Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu lá trầu không

DANH MỤC HÌNH i DANH MỤC BẢNG DANH MỤC TỪ VIẾT TẮC FIN Interferon gamma PCR Polymerase Chain Reaction DPPH 1-1-diphenyl -2 -picryl hydrazine MeOH Methanol EtOH Ethanol IC50 Nồng độ ức chế 50% DMSO Dimethyl Sunfoxide ii MỤC LỤC CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TÊU ĐỀ TÀI CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI QUÁT VỀ CÂY TRẦU KHÔNG 2.1.1 Phân loại khoa học 2.1.2 Đặc điễm thực vật 2.1.3 Phân bố sinh thái [10] 2.1.4 Thành phần hóa học trầu khơng [10] 2.1.5 Công dụng Trầu Không [10] 2.2 TỔNG QUAN VỀ TINH DẦU 2.2.1 Khái quát tinh dầu: 2.2.2 Hoạt động tinh dầu 2.2.3 Công dụng cách sử dụng tinh dầu 2.2.4 Thời hạn sử dụng bảo quản tinh dầu [12] 2.2.5 Tinh dầu trầu không [8] 2.2.6 Các phương pháp chiết tách tinh dầu [13] 2.2.7 Chiết tách tinh dầu chưng cất lôi cuống nước[13] 2.3 GỐC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 2.3.1 Khái niệm gốc tự 2.3.2 Tác động gốc tự liên quan bệnh tật người 2.3.3 Chất chống oxy hóa 2.3.4 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa [5] CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU iii 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU 3.1.1 Nguyên liệu 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Ly trích tinh dầu phương pháp chưng cất lôi nước 3.2.2 Phương pháp loại nước 3.2.3 Tỷ trọng tinh dầu 3.2.4 Phương pháp xác định thành phần hóa học tinh dầu trầu khơng 3.2.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bắt gốc tự DPPH - Cách tính kết CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA TINH DẦU 4.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4.3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN Q TRÌNH LY TRÍCH TINH DẦU 4.3.1 Ảnh hưởng thời gian ly trích 4.3.2 Ảnh hưởng thể tích nước cất thêm vào 4.4 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LOẠI GỐC TỰ DO CỦA TINH DẦU LÁ TRẦU KHÔNG 4.4.1 Kết đo chất đối chứng vitamin C 4.4.2 Kết đo nồng độ tinh dầu CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.2 ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO iv CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Con người không tránh khỏi lần mắc bệnh Mỗi bệnh dù nhẹ hay nặng làm cho người ta khó chịu phải tìm cách chưa trị Hiện y học phát triển nên có quyền lựa chọn cách chữa trị phù hợp với bệnh tật với hồn cảnh Với điều kiện kinh tế nước ta nay, đa số người ta nghèo tìm cách chữa trị vừa rẻ tiền vừa mang lại hiệu quả, không để lại tác dụng phụ người dân quan tâm lựa chọn Nền y học dân gian dùng cỏ để trị bệnh hình thức chữa bệnh cổ nhân loại, có từ nhiều ngàn năm trước Trên giới, xu hướng nhân loại ngày ưa thuốc từ hoạt chất thiên nhiên có nguồn gốc sinh học việt nam nước nằm vùng nhiệt đới ẩm ước nên hệ thực vật phong phú đa dạng, nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được, nhiều thuốc quý với đầy đủ chủng loại số lượng lớn Vậy câu hỏi đặt ra“ không sử dụng chúng để chữa bệnh?” Hòa nhập với xu đại sản phẩm tinh dầu, hương liệu dược liệu có nguồn gốc thiên nhiên ngày trọng người đầu tư khai thác Thị trường nhập loại sản phẩm ngày mở rộng phát triển Mỹ, Anh, Pháp, Đức, Nhật Bản, Trung Quốc, Braxin, Đài Loan… Việt Nam đất nước có nhiều điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên củng đẩy mạnh việc trồng sản xuất để đáp ứng nhu cầu chung giới Cây trầu có tên trầu khơng có tên