Phụ lục 1.2 SKLM hiện hình với vaniline/H2SO4 của VA.Ea03 (7, 8) 35

Phụ lục 1.3 SKLM soi UV của VA.Ea02 (4, 5, 6) và VA.Ea03 (9) 35

Phụ lục 1.4 Dạng kết tinh của VA.Ea02 (trái) và VA.Ea03 (phải) 35

PHỤ LỤC 2 36

Phụ lục 2.1 Phổ 1H-NMR của VA.Ea02 36

Phụ lục 2.2a Phổ 1H-NMR dãn rộng của VA.Ea02 37

Phụ lục 2.2b Phổ 1H-NMR dãn rộng của VA.Ea02 38

Phụ lục 2.3 Phổ 13C-NMR của VA.Ea02 39

Phụ lục 2.4 Phổ 13C-NMR dãn rộng của VA.Ea02 40

Phụ lục 2.5 Phổ DEPT của VA.Ea02 41

Phụ lục 2.6 Phổ DEPT dãn rộng của VA.Ea02 42

Phụ lục 2.7 Phổ HSQC của VA.Ea02 43

Phụ lục 2.8a Phổ HSQC dãn rộng của VA.Ea02 44

Phụ lục 2.8b Phổ HSQC dãn rộng của VA.Ea02 45

Phụ lục 2.9a Phổ HMBC dãn rộng của VA.Ea02 46

Phụ lục 2.9b Phổ HMBC dãn rộng của VA.Ea02 47

Phụ lục 2.9c Phổ HMBC dãn rộng của VA.Ea02 48

Phụ lục 2.9d Phổ HMBC dãn rộng của VA.Ea02 49

Phụ lục 3.1 Phổ 1H-NMR của VA.Ea03 50

Phụ lục 3.2a Phổ 1H-NMR dãn rộng của VA.Ea03 51

Phụ lục 3.2b Phổ 1H-NMR dãn rộng của VA.Ea03 52

Phụ lục 3.3 Phổ 13C-NMR của VA.Ea03 53

Phụ lục 3.4 Phổ 13C-NMR dãn rộng của VA.Ea03 54

Phụ lục 3.5 Phổ DEPT của VA.Ea03 55

Phụ lục 3.6 Phổ DEPT dãn rộng của VA.Ea03 56

Heteronuclear Multiple Bond Correction Sắc ký lớp mỏng

Retention factor Hằng số ghép spin-spin Part per million

Unified atomic mass unit Multiple

Single Double Double of doublet Triplet

Chemical shift Ultra violet Ethyl acetate Dichloromethane Methanol

n-Hexane n-Butanol

-acetyl

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học, y học, nhiều loại bệnh đã được phát hiện và nghiên cứu được các phương thuốc điều trị Tuy nhiên, các thuốc có nguồn gốc tổng hợp và bán tổng hợp xuất hiện nhiều tác dụng phụ sau một thời gian sử dụng Do đó, y học thế giới có xu hướng về các dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải tập trung nghiên cứu các loài thực vật có dược tính chữa bệnh, nhằm tìm kiếm các hợp chất hữu ích Đã từ rất lâu trước đây, không chỉ ở Việt Nam mà còn ở

nhiều nước trên thế giới, cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) đã được

nhân dân biết đến với nhiều công dụng điều trị bệnh

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học cũng như dược lý của cây Lá đắng Các kết quả cho thấy rằng cây Lá đắng có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị cao, có tiềm năng ứng dụng lớn trong điều trị bệnh Tuy nhiên, nghiên cứu trong nước còn hạn chế Xuất phát từ thực tiễn trên, việc nghiên cứu và khảo sát thành phần hóa học

của cây Lá đắng là một vấn đề đáng quan tâm, nên đề tài “Phân lập chất từ

cao ethyl acetate của lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ Cúc

(Asteraceae)” đã được chọn nghiên cứu

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục đích chính của đề tài là phân lập hợp chất và xác định cấu trúc hóa

học từ cao ethyl acetate của lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ

Cúc (Asteraceae), nhằm đóng góp một phần nhỏ vào kho tàng kiến thức về thành phần hóa học của cây Lá đắng

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.), họ Cúc (Asteraceae)

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu quy mô phòng thí nghiệm, mẫu lá cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) được thu hái trên địa bàn Quận Ninh Kiều – TP Cần Thơ

2

1.4 Nội dung nghiên cứu

Thu nguyên liệu (lá) cây Lá đắng, xử lý nguyên liệu và điều chế cao

Sử dụng các phương pháp thường quy trong nghiên cứu như sắc ký cột pha thường, sắc ký lớp mỏng,… để phân lập hợp chất

