KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA CÁC CAO CHIẾT LÁ CÂY SEN HỒNG (Nelumbo nucifera Gaertn)

Trong đề tài này, các cao tổng methanol, cao tổng nước điều chế từ lá Sen được đưa vào thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng các phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH và ABTS phương phá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC - -

HUỲNH TUẤN KHOA

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA CÁC CAO CHIẾT

LÁ CÂY SEN HỒNG (Nelumbo nucifera Gaertn)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC - -

HUỲNH TUẤN KHOA

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA CÁC CAO CHIẾT

LÁ CÂY SEN HỒNG (Nelumbo nucifera Gaertn)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS NGUYỄN TRỌNG TUÂN

2017

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: TS Nguyễn Trọng Tuân

2 Tên đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết lá cây

Sen hồng (Nelumbo nucifera Gaertn)”

3 Sinh viên thực hiện: Huỳnh Tuấn Khoa MSSV: B1303927

b) Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1 Cán bộ phản biện:

………

2 Tên đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết lá

cây Sen hồng (Nelumbo nucifera Gaertn)”

3 Sinh viên thực hiện: Huỳnh Tuấn Khoa MSSV: B1303927 Lớp: Hóa Dược 1 - K39

4 Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

b) Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

………

 Những vấn đề còn hạn chế:

c) Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

d) Kết luận, đề nghị và điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2017

LỜI CẢM ƠN



Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp cũng như quá trình học tập và làm việc tại trường, để có được kết quả này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và lời tri ân đến:

Thầy Nguyễn Trọng Tuân đã tận tình chỉ dẫn, khuyến khích và tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn, giúp em định hướng được con đường nghiên cứu khoa học của riêng mình

Cám ơn quý Thầy, Cô và các anh, chị trong bộ môn Hóa Học - khoa Khoa Học Tự Nhiên - trường Đại học Cần Thơ đã tận tình chỉ dạy, hỗ trợ cho

em những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học tập ở trường Đồng thời tạo điều kiện tốt nhất cho em về trang thiết bị, dụng cụ để thực hiện luận văn

Cuối cùng, gia đình là chỗ dựa vững chắc cho con để vượt qua mọi khó khăn, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ đã luôn ủng hộ, động viên và chăm lo cho con về vật chất lẫn tinh thần

Trân quý!

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và cán bộ hướng dẫn Kết quả nghiên cứu này chưa được sử dụng cho bất kỳ luận văn cùng cấp nào

TÓM TẮT

Cây Sen là một loài thủy sinh đặc biệt, mỗi bộ phận của Sen đều chữa được bệnh Đối tượng nghiên cứu của luận văn là lá Sen hồng (Nelumbo nucifera Gaertn) Trong đề tài này, các cao tổng methanol, cao tổng nước điều chế từ lá Sen được đưa vào thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng các phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH và ABTS phương pháp khử sắt (reducing power - RP)

Khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH: cao methanol (EC50

= 24.0735 g/mL) và cao nước (EC50 = 42.1036 g/mL) Khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp ABTS: cao methanol (EC50 = 11.8102 g/mL) và cao nước (EC50 = 19.3288 g/mL) Khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp khử sắt (RP) nồng độ mẫu tại giá trị OD là 0.8 của cao methanol, cao nước lần lượt

là 202 g/mL, 360.4 g/mL

Từ khóa: Sen hồng, chất kháng oxy hóa, gốc tự do, DPPH, ABTS,

reducing power, in vitro

MỤC LỤC

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN I NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN II LỜI CẢM ƠN III LỜI CAM KẾT IV TÓM TẮT V MỤC LỤC VI DANH MỤC BẢNG IX DANH MỤC HÌNH X DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT XI

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CÂY SEN 3

2.1.1 PHÂN LOẠI 3

2.1.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 3

2.1.3 PHÂN BỐ SINH THÁI 4

2.1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4

2.1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 5

2.1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 5

2.1.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 5

2.1.6 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA LÁ SEN TRONG Y HỌC DÂN GIAN 7

2.2 TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN OXY HÓA 8

2.2.1 KHÁI NIỆM VỀ TÁC NHÂN OXY HÓA 8

2.2.1.1 Tác nhân oxy hóa không phải là gốc tự do 8

2.2.1.2 Gốc tự do 8

2.2.1.3 Tác nhân oxy hóa chứa oxy hoạt động 8

2.2.1.4 Tác nhân oxy hóa chứa nitro hoạt động 9

2.2.2 NGUỒN GỐC PHÁT SINH CÁC TÁC NHÂN OXY HÓA 9

2.2.2.1 Gốc tự do nội sinh 9

2.2.2.2 Gốc tự do ngoại sinh 10

2.2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC TÁC NHÂN OXY HÓA ĐẾN CƠ THỂ 10

2.2.3.1 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể 10

2.2.3.2 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể 10

2.3 CHẤT KHÁNG OXY HÓA 11

2.3.1 Chất kháng oxy hóa có bản chất enzyme 11

2.3.2 Chất kháng oxy hóa không có bản chất enzyme 13

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG TIỆN 16

3.1.1 THỜI GIAN 16

3.1.2 ĐI ̣A ĐIỂM 16

3.1.3 PHƯƠNG TIỆN 16

3.1.3.1 Nguyên liệu 16

3.1.3.2 Hó a chất 16

3.1.3.3 Dụng cu ̣ và thiết bi ̣ 17

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.2.1 PHƯƠNG PHÁP THU VÀ XỬ LÍ MẪU 18

3.2.2 PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 18

3.2.2.1 Điều chế cao Methanol tổng bằng phương pháp ngâm dầm 18

3.2.2.2 Phương pháp trích nóng cao nước 19

3.2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 20

3.2.3.1 Phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH 20

3.2.3.2 Phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS.+ 24

3.2.3.3 Phương pháp khử sắt (RP) 27

3.2.4 THỐNG KÊ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 30

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 KẾT QUẢ THU HÁI VÀ XỬ LÍ MẪU 31

4.2 HIỆU SUẤT CHIẾT CAO 31

4.3 KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA 32

4.3.1 KHẢ NĂNG TRUNG HÒA GỐC TỰ DO DPPH 32

4.3.1.1 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của vitamin C 32

4.3.1.2 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của cao methanol 33

3.3.1.3 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của cao nước 34

4.3.1.4 So sánh khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của vitamin C và cao methanol, cao nước lá Sen 35

4.3.2 KHẢ NĂNG TRUNG HÒA GỐC TỰ DO ABTS 36

4.3.2.1 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS của Trolox 36

4.3.2.2 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS của cao methanol 37