khoa học piper betle, thuộc lồi P.betle Theo đơng y trầu có vị cay nồng , tính ấm có tác dụng chữa ho, trị bệnh đường tiêu hóa Lá trầu có chất tinh dầu giúp ngăn ngừa phát sinh ung thư gan, thực quản, đại tràng, da Các nhà khoa học Ấn Độ cho biết trầu có carotenoid, chất sơ có lợi cho tiêu hóa, chống lão hóa hạ cholesterol làm vững thành mạch, chữa bệnh tăng huyết áp… Tinh dầu từ trầu khơng có nhiều cơng dụng tiềm kinh tế nên có nhiều cơng trình ngun cứu, đa số cơng trình nước ngồi Để khảo sát khả chống oxy hóa tinh dầu trầu không giúp cho việc khai thác thuận lợi nâng cao giá trị sử dụng trầu không Được hướng dẫn ThS Nguyễn Ngọc Yến đồng ý ban chủ nhiệm khoa Dược – Điều Dưỡng, em thực đề tài “ Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu trầu khơng” trung tâm thí nghiệm thực hành trường Đại Học Tây Đô 1.2 MỤC TÊU ĐỀ TÀI Xác lập điều kiện tối ưu cho việc chiết tách tinh dầu từ trầu không phương pháp chưng cất lơi nước Đưa quy trình chưng cất tối ưu để thu nhận tinh dầu từ trầu không Khảo sát khả khử gốc tự phương pháp DPPH từ dịch chiết trầu không CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI QUÁT VỀ CÂY TRẦU KHÔNG 2.1.1 Phân loại khoa học Bộ: Piperales Họ: Hồ tiêu Piperaceae Chi: Piper Loài: Piper betle Tên khoa học: Piper Betle Linn Tên gọi khác : Trầu không, Trâu Cau, Trầu Ăn Lá, Trầu Mở, Trầu Quế Tên nước ngoài: Betle Vine ( Anh), Pan ( Ấn Độ), Phlu (ThaiLan), Sirih (Indonesia) 2.1.2 Đặc điễm thực vật Ở Việt Nam có hai loại Trầu, Trầu Mỡ Trấu Quế, - Trầu mỡ có to hơn, dễ trồng phát triển nhanh, Còn trầu quế nhỏ phân nữa, phát triển hơn, có vị cay, nhiều người sử dụng nhiều Hình 1: Lá trầu quế Hình 2: Lá trầu mỡ Cây Trầu có cuống , có bẹ , dài 1,5-3mm , phiến hình trái tim , dài 1013cm , rộng 4,5 – 9cm , có mũi nhọn chóp , có dạng màng cứng Lá thường xanh, nhiều gân rõ, Lá non thường xanh nhạt bóng, già đậm hơn, có vị thơm nhẹ, vị cay Hình 3: Cây trầu khơng Thân bò,thường bám que cắm xuống đất, thường thấy chúng bò bám lên cau ăn trái, hai lúc trồng chung với nhau, để làm điểm tựa cho nhau, quấn quýnh với tình cảm vợ chồng Ở đoạn thân có rễ mạnh bám chắc, nhờ rễ mà trầu bám dính chổ Hoa có sóc màu trắng , khác gốc , mọc thành bơng tròn dài khoảng 2cm nhìn giống hoa lốt Hoa có cuốn, thường mọc nách Khi già hoa chuyển sang màu vàng nhạt nâu sẫm Hình 4: Hoa trầu khơng Quả nhỏ hình tròn thường mọc thành chùm , bao quanh hết thân , có lông mềm đỉnh 2.1.3 Phân bố sinh thái [10] Trầu khơng có nguồn gốc vùng Đơng Nam Á trồng nhiều Ấn Độ, Indonesia, Sri Lanka, Việt Nam, Malaysia Lá trầu loại tốt thuộc giống ‘Magahi’ ( từ vùng Magadha ) sinh trưởng gần Patna Bihar, Ấn Độ Riêng Việt Nam, trầu không vào truyền thuyết dân tộc, khơng thể thiếu văn hóa dân gian Việt Nam Từ thời vua Hùng, cách nhiều ngàn năm có truyện cổ tích ‘Trầu Cau’, văn hóa Việt Nam có tục lệ ăn trầu dùng trầu cau để làm lễ vật xin cưới hỏi, nên trầu trồng khắp địa phương Việt Nam Trầu thuộc loại ưa ẩm ẩm , thích ánh sáng ( mọc bóng râm) dễ trồng sinh trưởng mạnh mùa mưa ẩm Với nhiệt độ trung bình từ 22oC đến 26oC, lượng mưa từ 2000 – 3000 mm/năm Trầu phát triển tốt Cây Trầu thích hợp với loại đất giàu hữu cơ, có thành phần sét cao với độ pH từ đến Vì Trầu Khơng phải loại trồng lâu đời nên quần thể giống Trầu sưu tập để trồng nhiều loại giống khác nhau, tùy theo thổ nhưỡng sở thích người tiêu dùng mà người ta chọn giống để trồng Hiện Ấn Độ nước thu