Tiến hành phân tích phổ, tìm phổ nghiệm, từ đó xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

Viết báo cáo

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp thêm thông tin về đặc điểm nhận dạng, khu vực phân bố,

phương pháp tách chiết, thành phần hóa học của cây Lá đắng

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tìm hiểu về công dụng cây Lá đắng theo Y học Cổ truyền Việt Nam Nghiên cứu tìm ra nguồn dược liệu tự nhiên có tiềm năng sử dụng làm thuốc, hạn chế sử dụng thuốc tây y có nhiều tác dụng phụ trong điều trị bệnh

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan thực vật [1,2]

2.1.1 Đại cương về cây Lá đắng

Họ Cúc (Asteraceae), là họ lớn nhất trong ngành thực vật có hoa, bao

gồm khoảng 1620 chi và hơn 23600 loài Vernonia là một chi thực vật nhiệt đới thuộc họ Cúc Chi Vernonia có khoảng 1000 loài trên thế giới Trong đó,

hơn 500 loài phân bố ở châu Phi và châu Á; khoảng 300 loài ở Mexico, Trung

2.1.2 Tên gọi

Tên khoa học là: Vernonia amygdalina Del

Tên Việt Nam: Lá đắng, Mật gấu nam

Tên gọi nước ngoài: Bitter leaf (English), các tên gọi Ewuro, Onugbu, Ityuna, Chusar doki và Etidot (Nigeria) Một số nơi khác ở Châu Phi, nó còn được gọi là muop hoặc ndole (Cameroon), tuntwano (Tanzania), và mululuza (Uganda) Ở Châu Á, Ikaruga chrysanthemum tonsils và non-tree south (China) và South Africa leaf (Malaysia), và rất nhiều tên gọi địa phương khác

2.1.3 Phân loại thực vật

Giới: Plantae

Ngành: Tracheophyta

Lớp: Magnoliopsida Bộ: Asterales Họ: Compositeae (Asteraceae)

Chi: Vernonia Loài: Vernonia amygdalina

4

2.1.4 Mô tả thực vật [3]

Thân: Vernonia amygdalina là cây bụi, thân gỗ nhỏ, cao vừa và phân

nhánh đều, có dạng hình trụ hơi gốc cạnh với vỏ xốp

Lá: xen kẽ nhau, rất khác nhau về hình dạng và kích thước, hình mác,

một số hình trứng (hình elip), kích thước 3 – 17 cm dài, 1,3 - 7 cm rộng, dạng màng, nhọn ở đỉnh, rất mịn và có răng cưa ở mép lá, bề mặt trên nhẵn hơi bóng mịn, long tơ mềm ở mặt dưới, gân, và cuống phụ; cuốn lá dài khoảng 1 –

4 cm Lá có màu xanh với mùi đặc trưng và có vị đắng

Hoa: mọc ra dạng cụm cuối ngọn thân, dạng ngù dày với lá bắc con nhỏ

dài từ 0,1 – 0,2 cm; có mùi thơm ngọt, một cụm ước khoảng 11 – 30 bông; bông hình chuông rộng 0,2 – 0,5 cm, trên một cuốn nhỏ dài 0,2 – 0,5 cm, hoa màu trắng kem nhỏ; vành hoa hẹp dần xuống phía dưới, cổ xẻ sâu, thùy hoa có các tuyến hoặc gai nhỏ bên ngoài bề mặt màu trắng; bộ nhị dài khoảng 4,5 – 5

cm, với 5 nhị hoa trên tràng, bao phấn dạng thẳng đến dạng thẳng hơi mũi mác, dài khoảng 3 – 4 mm

Cây Lá đắng thường ra hoa và quả vào khoảng tháng 10 đến tháng 3 năm sau Cây Lá đắng không được nhân giống bằng hạt mà phải thông qua giâm cành Vị đắng trong cây cũng giúp nó tránh được sự gây hại của hầu hết các động vật, côn trùng và vi sinh vật

Lá đắng là loài có chu kỳ sinh trưởng ngắn trung bình khoảng 7 năm và được trồng dễ dàng

Hình 2.1 Lá, hoa, thân của cây Lá đắng

5

2.2 Tổng hợp kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học

2.2.1 Trong nước

Trước năm 2016, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố thành

phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.).