4.3.2.3 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS của cao nước 38

4.3.2.4 So sánh khả năng trung hòa gốc tự do ABTS của các cao với Trolox 39

4.3.3 KHẢ NĂNG KHỬ SẮT (REDUCING POWER) 40

4.3.3.1 Khả năng khử sắt của BHA 40

4.3.3.2 Khả năng khử sắt của cao methanol 41

4.3.3.3 Khả năng khử sắt của cao nước 41

4.3.3.4 So sánh khả năng khử sắt của cao chiết và chất đối chứng BHA 42 4.3.3 HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA BA PHƯƠNG PHÁP 43

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

5.1 KẾT LUẬN 45

5.2 KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC A ĐƯỜNG CHUẨN 48

PHỤ LỤC B SỐ LIỆU 50

PHỤ LỤC C HÌNH ẢNH 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3 1 Quy trình thử nghiệm vitamin C 22

Bảng 3 2 Quy trình thử nghiệm cao methanol với DPPH 23

Bảng 3 3 Quy trình thử nghiệm cao nước với DPPH 23

Bảng 3 4 Quy trình thử nghiệm Trolox 26

Bảng 3 5 Quy trình thử nghiệm cao methanol với ABTS 26

Bảng 3 6 Quy trình thử nghiệm cao nước với ABTS 27

Bảng 3 7 Pha dãy nồng độ BHA 28

Bảng 3 8 Pha dãy nồng độ cao methanol 29

Bảng 3 9 Pha dãy nồng độ cao nước 29

Bảng 4 1 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của vitamin C 32

Bảng 4 2 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của cao methanol lá Sen 33

Bảng 4 3 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH của cao nước lá Sen 34

Bảng 4 4 Phương trình hồi quy theo hiệu suất loại bỏ gốc tự do và giá trị EC50 35

Bảng 4 5 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS của Trolox 36

Bảng 4 6 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS của cao methanol lá Sen 37

Bảng 4 7 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS của cao nước lá Sen 38

Bảng 4 8 Phương trình hồi quy theo hiệu suất loại bỏ gốc tự do và giá trị EC50 39

Bảng 4 9 Giá trị độ hấp thu OD của BHA theo nồng độ (g/mL) 40

Bảng 4 10 Khả năng khử sắt của cao methanol 41

Bảng 4 11 Khả năng khử sắt của cao nước 41

Bảng 4 12 Phương trình hồi quy và nồng độ mẫu tại giá trị OD 0.8 42

Bảng 4 13 Khả năng kháng oxy hóa của 3 phương pháp 43

Bảng B 1 Giá trị OD của Vitamin C 50

Bảng B 2 Giá trị OD của Trolox 50

Bảng B 3 Giá trị OD của BHA 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1 Hoa Sen 3

Hình 2 2 Lá Sen 3

Hình 3 1 Ngâm dầm nguyên liệu lá Sen với methanol 18

Hình 3 2 Cô quay cao methanol 18

Hình 3 3 Lọc dịch trích nóng 19

Hình 3 4 Cô quay cao nước 19

Hình 4 1 Lá Sen cắt nhỏ phơi khô 31

Hình 4 2 Cao tổng 31

Hình A 1 Đường chuẩn vitamin C theo nồng độ 48

Hình A 2 Đường chuẩn Trolox theo nồng độ 48

Hình A 3 Đường chuẩn BHA giá trị OD theo nồng độ 49

Hình C 1 Dịch chiết methanol 52

Hình C 2 Dụng cụ thí nghiệm 52

Hình C 3 Máy đo pH 53

Hình C 4 Tiến hành thí nghiệm 53

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ABTS 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazonline-6-sulfonate

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Trong lĩnh vực sức khỏe hiện nay, người ta nói đến nhiều tác hại của chất oxy hoá, gốc tự do, phản ứng oxy hoá, stress oxy hóa và nhấn mạnh sự cần thiết

sử dụng chất chống oxy hoá để bảo vệ, duy trì sức khỏe

Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxy hóa Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm trong đó có ung thư, các bệnh tim mạch các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkison) và lão hóa sớm

Để chống lại sự bội tăng các gốc tự do sinh ra quá nhiều mà hệ thống

"chất oxy hoá nội sinh" không đủ sức cân bằng để vô hiệu hoá, các nhà khoa học đặt vấn đề dùng các "chất chống oxy hóa ngoại sinh" (tức là từ bên ngoài đưa vào cơ thể) với mục đích phòng bệnh, nâng cao sức khỏe, chống lão hóa Các chất chống oxy hóa ngoại sinh đó đã được xác định, đó là beta-caroten, chất khoáng selen, các hợp chất flavonoid, polyphenol Các chất oxy hóa ngoại sinh

đó thật ra không xa lạ, chúng có từ các nguồn thiên nhiên là thực phẩm như rau cải, trái cây tươi, một số loại hoa và dược thảo

Theo kinh nghiệm dân gian, lá sen phơi khô được dùng để pha trà uống,

có khả năng chữa chứng mất ngủ, cảm nắng, khắc phục bệnh đường tiêu hóa Đông y cũng ghi chép kỹ lưỡng về công dụng của cây sen với sức khỏe

Khoa học hiện đại cũng đã khám phá những thành phần dưỡng chất tuyệt vời trong lá sen khô, điển hình là hợp chất flavonoid và alkaloid Flavonoid là chất chống oxy hóa điển hình, có khả năng ức chế quá trình oxy hóa lipid màng

tế bào gan ruột, nhờ vậy mà chống được tình trạng xuất huyết dưới da, sốt xuất huyết, đại tiện ra máu,… Bên cạnh đó, lá sen phơi khô cũng giàu nuciferin, có tác dụng hạ huyết áp, cầm máu, giải co thắt cơ trơn,…