thập nhiều giống Trầu nhất, Thái Lan Trầu trồng dây ( cắt đoạn than Trầu từ 40 đến 50 cm, đoạn thân phải có rễ mọc từ đốt nối) Đoạn thân cắt phần đốt có rễ vùi sâu xuống 20 đến 30cm nơi đất màu mỡ có độ ẩm Nên đặt dây Trầu đất cạnh dang sống hay cạnh tường, làm giàn để Trầu leo bám phát triển Cây Trầu trồng từ đến năm hoa, Muốn cho Trầu ln tốt phải đủ độ ẩm phải bón thêm phân, vôi bột bồi thêm lớp mỏng dất bùn vào gốc Nếu trồng vùng đất tốt có đủ ánh sáng độ ẩm vòng tháng người ta thu hoạch sản phẩm từ dây trầu Bộ phận dùng rễ Lá hái quanh năm, rễ thu hoạch người ta dỡ Trầu lên trồng lại Riêng vùng đất Hóc Mơn để tăng suất thu hoạch cao, người ta lên liếp Trầu trồng dọc theo liếp Trên liếp cắm mộc để Trầu leo bám, hai bên liếp có đào mương để tránh úng ngập trời mưa mương ln có nước chảy vào theo triều cường lên xuống để tạo nên độ ẩm 2.1.4 Thành phần hóa học trầu khơng [10] Bảng 1: Thành phần hóa học trầu khơng Thành Phần Hàm lượng Độ ẩm 82,3- 85,4% Đường tổng 2,4% Đường khử 5,6% Tro tổng 1,4% Béo tổng 3,2% Protein 2,3% Tinh bột 0,8% Chất xơ 3,1% Tanin 1-1,3% Vitamin C 50mg/kg Tinh dầu 0,8 – 1,8% Nước có hàm lượng từ 80- 85% trầu khơng Tanin gọi chung hợp chất polyphenol có mặt Trầu Không từ 1-1,3% Hợp chất phenol chavicol, chavibetol, -tocopherol, –allypyrocatechol Các nguyên tố vô Trầu gồm Ca, Fe, P,Iod, K, Na Các vitamin có Trầu gồm có Caroten ( tiền vitamin A), vitamin C, nhiều vitamin nhóm B Thiamine, Riboflavin Nicotinic acid Theo tài liệu nghiên cứu thành phần tinh dầu Trầu Không chứa từ 15 đến 40 hợp chất Tùy loại vùng địa lý trồng khác mà thành phần tinh dầu Trầu bao gồm nhóm hợp chất sau: Monoterpene ( terpinene, pinene, limonene, thujene, camphene), Sesquiterpenen ( candinene, elemene, caryophyllene, cubebene), alcohol ( linalol, terpineol, cadinol), aldehyde ( decanal), acid ( hexadecanoid acid), oxide ( cineole), phenol ( eugenol, chavibetol, chavicol) phenolic ether ( methyl eugenol) ester ( acetate, chavibetol acetate, chavicol acetate) 2.1.5 Công dụng Trầu Không [10] 2.1.5.1 Theo y học cổ truyền Theo triết học đông phương y học cổ truyền, Trầu Khơng có vị cay, nồng, tính ấm, có mùi thơm hắc Bộ phận sử dụng rễ da số sử dụng nhiều hơn, dùng lẫn thể ( uống ngồi thoa ) Lá Trầu Khơng đùng để trị hàng thấp, nhức mỏi đau dày, ăn uống không tiêu, bụng đầy hơi, nhiễm trùng có mủ, sưng đau hen xuyển thời tiếc thay đổi, nhức đầu, khó thở, nấu thành cao chữa viêm chân Nhiều nơi sử dụng Trầu đâm nhỏ rùi cho nước vôi vào để rửa vết loét , mẫn ngứa, viêm hoạch bạch tuyết Nước pha Trầu Khơng dùng làm thuốc nhỏ mắt, chữa viêm kết mạc, chữa chàm mặt trẻ em Dã nát Trầu cho thêm rượu để chữa phỏng, đánh gió, chữa cảm mạo, trị phong thấp nhức mỏi Nước ép nhỏ vào tai trị bệnh đau tai Đặt biệt thói quen ăn Trầu kết hợp với vơi, cau để tránh hôi miệng để làm cho răng, giúp nhuận tràng dễ tiêu Ăn trầu làm thể ấm lên, súc miệng nước ép trầu phòng bệnh viêm họng 2.1.5.2 Theo y học đại Theo Singh M cộng sự, xuất n-hexane chlorofom Trầu tươi đáp ứng chất kích thích miễn dịch Thí nghiệm dòng chuột BALB liều lượng 100mg/kg trọng lượng thể chuột chiết xuất làm tăng sinh tế bào T B hệ miển dịch làm tăng cường sản xuất kháng thể lgG chống lại kháng nguyên giun Brugia malayi ký sinh hoạch bạch huyết người Bhattacharya S., Pal B., Bandyopadhyay S.K., Ray M., Roy K.C, sử dụng chiết xuất Trầu Không tác nhân điều biến miễn dịch gây sản xuất từ tế bào T máu ngoại vi người Sáng chế bao gồm việc sử dụng xuất trầu tươi, ủ với IFN ( Interferon gamma) từ tế bào máu đơn nhân ngoại vi người, sau thực tăng sinh IFN nhờ với cặp mồi biết kỹ thuật PCR Về khả tiêu diệt tế bào ung thư trầu Theo Fathilah A.R., Sujata R., Norhanom A.W., Adenan M.I, dịch nước trầu không ngăn cảng tăng sinh dòng tế bào ung thư vòm họng Sử dụng xét nghiệm gây độc tế bào trung tính máu đỏ, cho thấy dịch chiết hữu hiệu điều trị tổn thương ung thư biểu bì miệng 2.1.5.3 Một số thuốc khác từ trầu không Chữa đau mắc đỏ ( viêm kết mạc) chép lẹo: Lấy trầu không, 5-10 dâu vò nát, cho vào ca đổ ngập nước sơi để sông mắt đau Xông lần – 10 phút, ngày lần Thuốc chống viêm loét, mắt dịu Rữa vết thương, vết bỏng bị nhiễm khuẩn: Lá Trầu Khơng phèn đen thứ 20g, vò dã nát đổ 1,5 lít nước, sắc lấy lít , rữa chổ ngày lần Suy nhược thần kinh : Khi đau dây thần kinh, hay mệt mỏi, suy nhược thần kinh, lấy nước cốt vắt từ Trầu Khơng với thìa mật ong thìa hỗn hợp chia làm lần ngày Chữa táo bón: Đối với trường hợp táo bón trẻ, viên đạn đút hậu môn làm từ Trầu Không ngâm dung dịch thầu dầu kích thích trực tràng co bóp hết táo bón Giãm đau lưng: Dùng trầu hơ nóng nước cốt trầu trộn với dầu dừa đắp vào thắt lưng giúp giảm đau nhanh chóng Các bệnh phổi: Khi mắc bệnh phổi lấy trầu không tẩm dầu mù tạt hơ ấm, đặt lên ngực đẩy nhẹ giảm ho giúp bệnh nhân dễ thở 2.2 TỔNG QUAN VỀ TINH DẦU 2.2.1 Khái quát tinh dầu: Tinh dầu hỗn hợp nhiều chất dễ bay hơi, có mùi đặt trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cấp tinh dầu Phần lớn tinh dầu có nguồn gốc từ thực vật số động vật Trong thiên nhiên tinh dầu trạng thái tự do, có số trạng thái tiềm tàng, nghĩa tinh dầu khơng có sẳn nguyên liệu mà xuất điều kiện gia công định trước tiếng hành ly trích hay tác dụng Độ hấp thụ DPPH dung dịch đệm MeOH cao nhất, tiếp đólà MeOH, dung dịch đệm EtOH Vì pha DPPH dungdịch đệm MeOH nhạy EtOH đo quang phổ hấp thụ Giá trị độhấp thụ DPPH đo khoảng từ 0.221 – 0.698 (Ayres, 1949) Điều nàytương ứng với nồng độ từ 25 – 70 µM Nếu lấy nồng độ nằm khoảng nàysẽ hợp với yêu cầu độ xác đo quang phổ hấp thụ [7] Phản ứng minh họa: Hình 13: Phản ứng trung hòa gốc tự DPPH Khả kháng oxy hóa chất biểu giá trị IC 50, nồng độ chất oxy hóa để ức chế 50% gốc tự DPPH Giá trị IC nhỏ hoạt tính kháng oxy hóa mạnh ngược lại CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU 3.1.1 Nguyên liệu Lá trầu (Piper betel L.), thu hái vào tháng năm 2018 quận Cái Răng, h danh cách tham chiếu với tài liệu tham khảo Nguyên liệu tươi xử lý sơ bộ, loại tạp chất, rữa xay nhuyễn trước tiến hành trích ly 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất Dụng cụ, thiết bị 19 Bảng 1: Dụng cụ thiết bị Tên dụng cụ Bộ dụng cụ chưng cất tinh dầuClevenger Số lượng Máy đo quang UV- VIS Cân phân tích Bình lắng gạn 50ml Cốc 50ml Cốc 100ml Cốc 500ml Hóa Phễu, giấy lọc chất: Ống nghiệm Đủa thủy tinh Pipet xác 5ml Pipet chinh xác 1ml ống đong 50ml Bình định mức 50ml Nước cất, cồn 96o( vệ sinh dụng cụ), Diethyl ether, Na2SO4 Khan, Methanol, DPPH, vitamin C 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Ly trích tinh dầu phương pháp chưng cất lơi nước Tinh dầu Trầu không ly trích phương pháp chưng cất lơi nước trực tiếp, với chưng cất tinh dầu Clevenger, đồng thời khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất, thể tích sử dụng q trình chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu 20 Hình 14: Bộ dụng cụ clevenger Quy trình: Thu hái xử lý Trầu Cân 300g Trầu Xoay nhuyễn với 500ml nước cất Cho vào bình cầu thêm 500ml nước cất Lắp đặt vào hệ thống Clevenger Điều chỉnh nhiệt độ mức số sau giảm dần cho phù hợp Chưng cất 3- Rút lấy tinh dầu + nước 21 3.2.2 Phương pháp loại nước Sau thu tinh dầu có lẫn nước, có tỷ trọng nhẹ nước nên tinh dầu nằm lớp trên, lớp nước Tiến hành loại nước sau: Cho tinh dầu vừa thu + lượng vừa phải Diethyl ether vào bình lắng gạn Lắc đến lần Hỗn hợp tinh dầu + Diethyl ether tách lớp lấy lớp vào cốc Cho Na2SO4 khan vào dd vừa thu lọc Dịch lọc (tinh dầu có lẫn Diethyl ether) Làm bay Diethyl ether Cho cốc chứa dịch lọc vào nước ấm (30-40oC) Tinh dầu 3.2.3 Tỷ trọng tinh dầu Tỉ trọng cảu tinh dầu giao động từ 0,7- 1,2 Hầu hết tinh dầu có tỉ trọng nhỏ nước, trừ vài tinh dầu hương nhu, long não, quế… 22 Tỉ trọng tinh dầu thường phụ thuộc vào thành phần hóa học tinh dầu Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất hidrocarbon thường có tỉ trọng nhỏ 0,9 Những tinh dầu có chưa nhiều hợp chất oxigen, hợp chất hương phương thường có tỉ trọng lớn Tỉ trọng, tỉ trọng tương đối tinh dầu 20°C, , tỉ số khối lượng tinh dầu 20°C khối lượng thể tích nước cất 20°C Ở 20°C nước có tỉ trọng 0,99823g/ml Tỷ trọng tinh dầu tính theo cơng thức sau : m - mo = m1 – mo Trong : m0 khối lượng tỷ trọng kế rổng m1là khối lượng tỷ trọng kế nước m2 khối lượng tỷ trọng kế tinh dầu 3.2.4 Phương pháp xác định thành phần hóa học tinh dầu trầu khơng Thành phần hàm lượng cấu tử có tinh dầu phân tích phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS), thực thiết bị Máy GC Agilent 6890N, MS 5973 inert, loại cột sử dụng Cột HP5-MS, áp suất He đầu cột 9.3 psi, Mẫu tinh dầu (25 µL) pha 1.0 mL n-hexan (Meck) Tiêm mẫu : 1.0 µL Chương trình nhiệt độ cho máy sắc ký khí thiết lập sau: 50oC giữ phút tăng 2oC/phút đến 80oC, tiếp tục tăng 3oC/phút đến 150oC, tiếp tục tăng tiếp tục tăng oC/phút 200oC cuối tăng 20oC/phút đến 300 oC giữ phút 23 Hình 1: Phổ GC tinh dầu trầu không 3.2.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bắt gốc tự DPPH Hoạt tính chống oxy hóa xác định thử nghiệm DPPH (Viện Dược liệu, 2006; Chanda S et al, 2009; Wojdylo A et al, 2007) DPPH gốc tự dùng để thực phản ứng mang tính chất sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể qua việc làm giảm màu DPPH, xác định cách đo quang bước sóng 517 nm 3.2.5.1 Chuẩn bị thuốc thử mẫu thử Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0,6 mM methanol cách hòa tan 5,915 mg DPPH với lượng methanol vừa đủ tan DPPH, sau cho vào bình định mức thêm methanol vừa đủ 25 ml Pha xong dùng ngay, đựng chai thủy tinh màu Mẫu thử: Khảo sát hoạt tính quét gốc tự DPPH mẫu cao toàn phần từ mẫu nguyên liệu dược liệu Các cao hòa tan với methanol để đạt nồng độ ban đầu mg/ml dược liệu khơ Nếu khó tan dùng DMSO trợ tan Đối chứng dương sử dụng vitamin C trolox 24 Các mẫu thử chứng dương tiến hành khảo sát nồng độ khác 3.2.5.2 Tiến hành quy trình thử nghiệm Bảng Phản ứng thử nghiệm DPPH Ống Dung dịch thử Dung dịch MeOH Dung dịch DPPH (ml) (ml) (ml) Trắng Chứng 3,5 0,5 Thử 0,5 0,5 Hỗn hợp sau pha để tối, nhiệt độ phòng 30 phút Đo quang bước sóng 517 nm - Cách tính kết Hoạt tính chống oxy hóa HTCO (%) tính theo công thức: HTCO (%) = (ODc − ODt ) × 100 ODc Trong đó: ODc: Mật độ quang dung dịch DPPH MeOH ODt: Mật độ quang DPPH mẫu thử Từ HTCO (%) nồng