2.2.2 Ngoài nước

Năm 1969, S M Kupchan và cộng sự đã phân lập được 2 sesquiterpene lactone mới: vernodalin và vernomygdin [4]

Năm 1972, E O Arene đã tách được 7,24(28)-Stigmastadien-3β-ol [5]

Năm 1983, Iraj Ganjian và cộng sự đã phân lập được vernodalin, vernodalol và 1 sesquiterpene lactone mới là 11,13-dihydrovernodalin [6] Laekeman và các cộng sự cô lập được vernolepin từ quả Lá Đắng [7]

Năm 1991, Hajime Ohigashi và cộng sự đã cô lập được vernonioside A1

O Igile và cộng sự đã cô lập được 3 flavone là luteolin, luteolin glucuronoside, luteolin 7-O-β-glucoside [12]

7-O-β-Năm 1995, Godwin O Igile và các cộng sự đã cô lập được 2 steroid glycoside là vernonioside D và E [13]

Năm 2010, Xuan Luo và các cộng sự phân lập được vernodalinol [14] Năm 2015, Annamarria Sinisi và các cộng sự cũng tìm ra được 3

sesquiterpene lactone mới: 14-O-methylvernolide, 3′-deoxyvernodalol,

vernomygdalin và 5 sesquiterpene lactone đã biết: vernolide, dihydrovernolide, 3′-hydrovernolide, vernodalol và 12-methoxyvernolepin [15] M M Zenebe và cộng sự cô lập được hợp chất 3-amino-5-methylhex-5-en-1-yl (3-amino-6-methylhept-6-en-1-yl) [16]

11,13-Năm 2016, Olga Quasie và cộng sự đã phân lập được 4 steroid saponin mới: vernoamyoside A, B, C và D [17]

6

2.2.3 Tổng hợp thành phần hóa học đã được nghiên cứu trên cây Lá

đắng (Vernonia amygdalina Del.)

Thông qua các tài liệu nghiên cứu cho thấy rằng thành phần hóa học

chính trong cây Lá đắng (Vernonia amygdalina Del.) là sesquiterpene lactone,

steroid glycoside và flavonoid [2,4-22]

Bảng 2.1 Thành phần hóa học đã công bố của cây Lá đắng

15

2.3 Các nghiên cứu về dược tính của cây Lá đắng

2.3.1 Y học dân gian

Vernonia amygdalina Del đã được sử dụng rộng rãi từ rất lâu, các kinh

nghiệm đúc kết trong nhân gian được tóm tắt trong bảng sau:

Bảng 2.2 Lá đắng theo y học cổ truyền của một số quốc gia trên thế giới [2] Quốc gia Cách sử dụng Điều trị bệnh

Ethiopia Lá Rối loạn dạ dày, vết thương ngoài da, viêm

amidan, sốt, nhiễm giun

Congo Lá và vỏ rễ Tiêu chảy, lỵ, sốt rét

Ghana Nước sắc từ lá Sốt rét, ung nhọt, giảm đau

Gabon Nước ép từ lá Nấm da

Guinea Nước sắc từ lá Ho

Tây Phi Trà rễ Lợi tiểu, nhiễm trùng da

Rễ HIV (giảm sốt, đau, ho)

Uganda Lá Co giật, co thắt tử cung, kinh nguyệt không

đều, vô sinh

2.3.2 Hoạt tính sinh học theo nghiên cứu hiện đại

Theo kết quả của các nhà nghiên cứu trên thế giới về loài Vernonia amygdalina Del cho thấy rằng chúng có nhiều tác dụng sinh học đáng để quan

tâm, đặc biệt là các hoạt tính có tiềm năng ứng dụng điều trị các bệnh nguy hiểm và phổ biến hiện nay, cũng như hỗ trợ điều trị các bệnh nan y

Các hoạt tính sinh học chính của Vernonia amygdalina được liệt kê dưới

16

+ Bảo vệ gan: cao ethanol của lá có tác dụng tăng cường hoạt động của ALT và giảm nồng độ albumin huyết thanh ờ 50 mg/kg bw và 100 mg/kg bw với tác nhân INH 27 mg/kg bw, rifampicin 54 mg/kg bw [32]

+ Hạ lipid máu: cao methanol của lá làm tăng high-density lipoprotein Điều này có thể ứng dụng trong điều trị bệnh về tim mạch [34]

+ Giảm béo phì: giảm trọng lượng cơ thể, giảm triglyceride trong máu, đây là kết quả nghiên cứu khi cho thỏ ăn bằng bột của lá cây Lá đắng [35] + Đái tháo đường: cao chloroform, ethanol, nước của lá có tác dụng giảm nồng độ glucose trong máu [36,37]

+ Sốt rét: tiêu diệt ký sinh trùng Plasmodium berghei [38-41]

+ Kháng oxy hóa: hoạt tính này được thực hiện trên cao petroleum, chloroform, methanol, nước của lá và một số sesquiterpene với các tác nhân DPPH và ABTS [42,43]