Trên cơ sở các nghiên cứu ngoài nước về hoạt tính kháng oxy hóa của lá

Sen, đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết lá cây Sen hồng (Nelumbo nucifera Gaertn)” được thực hiện và làm sáng tỏ được phần

nào kinh nghiệm sử dụng thuốc trong dân gian ở Việt Nam

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết lá cây Sen hồng bằng 3 phương pháp kháng oxy hóa: trung hòa gốc tự do DPPH, trung hòa gốc tự do ABTS+, khử sắt (reducing power - RP) ở mức độ thử nghiệm in vitro

1.3 Nội dung nghiên cứu

Tìm hiểu sơ bộ về nguyên liệu lá Sen

Tiến hành thu hái và xử lí nguyên liệu lá Sen

Tiến hành ngâm dầm, trích nóng nguyên liệu, cô quay thu mẫu cao tổng

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây cây Sen

-Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn

-Tên tiếng Anh: Sacred Lotus

-Tên đồng nghĩa: Nelumbium speciosum (Willd.), Nymphaea nelumbo -Tên gọi khác: sen hồng , sen đỏ, sen Ấn Độ; hà hoa, liên hoa, hạm đạm, phù cừ, thủy chi [1]

Hình 2 1 Hoa Sen

2.1.1 Phân loại

Họ (familia): Sen (Nelumbonaceae)

Loài (species): Nelumbo nucifera [1]

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Hình 2 2 Lá Sen

Sen là loài thực vật thủy sinh, rễ, thân, cuốn lá đều nằm dưới mặt nước, chỉ có phiến lá nằm ngay mặt nước và cuốn hoa vươn khỏi mặt nước

- Thân: Thân Sen là thân ngầm dạng củ mọc trong bùn, còn được gọi là

củ Sen Củ có hình thuôn dài, thịt củ màu trắng, ăn được, có nhiều ngăn trống xếp theo vòng đồng tâm với trục củ

- Rễ: Rễ mọc từ củ Sen hoặc từ đốt rễ, có nhiều nhánh mọc lan tỏa trong bùn

- Lá: Gồm có cuốn lá hình trụ mọc từ thân ngầm, có nhiều gai, nằm trong nước Phiến lá to hình tròn đường kính 30-60 cm, góc lõm, mọc vươn khỏi mặt nước

- Hoa: Hoa thường mọc trên các thân to và nhô cao vài mươi cm phía trên mặt nước Có nhiều giống Sen được trồng, với màu hoa dao động từ màu trắng như tuyết tới màu vàng hay hồng nhạt

-Quả: Là gương Sen xốp, có 10-20 hạt đính trong thịt quả, quả nhô khỏi mặt nước

-Hạt: Hình thuôn ngắn, kích thước 10 x 15 cm.[1]

2.1.3 Phân bố sinh thái

Cây Sen có nguồn gốc từ vùng bờ sông Nin ở Ai Cập Người Ai Cập cổ đại sùng kính hoa Sen và sử dụng nó trong các nghi thức tế lễ Từ Ai Cập nó đã được đem đến Assyria và sau đó được trồng rộng rãi khắp các vùng Ba Tư, Ấn

Độ và Trung Quốc

Cây Sen cũng có thể là loài cây bản địa ở khu vực Đông Dương, nhưng

ở đây có cơ sở kết luận Hoa Sen là quốc hoa của Ấn Độ

Ở Việt Nam cây Sen được trồng trong ao hồ khắp cả nước Ở Nam Bộ cây Sen địa phương còn mọc hoang ở nhiều nơi thuộc vùng Đồng Tháp Mười

và Tứ giác Long Xuyên (nên phân biệt với các giống Sen trồng nhập nội gần đây từ Trung Quốc và Đài Loan).[1]

2.1.4 Thành phần hóa học

Lá Sen có alcaloid (0,77 – 0,84%), trong đó có nuciferin, nor-nuciferin, roemerin, anonain, liriodenin, pronuciferin, O-norciferin, armepavin, N-nor armepavin, methyl-corlaurin, nepherin, dehydroemerin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N-methylisocorlaurin

Trong đó nuciferin là alcaloid chính Ngoài ra trong lá Sen còn có flavonoid, tanin, acid hữu cơ Trong tâm Sen có nhiều alcaloid (0,85 – 0,96%),

trong đó có liensinin, isoliensinin, neferin, lotusin, nuciferin, pronuciferin, methylcorypallin, demetylcorlaurin.[2,3] Hàm lượng alcaloid trong lá Sen thay đổi theo tuổi và thời vụ thu lá

Chính những chất chống oxy hóa mạnh như:flavonoid, nuciferine, lotusine, demethyl coclaurine neferin, giúp ngăn ngừa bệnh tim mạch, đột quỵ

và ung thư, duy trì sự trẻ trung của cơ thể

Khoa học hiện đại cũng đã khám phá những thành phần dưỡng chất tuyệt vời trong lá sen khô, điển hình là hợp chất flavonoid và alkaloid Flavonoid là chất chống oxy hóa điển hình, có khả năng ức chế quá trình oxy hóa lipid màng

tế bào gan ruột, nhờ vậy mà chống được tình trạng xuất huyết dưới da, sốt xuất huyết, đại tiện ra máu Các Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá

Ngoài ra, còn có một số hợp chất khác như: vitamin C, axit xitric, axit tartric, axit oxalic

2.1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu về cây Sen Nhưng những nghiên cứu ứng dụng cây Sen chủ yếu để phục vụ trong dân gian và trong

y học cổ truyền

Lê Thị Hằng (2009) Nghiên cứu định lượng nuciferin trong lá sen của một số chế phẩm từ lá sen-khóa luận tốt nghiệp dược sĩ-trường đại học dược Hà Nội Nguyễn Thị Nhung (2001) nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh lí của cây sen-luận án tiến sĩ dược học – đại học dược Hà Nội

2.1.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Theo nghiên cứu của Lin HY, Kuo YH, Lin YL và Chiang W dịch chiết

từ lá sen của loài Nelumbo nucifera có khả năng chống oxy hóa Trong đó, dịch chiết của lá sen với hệ dung môi: ethyl acetate – methanol và hệ dung môi: methanol – n-butanol có tác dụng chống oxy hóa cao hơn hệ dung môi: methanol – nước nghiên cứu còn phân lập được bảy flavonoid bằng sắc kí cột Các hợp chất này được xác định là catechin, quercetin, quercetin-3-O-glucopyranoside, quercetin-3-O-glucuronide, quercetin-3-O-galactopyranoside, kaempferol-3-O-glucopyranoside và myricetin-3Oglucopyranoside Trong đó quercetin, quercetin-3-O-galactopyranoside và myricetin3-Oglucopyranoside có tác dụng

ức chế mạnh quá trình oxy hóa Kết quả cho thấy, khả năng chống oxy hóa của

lá sen được giải thích bởi các flavonoid [4]

Theo nghiên cứu của Huang CF, Chen YW, Yang CY, Lin HY, Way TD, Chiang W và Liu SH, dịch chiết từ lá sen của loài Nelumbo nucifera có khả năng điều chỉnh nồng độ đường trong máu ở những con chuột bình thường và chuột mắc bệnh tiểu đường Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất catechin trong dịch chiết lá sen làm quá trình sản sinh ra insulin được nhanh hơn đồng thời làm giảm khả năng hấp thụ glucose ở chuột mắc bệnh tiểu đường Dịch chiết của lá sen

mở ra một hướng nghiên cứu cho việc kiểm soát tăng đường huyết ở người mắc bệnh tiểu đường mà không phụ thuộc vào insulin [5]

Theo nghiên cứu của Ohkoshi E , Miyazaki H , K Shindo , Watanabe H, Yoshida A và Yajima H lá của loài sen Nelumbo nucifera có tác dụng lợi tiểu

và được sử dụng để điều trị bệnh béo phì Dịch chiết từ lá sen với ethanol có tác dụng sản sinh ra lipolysis và các thụ thể beta-adrenergic , đây là các chất có tác dụng trong việc chống béo phì Thí nghiệm được thực hiện bằng cách bổ sung dịch chiết lá sen vào chế độ ăn uống giàu chất béo của chuột Kết quả cho thấy trọng lượng của chuột đã giảm đi đáng kể Bằng phương pháp sắc kí , đã xác định được các hợp chất flavonoid gồm: quercetin 3-O-alpha-arabinopyranosyl -beta-galactopyranoside, rutin ,catechin , hyperoside, isoquercitrin, quercetin và astragalin Như vậy, tác dụng của lá sen trong việc ngăn ngừa bệnh béo phì được giải thích bởi các flavonoid khác nhau có trong lá sen có tác dung kích hoạt các beta- adrenergic và lipolysis được tham gia vào quá trình chống béo phì [6]

Theo nghiên cứu của Takefumi Sagara, Naoyoshi Nishibori, Manami Sawaguchi, Takara Hiro, Mari Itoh, Song Her và Kyoji Morita thì các tế bào thần kinh đệm có tác dụng để duy trì tính toàn vẹn của chức năng não thông qua việc bảo vệ các tế bào thần kinh chống lại yếu tố độc hại khi sắt tích tụ trong

mô não Do đó, việc bảo vệ các tế bào thần kinh đệm có ý nghĩa đối với phòng chống bệnh thoái hóa thần kinh Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất từ gốc sen (thân rễ của Nelumbo nucifera) với nước có tác dụng bảo vệ các tế bào thần kinh đệm chống lại các tế bào đôc hại Điều này được giải thích bởi hợp chất polyphenolic có trong rễ sen, có tác dụng chống oxy hóa mạnh Trên thực tế, chiết xuất rễ sen ngăn chặn sắt gây ra quá trình oxy hóa, nhưng không làm thiếu oxy đến các tế bào [7]

Và nhiều công trình nghiên cứu ngoài nước về hoa ̣t tính sinh học của cây sen như Hoạt tính chống oxy hoá của chiết xuất Methanol của lá sen ( Nelumbo nucifera Gertn.) - Tạp chí y học Trung Quốc Hoa Kỳ

Yujie Guo , Xi Chen , Jin Qi , Boyang Yu (2016) Phân tích chất lượng

và định lượng đồng thời flavonoid và alkaloid từ lá của Nelumbo nucifera Gaertn Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao với quang phổ khối lượng thời gian bay của quadrupole

Ming-Zhi Zhu , Wu Wu , Li-Li Jiao , Ping-Fang Yang , Ming-Quan Guo (2015) Phân tích flavonoid trong lá sen (Nelumbo nucifera) và hoạt tính chống oxy hoá của chúng bằng phương pháp sắc ký màu Macroporous Resin cùng với LC-MS / MS và các bài kiểm tra hóa học chống oxy hoá

Bo Huang , Xiaoquan Ban , Jingsheng Ông , Tĩnh Tông , Jun Tian , Youwei Wang (2010) Hoạt động chống oxy hoá và chống oxy hoá của các chiết xuất ethanol của hoa sen ăn được (Nelumbo nucifera Gaertn.)

2.1.6 Một số ứng dụng của lá sen trong y học dân gian

Theo đông y lá sen có vị đắng tính bình, vào 3 kinh can, tỳ và vị Có tác dụng thăng thanh tán ứ, thanh thử hành thủy Dùng chữa thử thấp tiết tả, thủy chí phù thủng, lôi đầu phong, nôn ra máu, máu cam, băng trung huyết lỵ[8] Một

số bài thuốc nam có sử dụng lá sen:

- Chữa mất ngủ: Lá sen loại bánh tẻ 30g rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô sắc hoặc hãm uống

- Chữa tăng huyết áp: Đẳng sâm 6g, bán hạ 10g, tuyền phúc hoa 10g, thiên ma 6g, lá sen 10g, trần bì 6g, thạch quyết minh 10g, uống ngày 1 thang chia hai lần sớm, tối Dùng cho người cao huyết áp, mắt hoa tai ù, mơ nhiều mất ngủ

- Chữa băng huyết, chảy máu cam, tiêu chảy ra máu: Lá sen 40g để sống, rau má 12g sao vàng, thái nhỏ, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm hai lần trong ngày

- Chữa chảy máu não và các biến chứng kèm theo ở bệnh nhân tăng huyết áp: Lá sen 15g, cam thảo 15g, đỗ trọng 12g; sinh địa, mạch môn, tang ký sinh, bạch thược mỗi vị 10g Sắc uống ngày một thang

- Chữa chảy máu cam: Lá sen 15g, hoàng liên 2g, thanh hao 6g, lá tre 10g, mộc thông 10g, đan bì 10g, liên kiều 5g, hoàng cầm 3g, sơn chi 6g, rễ cỏ tranh 10g Sắc uống ngày 1 thang Dùng cho người bị đổ máu cam, lượng nhiều, máu đỏ tươi hoặc sẫm, mũi khịt khô, miệng hôi, đại tiện táo, tiểu dắt