độ mẫu với phần mềm Excel ta phương trình logarit nồng độ mẫu thử HTCO (%) có dạng y = aln(x) + b, y = 50 để suy IC50 (khả đánh bắt 50% DPPH mẫu) Giá trị IC50 thấp tương ứng với HTCO cao ngược lại Các số liệu kết thử nghiệm biểu thị trung bình lần đo khác CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA TINH DẦU Các tính chất vật lý tinh dầu trầu không ly trích phương pháp lơi nước Bảng 1: Một số tính chất vật lý tinh dầu trầu khơng Tính chất Màu, Độ tan mùi vị Tỷ trọng 25 Chỉ số acid Dung dịch dầu Không tan nước, tan 0,94 màu vàng nhạt, dung môi hữu cơ: methanol, mùi đặc trưng, vị chloroform, diethyl ether gắt 1.12 Hình Hình4.3.1:2:Tinh Tinhdầu dầulálátrầu trầukhơng khơngthu thuđược đượcbằng bằngphương phương pháp nước pháp lôilôi nước 4.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC Bảng 2: Thành Phần Hóa Học tinh dầu trầu không Hàm lượng Mass Độ tương hợp khối phổ TT Rt Tên chất 7.37 1.93 136 - 7.96 1R-.alpha.-Pinene Camphene 0.60 136 - 9.12 Sabinene 2.89 136 - 11.28 1.29 136 90 11.91 3.02 136 87 12.03 1.46 154 95 13.67 2.19 136 93 20.79 alpha.-Terpinene Sylvestrene Eucalyptol gamma.-Terpinene (-)-4-Terpineol 5.34 154 93 26 31.07 10 31.47 11 31.90 12 33.05 13 34.58 14 35.54 15 35.69 16 35.84 17 36.51 18 36.73 19 37.28 20 37.73 21 38.13 22 38.27 23 41.89 24 42.42 25 42.56 26 42.87 Copaene Eugenol beta.-Elemene Caryophyllene Humulene beta.-Cadinene gamma.-Muurolene Germacrene D Elixene alpha.-Muurolene gamma.-Cadinene delta.-Cadinene Eugenol acetate Không xác định Cubenol tau.-Cadinol tau.-Muurolol alpha.-Cadinol 0.66 204 89 0.51 164 74 3.37 204 89 2.42 204 91 1.47 204 91 0.57 204 82 5.57 204 94 5.01 204 91 2.23 204 86 2.07 204 94 2.15 204 92 13.66 204 91 1.93 206 87 1.19 - - 1.26 222 85 12.62 222 92 2.11 222 93 22.45 222 95 Nghiên cứu trình chiết xuất tinh dầu từ Trầu không phương pháp lôi nước quy mơ phòng thí nghiệm đề xuất điều kiện tối ưu thời gian (240 phút) thể tích nước cất thêm vào bình cầu (1000 mL) với hàm lượng tinh dầu đạt cao 1.26% Áp dụng phương pháp phân tích đại GC-MS cho thấy tinh dầu ly trích từ Trầu khơng có chứa hợp chất hóa học 1R-.alpha.Pinene , Camphene , Sabinene , alpha.-Terpinene , Sylvestrene , Eucalyptb ol , gamma.-Terpinene , (-)-4-Terpineol , Copaene , Eugenol , beta.-Elemene , Caryophyllene , Humulene m, beta.-Cadinene , gamma.-Muurolene , Germacrene D , Elixene , alpha.-Muurolene , gamma.-Cadinene , delta.-Cadinene , Eugenol acetate Với alpha.-Cadinol có hàm lượng cao 22.45% Có thể thấy cấu tử chiếm hàm lượng cao tinh dầu dẫn xuất phenol nên tinh dầu có nhiệt độ sôi, tỷ trọng chiết xuất cao Các dẫn xuất phenol có mặt tinh dầu có tác dụng sinh học tốt tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, độc tính tế bào… 4.3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LY TRÍCH TINH DẦU Tiến hành khảo sát yếu tố làm ảnh hưởng đến hàm lượng thành phần tinh dầu: thời gian ly trích thể tích dung mơi dùng ly trích Sau có điều kiện 27 ly trích tối ưu, nghiên cứu tiến hành ly trích mẫu điều kiện tối ưu để làm mẫu so sánh thành phần hóa học với mẫu tối ưu Nguyên tắc: cố định hai yếu tố thay đổi yếu tố để chọn điều kiện tối ưu cho yếu tố Sau thực hiên tương tự cho yếu tố lại Cuối tính phần trăm theo khối lượng tinh dầu thu phân tích thành hóa học GC MS 4.3.1 Ảnh hưởng thời gian ly trích Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian ly trích đến hàm lượng tinh dầu