+ Kháng khuẩn, kháng nấm: các sesquiterpene lactone có hoạt tính trên

nhiều dòng vi khuẩn (Bacillus subtilis, Micrococcus lutea, Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens, Bacillus cereus, Staphylococcus epidermidus, Staphylococcus aureus, Micrococcus kristinae, Streptococcus pyrogens, Salmonella pooni, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonae), cũng như các dòng nấm (Aspergillus flavus, Mucor hiemalis, Fusarium oxysporum, Penicillium notatum, Aspergillus niger) [18, 44-46]

+ Theo kết quả nghiên cứu, hai nhóm hợp chất sesquiterpene lactone và

steroid glucoside có khả năng tiêu diệt ký sinh trùng sán lá máu Schistosoma japonicum Loài ký sinh trùng này thường sinh sống trong các vùng nước ô

nhiễm ở Trung Quốc, Philippines, Indonesia và gây ra nhiều bệnh nguy hiểm

Người bị nhiễm Schistosoma japonicum thường đến từ các cộng đồng nghèo

và vùng nông thôn [48]

Ngoài ra, cây Lá đắng còn được người dân dùng như một loại rau ăn, làm thức ăn cho động vật, vì cây Lá đắng có thành phần dinh dưỡng tương tự như các loại thực phẩm khác [49]

17

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Hóa chất

Dung môi (Chemsol, Việt Nam): petroleum ether, n-Hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, n-Butanol, acetone và methanol

Vanillin, H2SO4 đậm đặc và nước cất dùng để pha thuốc thử hiện vết

Na2SO4 được dùng để làm khan dung môi

Silica gel 60 (Merck): 0,04-0,063mm dùng cho sắc ký cột pha thường

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Tủ sấy Ecocell

Máy cô quay chân không Heidolph

Bếp điện Blacker®

Máy soi UV (bước sóng 254 nm)

Cột sắc ký có các đường kính (Φ) và chiều dài (l) khác nhau

Cân OHAOUS PA214 và GM 612

Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản nhôm silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn dày 0,2 mm

Một số dụng cụ khác như lọ thủy tinh, becher, bình chiết, đũa thủy tinh, ống mao quản,…

Thiết bị ghi phổ: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, DEPT, HSQC, HMBC được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz

3.2 Phương pháp nghiên cứu [50-51]

3.2.1 Phương pháp cô lập chất

Áp dụng các phương pháp thường quy trong tách chiết hợp chất thiên nhiên như:

3.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số hóa lý đặc trưng như màu sắc, dạng tinh thể, hằng số Rf, hấp thu quang phổ, khả năng hòa tan trong các loại dung môi,…

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm Các loại phổ 1D NMR, 2D NMR, ESI-MS được đo tại Phòng NMR-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Ngoài ra còn kết hợp với những dữ liệu phổ trong tài liệu tham khảo để

đề nghị cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được

3.3 Thực nghiệm

3.3.1 Thu hái và xử lí mẫu

Nguyên liệu sử dụng: lá cây Lá đắng được thu hái tại Q Ninh Kiều, TP

Cần Thơ và được định danh bởi Ts Đặng Minh Quân, Bộ môn Sinh, Khoa

Sư phạm, Đại học Cần Thơ Toàn bộ phần lá cây Lá Đắng sau khi thu hái về được rửa sạch bụi bẩn và loại bỏ lá hư, dập Tiến hành phơi khô trong bóng râm, xay nhuyễn thành bột (14,5 kg)

3.3.2 Điều chế các loại cao

Nguyên liệu sấy khô, xay nhuyễn thành bột (14,5 kg), cho vào các túi vải, buộc kín miệng, sau đó chiết kiệt với methanol bằng phương pháp ngâm dầm Sau thời gian khoảng 24 giờ, dịch chiết được lọc loại bã, tiến hành cô quay thu hồi dung môi Tiếp tục thực hiện nhiều lần để chiết kiệt các chất từ mẫu bột nguyên liệu, thu được cao tổng dạng sệt có khối lượng 2,0 kg Cao tổng hòa tan với nước cất theo tỉ lệ cao:nước (1:1) (v/v), sau đó chiết lần lượt

19

với các dung môi có độ phân cực tăng dần lần lượt n-Hex, DC, Ea và n-BuOH

Dịch chiết từng phân đoạn sau đó được thu hồi dung môi để thu được các cao

tương ứng Quy trình chiết tách được tóm tắt như Hình 3.2

- Ngâm dầm với MeOH

- Lọc bỏ bã

- Cô đuổi dung môi

- Hòa với nước cất

- Chiết kiệt với n-Hex

- Cô đuổi dung môi

- Chiết kiệt với DC

- Cô đuổi dung môi

- Chiết kiệt với Ea

-Cô đuổi dung môi

- Chiết kiệt với n-BuOH

- Cô đuổi dung môi

Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát điều chế các loại cao từ bột lá cây Lá đắng