- Chữa máu hôi không ra hết sau khi sinh: Lá sen sao cho thơm 30g tán nhỏ, uống với nước hoặc sắc với 200ml nước còn 50ml, uống một lần trong ngày

- Chữa di tinh: Lá sen nghiền bột mịn (1kg) Uống ngày 2 lần sớm, tối với nước sôi, mỗi lần 5g

- Chữa váng đầu: Hạch đào nhân 6g, lá sen 10g, đỗ trọng tươi 10g Hạch đào nhân sao vàng giã nát, sắc chung với lá sen, đỗ trọng, bỏ bã lấy nước uống Dùng cho người đầu váng, mắt hoa, tai ù, tai điếc

- Chữa tiêu chảy mãn tính: Gồm liên nhục 12 g, đẳng sâm 12g, hoàng liên 5g Các vị sắc uống hoặc tán bột uống mỗi ngày 10g

- Chữa sốt xuất huyết: Lá sen 40g, ngó sen hoặc cỏ nhọ nồi 40g, rau má 30g, hạt mã đề 20g, sắc uống ngày một thang Nếu xuất huyết nhiều có thể tăng liều của lá và ngó sen lên 60g

- Chữa béo phì, hạ cholesterol trong máu: Đây là công dụng mới được phát hiện của lá sen Trên thị trường hiện có bán nhiều loại trà giảm béo có lá sen, song có thể tự dùng bằng cách nấu lá sen tươi uống thay nước hàng ngày, mỗi ngày 1 lá

2.2 Tổng quan về tác nhân oxy hóa

2.2.1 Khái niệm về tác nhân oxy hóa

2.2.1.1 Tác nhân oxy hóa không phải là gốc tự do

Tác nhân oxy hóa không phải gốc tự do là những nguyên tử, phân tử hoặc ion có khả năng oxy hóa mạnh do đang ở trạng thái oxy hóa cao, dễ dàng nhận thêm electron để đạt trạng thái bền vững hơn; hoặc tác nhân có khả năng xúc tác, kích thích sự hình thành các tác nhân oxy hóa mạnh, chẳng hạn như các kim loại chuyển tiếp Các tác nhân oxy hóa không phải gốc tự do phổ biến như: H2O2

(hydrogen superoxide), HOCl- (hypochlorous acid), O3 (ozone), 1O2 (singlet oxygen), ONOO- (peroxynitrite), Men+ (kim loại chuyển tiếp) [9]

2.2.1.2 Gốc tự do

Gốc tự do là các nguyên tử, phân tử hoặc ion có một hay nhiều electron hóa trị chưa ghép cặp (mang điện tử lẻ) Sự hiện diện của electron chưa ghép đôi này làm cho các gốc tự do bất ổn định và có khả năng phản ứng hóa học rất cao, dễ dàng tương tác electron bằng các phản ứng oxy hóa-khử với các phân tử chất khác phần lớn là lipid, acid nucleic, protein tạo nên các gốc tự do mới và hình thành một chuỗi phản ứng dây chuyền, từ đó gây thiệt hại trên các tế bào [10] Bên cạnh đó, gốc tự do cũng có thể kết hợp với nhau bằng các phản ứng dimer hóa, polymer hóa Gốc tự do có thể tồn tại độc lập nhưng chỉ trong khoảng thời gian rất ngắn, hoặc với nồng độ rất thấp trong môi trường trơ hoặc chân không Các gốc tự do phổ biến như: R3C• (tâm carbon), R2N• (tâm nito), RO•(tâm oxy), RS• (tâm lưu huỳnh) [9]

2.2.1.3 Tác nhân oxy hóa chứa oxy hoạt động

Có nhiều loại tác nhân oxy hóa, nhưng được quan tâm nhất trong các hệ thống sinh học là các tác nhân chứa oxy hoạt động, được ký hiệu là ROS (reactive oxygen species) Phân tử khí oxy có hai electron chưa ghép cặp nằm trong hai orbital riêng biệt ở lớp vỏ ngoài cùng, cấu trúc điện tử này làm cho oxy đặc biệt nhạy cảm với sự hình thành ROS ROS có thể bao gồm gốc tự do:

•O2- (anion superoxide), •OH (hydroxyl), RO• (alkoxyl), ROO• (peroxyl), HOO• (hydroperoxyl); và các tác nhân không phải gốc tự do: H2O2 (hydrogen superoxide), ROOH (hydroperoxide hữu cơ), O22- (anion peroxide) [9]

Sự hình thành các ROS phổ biến trong cơ thể từ oxy:

O2 → •O2- → O22- → H2O2 → •OH [9]

2.2.1.4 Tác nhân oxy hóa chứa nitro hoạt động

Cũng như ROS, RNS (reactive nitrogen species) là những tác nhân oxy hóa có chứa nitro hoạt động nhưng ít được quan tâm hơn ROS trong các hệ thống sinh học RNS cũng bao gồm gốc tự do: NO• (nitric oxide), NO2• (nitrogen dioxide); và các tác nhân không phải gốc tự do: ONOO- (peroxynitrite) [9]

2.2.2 Nguồn gốc phát sinh các tác nhân oxy hóa

Các gốc tự do luôn luôn được hình thành từ nhiều con đường khác nhau,

từ chính cơ thể sinh vật sinh ra hay từ các yếu tố như môi trường khói bụi ô nhiễm, thức ăn độc hại, thuốc lá… Vì vậy, gốc tự do được chia thành hai loại là gốc tự do nội sinh và ngoại sinh

2.2.2.1 Gốc tự do nội sinh

Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh được hình thành do những quá trình chuyển hóa tự nhiên trong cơ thể Chẳng hạn như trong chuỗi chuyền điện tử của hô hấp tế bào, một số điện tử có thể bị rò rỉ, sau đó chúng tương tác với oxy

và hình thành nên gốc superoxide Khoảng 2-5% oxy sử dụng cho trao đổi chất hiếu khí trong ty thể chuyển hóa thành gốc tự do có nhóm oxy hoạt động (reactive oxygen species-ROS) Bên cạnh đó, quá trình thực bào của các tế bào bạch cầu khi có các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể củng sinh ra các gốc tự do, thông qua việc hoạt hóa enzyme NADPHoxidase ở màng bạch cầu, enzyme này xúc tác cho phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên gốc tự do superoxide O2●−, từ