thu 300g trầu tươi, cố định yếu tố nhiệt độ Kết trình bày bảng 4.3 Bảng 3: Kết khảo sát thời gian trích ly tinh dầu Trầu khơng Thời gian ly trích (phút) 60 120 180 240 300 Hàm lượng tinh dầu (% v/w) 0,34 0,42 0,74 1,26 1,28 (Cố định yếu tố: khối lượng nguyên liệu 300g, nhiệt độ chưng cất 100 0c thể tích dung dịch 1000ml) Kết cho thấy hàm lượng tinh dầu thu phụ thuộc vào thời gian chưng cất, hàm lượng tinh dầu tăng thời gian chưng cất tăng với thời gian chưng cất 240 phút, hàm lượng gần đạt cao 4.3.2 Ảnh hưởng thể tích nước cất thêm vào Khảo sát ảnh hưởng thể tích nước cất thêm vào đến hàm lượng tinh dầu ly trích từ 300 g trầu tươi cách tiến hành chưng cất tinh dầu với thể tích nước khác Mục đích nhằm xác định thể tích nước tối ưu cho trình chưng cất, tránh sử dụng lượng nước q dư, khơng có lợi cho việc ly trích tinh dầu tinh dầu chứa nhiều hợp chất dễ tan nước Kết thể Bảng 4.4 Bảng 4: Kết khảo sát ảnh hưởng thể tích nước cất thêm vào đến hàm lượng tinh dầu trích ly Thể tích nước cất (mL) 400 600 800 1000 Hàm lượng tinh dầu (% v/w) 0,2 0,38 0,76 1,26 (Cố định yếu tố: khối lượng nguyên liệu 300g, nhiệt độ chưng cất 100 0c thể tích dung dịch 1000ml) Kết cho thấy hàm lượng tinh dầu tăng thể tích nước cất cho vào bình cầu tăng, hàm lượng đạt cao lượng nước thêm vào 1000 mL 28 Phân tích tổng hợp kết trên, điều kiện tối ưu để ly trích tinh dầu Trầu không phương pháp chưng cất lôi nước quy mơ phòng thí nghiệm đề xuất Bảng 4.5 Bảng 5: Kết điều kiện tối ưu cho q trình ly trích tinh dầu Trầu khơng Khối lượng Thời gian Thể tích Nhiệt độ Hàm lượng (oC) nguyên liệu (g) ly trích (phút) nước(mL) 300g 240 1000 100 cao (%) 1,26 4.4 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LOẠI GỐC TỰ DO CỦA TINH DẦU LÁ TRẦU KHÔNG 4.4.1 Kết đo chất đối chứng vitamin C Bảng 6: Kết đo độ hấp thu % ức chế chất đối chứng vitamin C nồng độ Abs trung bình Ống chứng 0.7303 HTCO(%) Nồng độ 50 µg/ml 0.0705 90.347 % Nồng độ 40 µg/ml 0.1055 85.555 % Nồng độ 30 µg/ml 0.247 66.18 % Nồng độ 20 µg/ml 0.3595 50.776 % Nồng độ 10 µg/ml 0.522 28.526 % Hình 2: Biểu đồ đường chuẩn vitamin C 29 4.4.2 Kết đo nồng độ tinh dầu Bảng 7: Kết đo độ hấp thu % ức chế tinh dầu nồng độ Abs trung bình HTCO (%) Ống chứng 0.7303 Nồng độ 100 µl/ml 0.154 78.91% Nồng độ 80 µl/ml 0.194 73.43% Nồng độ 60 µl/ml 0.267 63.43% Nồng độ 40 µl/ml 0.386 47.14% Nồng độ 20 µl/ml 0.566 22.5 % Hình 3: Biểu đồ đường chuẩn nồng độ tinh dầu Nhận xét: Qua thông số bảng, vẽ vào phần mềm excel ta có phương trình tuyến tính hoạt tính dạng y = ax + b Thay y = 50 ta kết IC50 bảng sau: Bảng 8: Kết xác định giá trị IC50 mẫu Mẫu Phương trình hồi quy IC 50 (µg/ml) Vitamin C y = 1.5842x + 16.751 20.98 Nồng độ tinh dầu y = 0.6955x + 15.349 49.82 30 Hình 4: Biểu đồ so sánh giá trị IC50 mẫu CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề tài “ Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu trầu không ’’, đạt số kết sau: Trong trình chiết xuất tinh dầu từ Trầu không phương pháp lôi nước quy mơ phòng thí nghiệm đề xuất điều kiện tối ưu thời gian (240 phút, thể tích nước cất thêm vào bình cầu 1000ml với hiệu suất cao 1.26% Áp dụng phương pháp phân tích đại GC-MS cho thấy tinh dầu ly trích từ Trầu không trồng tỉnh Cần Thơ thuộc Đồng sơng Cửu Long có chứa hợp chất hóa học như: Delta.-Cadinene (13.66%) , tau.-Cadinol(12.62%) , alpha.Cadinol(22.45%) , Germacrene D(5.01%) , gamma.