Bột lá (14,5kg)

Bã bột lá còn lại

(bỏ)

Cao tổng MeOH (2,0kg)

Cao n-Hex (350,0g)

Dịch sau chiết

Dịch sau chiết

Cao DC (16,0g)

Dịch sau chiết

Cao Ea (36,0g)

Cao n-BuOH (125,0g)

Cao MeOH/H2O

20

3.3.3 Khảo sát cao Ea

Cao Ea (36,0g) được sắc ký nhanh-cột khô, chất hấp phụ là silica gel 60

(Merck) Hệ dung môi giải ly cột là ethyl acetate : methanol, tăng dần độ phân cực bằng MeOH và cuối cùng là MeOH 100% Sử dụng SKLM để theo dõi quá trình chạy cột, gom các lọ giống nhau (màu vết và Rf) thu được 6 phân đoạn VE1 – VE6

Bảng 3.1 Kết quả sắc ký nhanh-cột khô cao Ea

Tiểu phân đoạn VE3 (7,4g) được tinh chế tiếp tục bằng sắc ký cột hở và giải ly với ethyl acetate 100% sau đó tăng dần độ phân cực bằng MeOH, thu được 5 phân đoạn VE3.1 – VE3.5

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký phân đoạn VE3

VA.Ea02

Tiểu phân đoạn VE3.5 (1,48g) được tinh chế tiếp tục bằng sắc ký cột hở với dung môi dichloromethane 100%, tăng dần độ phân cực bằng methanol, thu được 7 phân đoạn VE3.5.1 – VE3.5.7 Tiếp tục tinh sạch trên tiểu phân

đoạn VE3.5.6 thu được chất sạch, đặt tên là VA.Ea03

21

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định cấu trúc hợp chất VA.Ea02

Hợp chất VA.Ea02 có kết tinh vô định hình màu vàng (6 mg), hấp thu

UV ở bước sóng λ = 254 nm và Rf = 0,38 trong thuốc thử Fe3+ 5%/ethanol khi thực hiện SKLM với hệ dung môi Ea:Me (8:2)

Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δC ppm) kết hợp với DEPT90,

DEPT135 cho thấy VA.Ea02 có 21 carbon gồm 8 carbon bậc 4 >C=, 12

carbon bậc 3 >CH– và 1 carbon bậc 2 –CH2–

Tín hiệu carbon bậc 4 >C= tại 182,0 ppm ứng với carbon của nhóm carbonyl (>C=O) δC từ 90-170 ppm có 13 tín hiệu carbon , trong đó có một tín hiệu tại 99,9 ppm (mũi đặc trưng của carbon acetal C-1′′) và 5 tín hiệu carbon trong khoảng δC từ 60-80 ppm Từ đó dự đoán VA.Ea02 là một flavone mang một phần đối xứng gắn với đường glucose

Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH ppm (số H; dạng mũi; J = Hz))

cho thấy:

Một tín hiệu proton tại δH = 12,95 ppm chứng tỏ có nhóm –OH gắn tại vị trí số 5 và δH = 6,86 ppm (1H; s) là tín hiệu proton H-3 của khung flavone

Proton δH = 7,96 ppm (2H; d; 9,0) ghép đôi với proton δH = 6,94 ppm

(2H; d; 9,0), nên vòng thơm có hai nhóm thế ở vị trí đối đỉnh nhau

Proton tại δH = 6,83 ppm (1H; d; 2,0) ghép đôi với proton tại δH = 6,45

ppm (1H; d; 2,0) Đây là các tín hiệu proton tại vị trí 6, 8 của khung flavone

tại δC = 99,9 ppm Vì vậy, kết luận được đây là tín hiệu của H-1′′ và đường

glucose nối với aglycon bằng liên kết -O-β-glucoside

Các tín hiệu từ 3,1-3,8 ppm là các tín hiệu proton của đường glucose

Phổ HMBC cho thấy C-7 tương tác với H-1′′ nên đường glucose gắn

vào aglycon tại vị trí số 7

22

Từ các dữ liệu trên có thể kết luận hợp chất VA.Ea02 là apigenin

7-O-β-glucoside

Kết hợp phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC được dữ liệu

phổ của hợp chất VA.Ea02, trình bày trong bảng sau:

Bảng 4.1 Dữ liệu phổ của hợp chất VA.Ea02