đó tạo ra nhiều gốc tự do khác nhằm tiêu diệt các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể

Các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể còn có thể tham gia vào các phản ứng tạo gốc tự do, ion sắt hoặc đồng phân giải lipid hydroperoxide tạo gốc

tự do peroxide, sau đó gốc tự do này tham gia vào phản ứng dây chuyền peroxide hóa lipid gây hại cho cơ thể Ngoài ra, việc vận động gắng sức cũng phát sinh nhiều gốc tự do trong cơ bắp và cơ tim [11]

2.2.3 Ảnh hưởng của các tác nhân oxy hóa đến cơ thể

2.2.3.1 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể

Ở nồng độ thấp hoặc trung bình, các gốc tự do cần thiết cho quá trình trưởng thành của các cấu trúc tế bào và có thể hoạt động như là vũ khí phòng

vệ cho cơ thể chủ Thật vậy, thực bào (bạch cầu trung tính, đại thực bào, bạch cầu đơn nhân) giải phóng các gốc tự do để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh như là một phần của cơ chế bảo vệ của cơ thể chống lại bệnh tật Tầm quan trọng việc tạo ra các gốc tự do chứa oxy bởi hệ thống miễn dịch đã được minh chứng ở những bệnh nhân bị u hạt Những bệnh nhân này bị thiếu NADPH oxidase nên không thể sản xuất được các anion superoxide (O2°ˉ), do đó dẫn đến nhiễm trùng dai dẳng Tác động có lợi khác của gốc tự do liên quan đến vai trò sinh lý trong một số hệ thống tín hiệu tế bào [13]

2.2.3.2 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể

Khi được tạo ra quá mức, các gốc tự do dẫn đến hiện tượng gọi là stress oxy hóa, một quá trình có hại có thể làm thay đổi nghiêm trọng màng tế bào và các cấu trúc khác như protein, lipid, lipoprotein, và acid deoxyribonucleic (DNA) Stress oxy hóa có thể phát sinh khi các tế bào không thể trung hòa được hết các gốc tự do được hình thành Nói cách khác, stress oxy hóa là kết quả của

sự mất cân bằng giữa sự hình thành và trung hòa các gốc tự do Ví dụ như gốc

tự do hydroxyl và peroxynitrite có thể gây tổn hại màng tế bào và lipoprotein bởi một quá trình gọi là sự peroxid hóa lipid Phản ứng này dẫn đến sự hình thành của malondialdehyde (MDA) và các hợp chất diene liên hợp–gây độc tế

bào và gây đột biến Sự peroxid hóa lipid xảy ra bằng một chuỗi phản ứng của gốc tự do, nghĩa là một khi bắt đầu phản ứng lây lan nhanh chóng và ảnh hưởng đến một số lượng lớn các phân tử lipid Protein cũng có thể bị hư hỏng do các gốc tự do chứa oxi hay nitơ, dẫn đến sự thay đổi cấu trúc và mất hoạt tính enzyme Sự oxy hóa phá hủy DNA dẫn đến sự hình thành các tổn thương DNA khác nhau mà có thể gây ra đột biến Cơ thể có một số cơ chế để chống lại sự tấn công của các gốc tự bằng cách sử dụng các enzyme sửa chữa DNA và hoặc chất kháng oxy hóa Nếu không được điều chỉnh đúng, stress oxy hóa có thể gây ra nhiều loại bệnh mãn tính và thoái hóa cũng như quá trình lão hóa và một

2.3.1 Chất kháng oxy hóa có bản chất enzyme

Tất cả các tế bào trong cơ thể đều có chứa enzyme kháng oxy hóa Ba loại chính là superoxide dismutase, glutathion peroxidase và catalase

Superoxide dismutase (SOD)

Superoxide dismutase là các enzyme xúc tác sự phân hủy các anion superoxide O2  thành phân tử O2 và H2O2

Có 3 dạng superoxide dismutase trong tế bào động vật có vú, mỗi dạng nằm trong một loại tế bào cụ thể và phân bố ở các mô khác nhau [15, 16]:

Đồng kẽm superoxide dismutase (CuZn-SOD): CuZn-SOD được tìm thấy trong bào tương và hầu hết các bào quan của tế bào, bao gồm hai đơn vị protein

Mangan superoxide dismutase (Mn-SOD): được tìm thấy trong ty thể của hầu hết tế bào bao gồm 4 đơn vị protein, trình tự acid amin hoàn toàn khác so với CuZn-SOD và không bị ức chế bởi cyanua, cho phép phân biệt giữa hai loại trong hỗn hợp hai enzyme

Ngoại bào superoxide dismutase (EC-SOD): được tìm thấy trong chất nền ngoại bào của các mô, giúp ngăn chặn tế bào và mô bị tổn thương do ROS gây ra Ngoài ra, EC-SOD còn đóng vai trò trung gian oxide nitric trong việc truyền tín hiệu và cũng đóng vai trò trong điều chỉnh trương lực máu

Glutathion peroxidase va ̀ Glutathion reductase

Glutathion peroxidase (GPX) chuyển đổi glutathion (GSH), một tripeptide gồm glutamate, cysteine và glycine, thành glutathion da ̣ng oxy hóa (còn gọi là glutathion disulfide, GSSG), đồng thời trong quá trình này khử hydrogen peroxide (H2O2) và hydroperoxide hữu cơ (ROOH) thành nước và rượu ổn định hơn Khi có mă ̣t của glutathion reductase (GR) thì GSSG trở la ̣i thành dạng GSH thông qua NADPH Tế bào thần kinh dễ bi ̣ tổn thương bởi gốc

tự do nếu lượng GSH ở mức đô ̣ thấp và GPX sẽ đóng vai trò quan tro ̣ng trong việc bảo vê ̣ các tế bào khỏi sự phân hủy của peroxide [17] Glutathion reductase (GR) bảo vệ các tế bào máu và màng tế bào khỏi stress oxy hóa bằng cách ta ̣o

ra GSH Thiếu riboflavin dẫn đến giảm hoa ̣t đô ̣ng của GR [18]

Catalase (CAT)