-Muurolene(5.57%) , (-)-4Terpineol(5.34%) … 5.2 ĐỀ NGHỊ Do hạn chế thời gian nghiên cứu trang thiết bị…nên đề tài chưa sâu chưa phát huy nghĩa nghiên cứu Trên kinh nghiệm đó, em có số kiến nghị sau: Tiến hành nghiên cứu mẫu trầu không tươi đồng thời khảo sát nhiều lồi Trầu khơng nhiều vùng miền khác Tiếp tục nghiên cứu ly trích tinh dầu trầu khơng phương pháp chưng cất nước có hỗ trợ vi sóng phương pháp CO2 lỏng 31 Xây dựng quy trình chiết tách tối ưu cho hợp chất chống oxy hóa tinh dầu trầu không Khảo sát thêm vài tiêu dánh giá khả kháng oxy hóa khác khảo sát khả hình thành phức chất với kim loại, khảo sát hoạt tính chống oxy hóa phương pháp Ferric thiocyanate ( FTC ) để đánh giá chi tiết hoạt tính chống oxy hóa hợp chất tinh dầu trầu không Tiến hành thử nghiệm in vivo, đánh giá mức độ an tồn củng hiệu chống oxy hóa tinh dầu trầu không 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO [5] Ganga Rao.B*, Rajswararao.P,Prayaga Murty.P, Sambasiva Rao.E,Madukiran.P, Mallikarjuna Rao.T, V.S.Praneeth.D, India, 2011.Investigationon Regional Variation in Total Phenolic Content, Alkaloid Content and In-vitro Antioxidant Activity of Clemeo Chelidonii L.f., Vol [3] Kumar, Shiv India, 2011.Free Radicals and Antioxidants: Humanand Food System [4] Mauro Reis, Benedito Lobato, Jeronimo Lameira, Alberdan S.Santos, Cla´udio N Alves* Brazil , 2006.A theoretical study of phenoliccompounds with antioxidant properties [7] Om P Sharma *, Tej K Bhat India, 2008.DPPH antioxidant assayrevisited [1] Rizvi, Kanti Bhooshan Pandey and Syed Ibrahim, 2009.Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease [2] Shekelle P, Morton S, Hardy M California, July 2003.Effect ofSupplemental Antioxidants Vitamin C, Vitamin E, and Coenzyme Q10 for thePrevention and Treatment of Cardiovascular Disease [6] W Brand-Williams, M E Cuvelier and C Berset* France,1994.Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity Website [8] https://tinhdauthaoduoc.net/hoat-chat-phenols-va-tac-dung-cua-tinh-dau-traukhong-bid130.html [ 9]http://chohoaonline.com/p/cay-trau-khong [12]https://www.facebook.com/TinhDauLX/posts/496911700516205 http://www.ioop.org.vn/vn/nctk/thanh-tuu-cua-vien/ban-tin-khoa-hoc-cong-nghe/cacphuong-phap-san-xuat-tinh-dau/ [13] http://www.ioop.org.vn/vn/nctk/thanh-tuu-cua-vien/ban-tin-khoa-hoc-congnghe/cac-phuong-phap-san-xuat-tinh-dau/ Khóa luận, luận văn [10] Lê Thị Vân ( 2013 ) Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết trầu khơng ứng dụng hạn chế oxy hóa chất béo thịt cá dầu bảo quản lạnh Luận văn đại học ngành công nghệ thực phẩm Trường đại hoc Nha Trang [11]Lê Thị Ngọc Thảo ( 2014 ) Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa hợp chất có thân màn hoa tím Luận văn tốt nghiệp đại học, chuyên ngành hóa dược Trường đại học Cần Thơ 33 ... “ Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu trầu khơng” trung tâm thí nghiệm thực hành trường Đại Học Tây Đơ 1.2 MỤC TÊU ĐỀ TÀI Xác lập điều kiện tối ưu cho việc chiết tách tinh dầu từ trầu không. .. tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, độc tính tế bào… 2.2.5.2 Cơng dụng tinh dầu trầu không Trị bệnh rang miệng Điều trị đau đầu, viêm khớp tinh dầu trầu khơng có tác dụng sát khuẩn... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA TINH DẦU Các tính chất vật lý tinh dầu trầu khơng ly trích phương pháp lơi nước Bảng 1: Một số tính chất vật lý tinh dầu trầu khơng Tính chất Màu, Độ tan