Thường được mô tả như là “chất xúc tác hoàn hảo”, catalase thể hiện tốc

độ phản ứng rất nhanh, có thể phân hủy hàng triệu phân tử H2O2 thành phân tử

O2 và nước trong mỗi giây Ngoài ra nó còn phản ứng với các hợp chất cho H (methanol, ethanol, formic acid, phenol) [16] Catalase được tìm thấy trong peroxisome và các tế bào hồng cầu Trong cơ thể người, mức độ catalase cao nhất ở gan và tế bào hồng cầu, tương đối thấp ở não Catalase đảm nhận nhiều chức năng trong cơ thể như điều chỉnh viêm và đột biến Catalase bảo vệ tế bào beta tuyến tụy và các tế bào thần kinh cũng như là khả năng vận chuyển máu của tế bào hồng cầu [19]

2.3.2 Chất kháng oxy hóa không có bản chất enzyme

Vitamin C (acid ascorbic) là một monosaccharide kháng oxy hóa được

tìm thấy trong cả người và động vật nhưng không thể tổng hợp ở người mà phải được lấy từ chế độ ăn uống Ở tế bào vitamin C được duy trì ở dạng khử bằng cách phản ứng với glutathion Vitamin C là một chất khử nên có thể khử và bất hoạt gốc tự do bằng cách cho đi hai nguyên tử hydro để chuyển thành dehydroascorbic acid do đó trung hòa các gốc tự do chứa oxy (ROS) cũng như hydrogen peroxide (H2O2) Ngoài tác dụng kháng oxy hóa trực tiếp của nó, acid ascorbic còn là một chất nền cho các enzyme kháng oxy hóa ascorbate peroxidase [20]

Vitamin C

Vitamin E tồn tại ở tám dạng trong tự nhiên: bốn dạng tocopherol và

bốn dạng tocotrienol, đó là các vitamin tan trong chất béo có đặc tính kháng oxy hóa Trong số này thì α- tocopherol được nghiên cứu nhiều nhất vì nó có hoạt tính sinh học cao nhất, mặc khác cơ thể hấp thu và chuyển hóa tốt chất này Alpha tocopherol là chất kháng oxy hóa tan trong lipid quan trọng nhất và bảo

vệ màng tế bào chống lại quá trình oxy hóa bằng cách phản ứng với các gốc tự

do peroxide được tạo ra trong chuỗi phản ứng peroxy hóa lipid Loại bỏ các gốc

tự do và ngăn ngừa các phản ứng tiếp tục xảy ra Phản ứng này chuyển

- tocopherol thành các - tocopheryl và được tái tạo bởi các chất kháng oxy hóa khác như acid ascorbic (vitamin C), ubiquinol,…[14]

 - Tocopherol

Carotenoid là hợp chất màu hữu cơ có trong thực vật và một số sinh vật

có khả năng quang hợp Đối với con người, carotenoid là chất kháng oxy hóa quan trọng vì có mặt trong nhiều loại thực phẩm và có khả năng hoạt động trong

môi trường chất béo là nơi dễ xảy ra sự oxy hóa và gây tổn thương tế bào (màng

tế bào) Hoạt động kháng oxy hóa của carotenoid được thể hiện bằng khả năng

vô hoạt oxy đơn và các gốc tự do Chúng có mặt trong gan, lòng đỏ trứng, bơ,

cà chua, cà rốt,…[20]

 - Carotene

Ca ́ c polyphenol thực vâ ̣t là chất kháng oxy hóa quan trọng, chế đô ̣ ăn

uống của các hợp chất này có thể lên đến 50-800 mg/ngày Polyphenol bao gồm flavonoid, phenol, acid phenolic, tannin,… Nguồn flavonoid bao gồm trái cây, rau quả, hạt, rượu vang đỏ, trà, ha ̣t, ngũ cốc, gia vi ̣, và cây thuốc Flavonoid ngăn chặn các gốc tự do như peroxyl, superoxide bằng cách cho đi một nguyên

tử hydro Sắt và đồng là những kim loa ̣i đảm nhâ ̣n những vai trò sinh lý nhất định trong cơ thể như vận chuyển oxy (hemoglobin), cofactor của các enzyme (Fe của catalase, Cu của superoxide dismutase) Tuy nhiên các kim loa ̣i này có khả năng phản ứng Fenton và Haber Weiss để ta ̣o nên các gốc tự do Các flavonoid có khả năng ta ̣o phức với các kim loa ̣i này và ha ̣n chế khả năng ta ̣o phứ c của chúng [18]

Kaempferol

Acid uric góp phần mô ̣t nửa vào khả năng kháng oxy hóa của huyết tương Trong thực tế, acid uric có thể thay thế bằng acid ascorbic trong sự phát triển của cơ thể Tuy nhiên, giống như acid ascorbic, acid uric cũng có thể trung

hòa các gốc oxy hoa ̣t đô ̣ng [19]

Acid Uric

Glutathion là một peptide chứa cystein được tìm thấy trong hầu hết các

dạng sống hiếu khí Glutathion được tổng hợp trong tế bào từ các acid amin cấu

thành nó Glutathion có hoạt tính kháng oxy hóa do nhóm thiol của cysteine Trong tế bào thì glutathion được duy trì ở dạng khử do enzyme glutathion reductase, khử các chất chuyển hóa và các enzyme cũng như là phản ứng trực tiếp với chất oxy hóa Do nồng độ cao của nó và vai trò trung tâm trong việc duy trì trạng thái oxy hóa khử của tế bào, nên glutathion là một chất kháng oxy hóa quan trọng nhất trong tế bào Trong một số sinh vật, glutathion được thay thế bằng các thiol khác như mycothiol trong xạ khuẩn [21]

Glutathion

Melatonin còn gọi là N-acetyl-5-methoxytryptamine, là mô ̣t hormon tự nhiên được tiết ra từ tuyến tùng của não, cũng được biết đến với tác du ̣ng tẩy trắng trên sắc tố da, và đã được sử du ̣ng rô ̣ng rãi như là mô ̣t chất bảo vê ̣ chống

lại một loạt các quá trình và các tác nhân gây ha ̣i cho mô thông qua cơ chế gốc

tự do Melatonin được tìm thấy ở đô ̣ng vâ ̣t và mô ̣t số sinh vâ ̣t sống khác, kể cả

tảo Melatonin là mô ̣t chất kháng oxy hóa ma ̣nh, có thể dễ dàng xuyên qua màng

tế bào và hàng rào máu não Không giống chất kháng oxy hóa khác, melatonin không trải qua quá trình oxy hóa khử bởi vì nó tạo ta nhiều sản phẩm cuối cùng ổn định khi phản ứng với gốc tự do [19]

Melatonin

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thơ ̀ i gian, đi ̣a điểm và phương tiê ̣n

3.1.1 Thơ ̀ i gian

Đề tài luận văn được thực hiện từ tháng 12/2016 đến tháng 5/2017

3.1.2 Đi ̣a điểm

Phòng thí nghiệm Hóa Sinh, phòng Quang Phổ thuộc Bộ môn Hóa Học

- Khoa Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học Cần Thơ

3.1.3 Phương tiê ̣n

3.1.3.1 Nguyên liê ̣u

Lá cây Sen hồng được thu hái trong khuôn viên khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ

3.1.3.2 Ho ́ a chất

Dung môi: cồn 960, methanol, nước cất

Phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH

- Vitamin C (L-Ascorbic acid) (Trung Quốc)

- DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (BDH – Anh)

Phương pháp làm sạch gốc tự do ABTS•

- ABTS

(diamonium-2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (Roche – Đức)

- Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)

- Potassium persulfate - K2S2O8 (Merck – Đức)

Phương pháp khử sắt (reducing power - RP)

- Potassium ferricynate - K3Fe(CN)6 (Merck – Đức)

- Iron (III) chloride - FeCl3 (Sigma-Aldrich)

- Acid trichloroacetic - CCl3COOH (Merck – Đức)

- Butylated hydroxyanisole - BHA

- Sodium dihydrogen phosphate - NaH2PO4 (Trung Quốc)

- Sodium hydrogen phosphate - Na2HPO4 (Trung Quốc)

3.1.3.3 Du ̣ng cu ̣ và thiết bi ̣

Tủ sấy: dùng để sấy nguyên liệu và các dụng cụ thủy tinh

Máy quang phổ JASCO V-730 SPECTROPHOTOMETER

Máy đo pH S80K

Máy khuấy từ không gia nhiệt KMO 2 BASIC - IKA

LABORJECHNIK

Bể siêu âm Elma

Bể điều nhiệt (Memmert)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp Thu và xử lí mẫu

Lá Sen hồng sau khi thu hái được loại bỏ phần bị hư, mẫu lá được rửa sạch, lau lại bằng vải sạch, cắt nhỏ Rồi đem phơi khô dưới bóng râm, nơi thoáng mát, tránh ánh nắng trực tiếp cho đến khi khối lượng không đổi (Hoặc có thể sấy mẫu trong lò sấy ở 50-60°C) Sau đó xay nhuyễn thu được mẫu nguyên liệu

3.2.2 Phương pháp điều chế các loại cao

3.2.2.1 Điều chế cao Methanol tổng bằng phương pháp ngâm dầm

Nguyên liệu ban đầu sau khi phơi khô nghiền thành bột Bột lá Sen được cho vào túi vải nhỏ sau đó được ngâm với lượng Methanol vừa đủ trong bình kín để ở nhiệt độ phòng Mỗi lần ngâm khoảng 24 giờ, dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi cô quay thu hồi dung môi Dung môi thu hồi được trong quá trình

cô quay sẽ được cho trở lại vào bình thủy tinh để tiếp tục chiết, tiếp tục thực hiện quá trình như thế vài lần cho đến khi chiết kiệt các chất từ mẫu bột nguyên liệu Phần dịch chiết được cô quay đuổi dung môi, thu được cao Methanol tổng

Hình 3 1 Ngâm dầm nguyên liệu lá Sen với methanol

Hình 3 2 Cô quay cao methanol

3.2.2.2 Phương pháp trích nóng cao nước

Bột lá sen được cho vào thùng rồi cho thêm nước cất đã được đun sôi, rồi khuấy trộn đều để ủ khoảng 10 phút Sau đó gạn lấy dịch chiết để lắng loại tạp chất lơ lửng Gạn lấy dịch chiết một lần nữa Sau đó tiến hành lọc nóng lấy dịch chiết rồi tiến hành cô quay ở áp suất thấp 110mbar và nhiệt độ 700C Cô quay đuổi hết dung môi của phần dịch trích nóng, thu được cao nước tổng

Hình 3 3 Lọc dịch trích nóng

Hình 3 4 Cô quay cao nước

3.2.3 Các phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa

Tổng quan về giá trị EC50 (Effective concentration of 50%)

Định nghĩa giá trị EC50

Giá trị EC50 dùng để đánh giá khả năng tác dụng hiệu quả của mẫu khảo sát Giá trị EC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu khảo sát mà tại đó mẫu có khả năng tác dụng hiệu quả với hiệu suất 50%, chẳng hạn như trong phản ứng làm sạch gốc tự do thì EC50 là nồng độ của mẫu có khả năng làm sạch 50% gốc

tự do Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị EC50 sẽ càng thấp và ngược lại

Cách xác định

Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu khảo sát ở nhiều nồng độ khác nhau Với thí nghiệm gồm những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, ta dựng được đồ thị biểu thị hiệu suất tác dụng theo nồng độ mẫu, từ

đó một đường thẳng y = ax + b sẽ được vẽ qua tất cả các điểm (với y là phần trăm thể hiện mức độ tác dụng hiệu quả, x là nồng độ mẫu khảo sát) Sau đó, thay giá trị y = 50% vào phương trình y = ax + b sẽ tính được giá trị x, đó chính

Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của các dung dịch cao chiết được đánh giá qua sự giảm độ hấp thu quang phổ của dung dịch DPPH sau khi phản ứng với dung dịch mẫu thử ở bước sóng 517 nm với các nồng độ mẫu thử khác nhau Chất kháng oxy hóa trong mẫu thử sẽ kết hợp với gốc tự do DPPH, lượng gốc tự do còn lại sẽ được phát hiện ở bước sóng 517 nm Từ sự giảm độ hấp thu quang phổ có thể tính được hiệu suất làm sạch gốc tự do và dựng đồ thị biểu thị hiệu suất làm sạch gốc tự do theo nồng độ mẫu thử, từ đó tính được giá trị EC50 dựa vào đồ thị vừa dựng được Hiệu suất kháng gốc tự do của một chất được tính theo công thức sau [22]: