Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn bacillus subtilis và salmonella typhymurium của tinh dầu lá tràm gió (melaleuca cajuputi powell)

Tinh dầu lá tràm gió được ly trích thành công bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đạt hiệusuất trung bình là 0,18%.. Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS, t

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các loài thực vật chứa nhiều tinh dầu phổ biến 7

Bảng 3.1 Khảo sát hiệu suất chiết tinh dầu dựa vào thời điểm thu hái trong ngày 37

Bảng 3.2 Khảo sát hiệu suất chiết tinh dầu dựa vào kích thước nguyên liệu 37

Bảng 3.3 Pha loãng tinh dầu tràm gió theo 38

Bảng 4.1 Thành phần hóa học chính của tinh dầu lá tràm gió thu hái tại Cần Thơ được phân tích bằng phương pháp GC-MS 41

Bảng 4.2 Điều kiện tối ưu để chiết tinh dầu tràm gió 43

Bảng 4.3 Thể tích tinh dầu thu được sau 6 giờ và được lập lại 3 lần 44

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát sơ bộ khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tràm gió trên 2 chủng vi khuẩn Ba và Sal 45

1

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Người Ai Cập đã sử dụng tinh dầu cách đây hàng ngàn năm 3

Hình 2.2 Cây tràm gió trong tự nhiên 10

Hình 2.3 Hình thái sinh học của cây Tràm gió 10

Hình 2.4 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi 13

Hình 2.5 Vi khuẩn Salmonella typhymủium soi trên kính hiển vi 17

Hình 2.6 Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtillis 17

Hình 2.7 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước bằng bộ clevenger 19

Hình 3.1 Máy vortex 32

Hình 3.2 Lò vi sóng 32

Hình 3.3 Tủ ủ vi sinh 32

Hình 3.4 Buồng cấy vô trùng 33

Hình 3.5 Tủ hút 33

Hình 3.6 Nồi khử nhiệt ướt 33

Hình 3.7 Tủ sấy chân không 33

Hình 3.8 Cối xay nguyên liệu 33

Hình 3.9 Máy cô quay 33

Hình 3.10 Bộ chưng cất Clevenger 34

Hình 3.11 Sơ đồ chiết và thu tinh dầu tràm gió tinh khiết 36

Hình 3.12 Sơ đồ thử kháng khuẩn của tinh dầu lá tràm gió 40

Hình 4.1 Tinh dầu được chiết từ lá cây tràm 41

Hình 4.2 Các hoạt chất chính trong tinh dầu lá tràm gió thu hái tại Cần Thơ 41

Hình 4.3 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến thể tích tinh dầu 42

Hình 4.4 Kết quả thử kháng khuẩn trên 2 vi khuẩn Sal và Ba sau 24 giờ ủ 43

Hình 4.5 Vòng vô khuẩn ở các nồng độ pha loãng thử trên vi khuẩn Ba 45

Hình 4.6 Vòng vô khuẩn ở các nồng độ pha loãng thử trên vi khuẩn Sal 45

Hình 4.7 Khả năng kháng khuẩn của 2 tinh dầu tràm gió và gừng trên vi khuẩn Sal 46

Hình 4.8 Khả năng kháng khuẩn của 2 tinh dầu tràm gió và gừng trên vi khuẩn Ba 46

Hình 4.9 Khả năng kháng khuẩn của 2 tinh dầu tràm gió và húng quế trên vi khuẩn Sal 47

Hình 4.10 Khả năng kháng khuẩn của 2 tinh dầu tràm gió và gừng trên vi khuẩn Ba 47

Hình 4.11 Đường kính vòng vô khuẩn của tinh dầu tràm gió so với tinh dầu gừng và tinh dầu quế trên 2 chủng vi khuẩn Sal và Ba 47

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ROGOSA, SHARPE)

3

MỤC LỤC

TÓM TẮT

Tỷ lệ đề kháng kháng sinh cao của các chủng vi khuẩn đang trở thành mối đe dọanghiêm trọng trong việc điều trị nhiễm khuẩn Ngày nay xu hướng sử dụng các sản phẩmbảo vệ sức khỏe có nguồn góc từ thiên nhiên đang được mọi người ưa chuộng vì các ưuđiểm mà nó mang lại như: ít dị ứng, ít tác dụng phụ, rẻ tiền, đạt hiệu quả điều trị tốt

Lần đầu tiên, thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá

tràm gió (Melaleuca cajuputi Powell) thu hái tại TP.Cần Thơ được khảo sát Tinh dầu lá

tràm gió được ly trích thành công bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đạt hiệusuất trung bình là 0,18% Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá tràm gió được xác định là hợp chất(1R,4E,9S)-4,11,11-trimethyl-8-methylidenebicyclo[7.2.0]undec-4-ene với hàm lượng15,04% Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tràm gió được thử nghiệm trên 2 chủng vi

khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633 và Salmonella typhimurium ATCC 14028 có nguồn

góc từ viện kiểm nghiệm thuốc TP HCM theo phương pháp khuếch tán nồng độ đã phaloãng trên mặt thạch

Kết quả khảo sát cho thấy hiệu suất chiết tinh dầu tràm gió bằng phương pháp lôicuốn hơi nước đạt giá trị trung bình là 0,1826% Tinh dầu tràm gió có tác động kháng

khuẩn tốt trên 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633 ở nồng độ tinh dầu pha loãng 25% có vòng vô khuẩn là 12 mm, 50% có vòng vô khuẩn là 14 mm và Salmonella typhimurium ATCC 14028 với giá trị nồng độ tinh dầu đã pha loãng 25% có vòng vô

khuẩn là 12 mm, 50% có vòng vô khuẩn là 13 mm

Tinh dầu tràm có tác động kháng khuẩn tốt trên 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC

6633 và Salmonella typhimurium ATCC 14028 Điều này mở ra khả năng sử dụng tinh

dầu này trong trị liệu, sản suất dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm

5

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU

Tỷ lệ đề kháng kháng sinh cao của các chủng vi khuẩn thường gây khó khăn trongtrị liệu dẫn đến việc kéo dài thời gian điều trị và có thể dẫn đến tử vong Theo chươngtrình giám sát quốc gia về tính kháng thuốc của một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp, thìnăm 1999, tỉ lệ kháng thuốc đối với 2 loại kháng sinh Ampicilin, Amoxicilin chỉ từ 10-30%, nhưng năm 2001 tỉ lệ này là 50- 70% và hiện nay đã lên tới trên 90%

Theo báo cáo của hoạt động theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gâybệnh thường gặp ở Việt Nam năm 2005 thì trong khoảng 22.647 chủng vi khuẩn được xácđịnh độ nhạy cảm với kháng sinh tại 8 bệnh viện đại diện cho 3 miền Bắc, Trung, Nam,kết quả cho thấy 5 vi khuẩn vẫn thường gặp nhất là: E coli (13,3%), trực khuẩn mủ xanh(13,3%), Staphylococcus (9,3%), Acinetobacter (9,9%) và Klebsiella (15,1%) Cả 5 loại

vi khuẩn này đều đề kháng với nhiều kháng sinh trong điều trị Ngày nay, con người đãdần thay đổi phương hướng sử dụng thuốc trong điều trị bệnh Các sản phẩm có nguồngốc từ thiên nhiên đang dần được sử dụng rộng rãi và phổ biến hơn trong điều trị một sốbệnh, trong đó đặc biệt là điều trị nhiễm khuẩn do vi sinh vật gây ra (Huỳnh Thị NgọcLan, Hồ Ánh Nguyệt, Lâm Thị Ngọc Phương, 2014)

Tinh dầu tràm gió đã chứng minh được tính kháng khuẩn tốt trên các vi khuẩn S aureus, P aerusinosa Việc tiếp tục nghiên cứu tính kháng khuẩn của tinh dầu này trên

các vi khuẩn khác sẽ mở ra khả năng ứng dụng cao hơn của tinh dầu này trên lâm sàngbởi vì việc kiểm soát sự nhiễm khuẩn một cách nhanh chóng và hiệu quả là rất cần thiết

và là yếu tố quyết định trong điều trị các vết thương nhiễm trùng

Tôi chọn thực hiện đề tài “ Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Bacillus subtilis

và Salmonella typhymurium của tinh dầu lá tràm gió (Melaleuca Cajuputi Powell) Đề

tài nhằm hướng tới các mục tiêu chính sau:

- Ly trích tinh dầu từ lá tràm gió theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơinước

- Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn của tinh dầu tràm gió trên 2 chủng vi

khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633 và Salmonella typhymurium ATCC

14028

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU2.1 Tổng quan về tinh dầu

2.1.1 Định nghĩa tinh dầu

Tinh Dầu là một hỗn hợp của nhiều thành phần Thường có mùi thơm, không tantrong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi ở nhiệt độ thường Có thể điều chế từthảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước

Tinh dầu từ trước đến nay luôn mang lại cảm giác tươi mát và thoải mái cho người

Các nhà khoa học đồng ý rằng tinh dầu có thể thực hiện nhiều hơn một chức năngtrong thực vật Trong một số trường hợp, tinh dầu dường như là một phần hệ miễn dịchcủa cây Trong trường hợp khác, tinh đầu có thể chỉ đơn giản là sản phẩm cuối cùng củaquá trình trao đổi chất Tinh dầu chứa hàng trăm thành phần hữu cơ, bao gồm hormone,vitamin và những thành phần tự nhiên khác với hoạt tính khác nhau Độ cô đặc của chúnggấp 75 đến 100 lần so với dầu trong các loại thảo mộc khô

Tinh dầu được chiết xuất từ những phần rất nhỏ của các loài thực vật, thậm chí từ

rễ, cánh hoa, hạt hay vỏ Người ta sẽ chiết xuất bằng phương pháp chưng cất hoặc làmlạnh Mỗi loại thực vật khác nhau sẽ cho ra tinh dầu với số lượng khác nhau ở nhiều mứcnhiệt độ

Chẳng hạn, 100 kg cánh hoa có thể sản xuất ra 20 mL tinh dầu hoa hồng, trong khi

đó 100 kg lá có thể sản xuất ra nhiều hơn ở mức 1-1,5 lít tinh dầu bạc hà Điều này sẽ chỉquyết định đến giá thành của từng loại tinh dầu mà không hề ảnh hưởng đến chất lượng,hiệu quả của mỗi loại (Lê Ngọc Thạch, 2003)

2.1.2 Lịch sử phát triển tinh dầu

Tinh dầu là một loại chất lỏng được tinh chế (thông thường nhất là bằng cáchchưng cất bằng hơi hoặc nước) từ lá cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây, hoặc những thànhphần khác của thực vật

7

Với lịch sử phát triển hàng ngàn năm, tinh dầu được mệnh danh là báu vật củathiên nhiên, được phát triển thành phương pháp trị liệu, chăm sóc sức khỏe, làm đẹp trêntoàn thế giới.

Tinh dầu thực vật đã được dùng trong những nền văn minh cổ đại vào thời giancách đây khoảng 6.000 năm hoặc xưa hơn

Hình 2.1 Người Ai Cập đã sử dụng tinh dầu cách đây hàng ngàn năm

Người Ai Cập cổ đại dùng phương pháp ngâm chiết để trích ly tinh dầu từ các loạicây cỏ có mùi thơm, và hương trầm có lẽ là một trong những phương cách cổ xưa nhấttrong việc sử dụng hương liệu Người Ai Cập rất thông thạo việc ướp xác bằng hương liệu

để bảo quản cơ thể Họ cũng thường dùng dầu thơm để xoa bóp cơ thể

Người Hy Lạp tiếp tục sử dụng tinh dầu thơm và dùng các loại dầu này cho cả haimục đích điều trị và trang điểm Một y sĩ Hy Lạp (Pedcaius Dioscorides) đã viết mộtquyển sách về một loại thảo dược, và trong ít nhất 1200 năm sau đó sách này được dùnglàm tham khảo cho Tây y Nhiều phương thuốc ông đưa ra cho đến nay vẫn còn đượcdùng trong liệu pháp hương

Người La Mã sao chép phần lớn kiến thức y khoa từ người Hy Lạp và đã cải thiệnkhả năng sử dụng các hương liệu, khi La Mã trở thành kinh đô của thế giới cổ đại Sau khitắm, họ thường xức dầu và xoa bóp Họ bắt đầu nhập các sản phẩm hương liệu mới từĐông Ấn và Ả Rập khi đã mở mang các tuyến đường mậu dịch

Kiến thức về các loại dầu hương liệu và nước hoa đã được truyền bá đến vùngViễn Đông và Ả Rập, một y sĩ tên Avcenna (980 – 1037 SCN) đã lần đầu tiên dùng mộtquy trình gọi là chưng cất để cất ra tinh dầu hoa hồng.

Các thời kì văn minh Trung Hoa cổ đại cũng dùng một số các hương liệu đồng thờivới người Ai Cập Thần Nông là quyển sách y học cổ xưa nhất hiện nay vẫn còn tại TrungQuốc, được viết ra khoảng 2700 năm TCN và có ghi chép về hơn 300 loài dược thảo.Người Trung Hoa đã dùng các loại hương liệu và đốt các loại gỗ thơm và hương trầm đểthực hành tín ngưỡng

Y học cổ truyền Ấn Độ gọi là Ayurveda, liệu pháp đã được thực hành từ hơn 3000năm qua, với việc xoa bóp bằng dầu thơm là một trong những công đoạn chính

Người Tây Ban Nha có số lượng dược thảo trồng trong các vườn nhà của họ rấtnhiều, người da đỏ ở Bắc Mỹ cũng dùng dầu hương liệu và đưa ra những phương thuốc trịbệnh của họ bằng dược thảo

Giữa thế kỉ 19, tinh dầu được tập trung nghiên cứu và trở thành một phương pháptrị liệu tổng thể và phổ cập tại nhiều nước như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Anh ,Pháp…

2.1.3 Vai trò của tinh dầu đối với đời sống của thực vật

Vấn đề về vai trò của tinh dầu trong đời sống của cây đã được đề cập tới trong rấtnhiều công trình nghiên cứu Theo quan niệm được trình bày trong các công trình khácnhau, vai trò của tinh dầu được quy tụ trong các nội dung sau đây (Ph X Tanaxienco,1985):

- Bảo vệ cây khỏi các tác động của sâu bệnh

- Che phủ các vết thương ở cây gỗ

- Ngăn chặn các bệnh do nấm

- Biến đổi sức căng bề mặt của nước trong cây, thúc đẩy sự vận chuyển nước, tănghiệu quả của các phản ứng enzym

Khi nghiên cứu vấn đề này, Charabot cho rằng tinh dầu đóng vai trò như các chất

dự trữ trong cây, nó có khả năng vận chuyển đến các phần khác nhau của cây, tại đây tinhdầu được sử dụng như một nguồn năng lượng hay tạo thành các sản phẩm mới có cấu trúcgần với nó

Theo quan điểm của Tschirch (1925) trong đời sống của cây, tinh dầu giữ vai tròquan trọng (tuy nhiên, theo tác giả chưa thể biết rõ đó là vai trò gì) và vì vậy không nênxếp tinh dầu vào nhóm các chất tiết một cách tuyệt đối Khác với Charabot, Tschirch cho

9

rằng đôi khi tinh dầu được “lưu giữ lại” trong các bể chứa tinh dầu và không tham gia vàocác phản ứng tiếp theo.

Phân tích các giả thuyết về vai trò của tinh dầu trong đời sống thực vật, Coxtrisep

X P (1937) cho rằng tinh dầu có thể được xếp vào 2 nhóm chức năng:

- Nhóm các tinh dầu có chức năng sinh lý được cây sử dụng trong quá trình sinhtrưởng

- Nhóm các tinh dầu không có chức năng sinh lý, không được cây sử dụng, chúngđơn thuần chỉ là các chất tiết của cơ thể và được tích lũy trong các bể chứa tinh dầu

Như vậy, theo quan điểm này, các thành phần của tinh dầu được tích lũy trong tuyến tiếtkhông có vai trò sinh lý trong hoạt động sống của cây Trong khi đó theo quan điểm thôngthường, tinh dầu thực vật chính là sản phẩm của quá trình tổng hợp và tích lũy do các cơquan tiết đảm nhiệm

Những năm sau này, khi dùng carbon đánh dấu để nghiên cứu quá trình chuyểnhóa tinh dầu trong cơ thể sống, Mutxtiatse (1985) đã chứng minh rằng, các thành phầntinh dầu được tích lũy trong tuyến tiết không phải là các chất tiết cố định mà còn tham giatích cực vào quá trình trao đổi chất của cây, do vậy thành phần hóa học của tinh dầu ởtrong cây luôn luôn được đổi mới

Những năm gần đây, vai trò sinh lý của tinh dầu trong đời sống thực vật đượcthống nhất trong hầu hết các tài liệu đã công bố Tuy nhiên, chức năng cụ thể của từnghợp chất còn phải được nghiên cứu sâu hơn

Qua các bằng chứng thực nghiệm, có thể khẳng định chắc chắn rằng, nhiều thànhphần hóa học của tinh dầu, ví dụ một số acid có phân tử lượng thấp, rượu, các aldehydemạch vòng … là những nguyên liệu khởi đầu để tổng hợp hàng loạt các chất có hoạt tínhsinh học Trong thành phần của tinh dầu, có thể gặp hàng loạt các chất khởi nguyên nóitrên, các acid hữu cơ thường gặp gồm: acid acetic, acid valerianic, acid isovalerianic …,

và các rượu tương ứng với chúng, ngoài ra còn thường gặp các aldehid, các ester, một sốterpenoid như geraniol, linalool, pharnesol, nerolydol … Đó là những hợp chất liên quantới nhiều kiểu cấu trúc hóa học khác nhau và tham gia vào các hệ thống đồng hóa khácnhau Trong thành phần tinh dầu còn thường thấy các hợp chất có nhân thơm như aneton,1-phenylethanol, benzaldehyde, vanilin, thậm chí cả các hợp chất có chứa nitơ và lưuhuỳnh Vì vậy không thể lý giải vai trò của tinh dầu một các chung chung hoặc nhìn nhậnvấn đề chỉ trong một vài giả thuyết cụ thể nào đó Để đánh giá chính xác vai trò của tinhdầu trong hoạt động sống ở cây, cần phải tiến hành nghiên cứu từng thành phần riêng lẻcủa tinh dầu hoặc các hợp chất có cấu trúc gần nhau

Hiện nay, các bằng chứng xác đáng chủ yếu tập trung vào sự tham gia của cácthành phần tinh dầu trong quá trình trao đổi chất, có nghĩa là tinh dầu tham gia vào cácquá trình sinh lý hóa bên trong tế bào Và nhiều kết quả nghiên cứu gần đây đã chứngminh rằng, một số dạng terpenoid của tinh dầu như các geraniol, linalool, farnesol …thường có mặt trong hầu hết các cơ thể sống ở tất cả các mức độ tiến hóa khác nhau, từcác vi sinh vật, các loài thực vật bậc thấp, thực vật bậc cao, đến cả động vật cũng như conngười Các terpen được hình thành từ 2,3 hoặc nhiều phân tử isopren (C5H8) và isopren lại

là một trong những hợp chất cơ sở để tạo thành các carotenoid, các steroid và cao su Cáckết quả nghiên cứu tiếp theo đã xác nhận rằng, quá trình sinh tổng hợp trong mọi cơ thểthực vật đều bắt nguồn từ hợp chất ban đầu là acid acetic qua các sản phẩm trung gian làacid mevalonic, isopentenil pirophosphat đến geranil và farnesil phosphat Bằng thựcnghiệm, người ta đã chứng minh được các chuỗi carbon trong các phân tử geraniol,linalool, farnesol và nerolidol là những sản phẩm trung gian chủ yếu trong quá trình sinhtổng hợp các terpenoid có hoạt tính sinh học như các phyton, hocmon steroid, acid mật,các vitamin D, vitamin K, vitamin E, các carotenoid, các chất kích thích sinh trưởng thuộcnhóm giberilin … Một số hợp chất thường gặp trong thành phần của tinh dầu nhưlinalool, farnesol, nerolidol … luôn có mặt trong hầu hết các hoạt động sống của cây

Người ta cũng đã chứng minh được rằng, trong cơ quan tiết của cây cao su Heven brasiliensis (Willd Ex A Juss Mull.-Arg.), cùng với các phân tử cao su còn có acid

nucleic, các hệ men …, một hỗn hợp của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cùng thamgia duy trì các quá trình trao đổi chất Tinh dầu không chỉ được tích lũy ở các cơ quan tiếtriêng biệt mà còn gặp trong các tế bào sống ở nhiều cơ quan khác nhau của thực vật: trongcánh hoa, đài hoa, trong rễ, trong thân, trong quả …) Trong cơ thể thực vật, tinh dầuthường là một hỗn hợp có thành phần cấu tạo phức tạp, chúng thường gồm rất nhiều hợpchất ở dạng tự do hoặc liên kết Ví dụ, bằng cách sử dụng nguyên tử carbon đánh dấu

trong thử nghiệm trên cây cà rốt Dacus carota L., chúng ta có thể nhận thấy có sự chuyển

hóa của geraniol vào citral và citral lại được chuyển vào geraniol

Chúng ta cũng có thể nhận thấy rằng, trong tinh dầu, các hợp chất có chứa nhómrượu bậc I, bậc II luôn có mặt cùng với các hợp chất carbonil tương ứng Các geraniol –citral, citronellol – citronellal, carvol – carvon, rượu và các chất tương ứng này (cácceton, aldehyde) luôn thay đổi trong quá trình phát triển cá thể ở cây: giảm ceton thì tăngrượu hoặc ngược lại, nhưng tổng rượu và ceton luôn ổn định Như vậy giữa rượu và cetonhoặc aldehyde tương ứng luôn tồn tại một cân bằng động, mà cân bằng này có quan hệ

11

chặt chẽ với quá trình phát triển cá thể của cây cũng như các yếu tố ngoại cảnh theonhững quy luật nhất định (Lê Ngọc Thạch, 2003)

2.1.4 Nguyên liệu sản xuất tinh dầu

Hiện nay người ta đã biết được rằng các tinh dầu có trong 298 họ cây khác

nhau, trong đó có 87 họ có giá trị

Sau đây là ba họ có nhiều loài cho tinh dầu:

Họ Cúc (Asteraceae)

Là họ cây tinh dầu lớn nhất bao gồm h ơn 1000 giống và 25000 loài Đây là một họrất đa dạng bao gồm: cây xanh quanh năm, cỏ có căn h ành, cây lưu niên có củ, cỏ mọngnước hay cỏ thân cứng Nhiều loại cúc có thể nhận biết nhờ đặc trưnghoa tự của nó Cáccây họ Cúc chủ yếu trong v ùng bán khô cằn nhiệt đới, cận nhiệt đới, hầu hết trong vùngĐịa Trung Hải, ôn đới, hiếm có ở vùng mưa nhiệt đới

Họ Hoa Môi (Lamiaceae)

Có mặt hầu như ở khắp mọi nơi trên thế giớ, bao gồm khoảng 200 giống và từ

2000 đến 5000 loài có chứa tinh dầu thường ở dạng cây bụi thấp Hầu hết họ Hoa Môichứa terpene và một số cấu phần khác chủ yếu trong tuyến tinh dầu ở biểu bì của lá, thân

Họ Hoa tán, Ngò (Umbellifferae, Apiaceae)

Là một họ lớn gồm khoảng 300 giống v à 3000 loài có hương thơm, được phân bốkhắp nơi Các cây thuộc họ này có đới sống bán niên hoặc nhất niên, chiều cao thay đổi từvài cm đến vài m, hầu hết được dùng làm hương liệu, sản xuất tinh dầu dùng trong thựcphẩm, dược phẩm, hương liệu …

Bảng 2.1 Các loài thực vật chứa nhiều tinh dầu phổ biến

Lavandula angusti folia Mill Lavender - Oải hương Lamiaceae

Pogostemon patchouly Pellet Patchouli - Hoắc hương

Vetiveria zizanioides Nash. Vetiver - Hương bài

Sassafras albidum Trew. Sassafras - Xá xị

Eugenia caryopillus Spreng. Clove - Đinh hương

Tinh dầu có thể chứa ở rễ, căn h ành, thân, cành, lá, hoa, trái, hạt Tinh dầu ở mỗi

bộ phận trên cùng một cây có thể giống nhau hoặc khác nhau rất nhiều về thành phần hoáhọc, hàm lượng tinh dầu, hàm lượng cấu phần chính Để phù hợp với quá trình sơ bộ chếbiến nguyên liệu và các điều kiện kỹ thuật khai thác riêng cho từng loại nguyên liệu một,nhằm hợp lý hoá quá trình sản xuất, nâng cao chất lượng và hiệu quả của thành phẩm,người ta chia nguyên liệu tinh dầu ra thành những dạng như sau:

- Nguyên liệu quả và hạt: sa nhân, xuyên tiêu, màng tang, thảo quả, phật thủ…

- Nguyên lệu cỏ, lá: cỏ vertiver, lá bạc hà, hương nhu, húng quế, húng chanh, tía tô,kinh giới, rau má, lá sả, lá tràm…

- Nguyên liệu hoa: hoa hồng, hoa bưởi, đinh hương, hoa hồi…

- Nguyên liệu củ, rễ: củ gừng, riềng, nghệ, h ành, tỏi, xuyên khung, bạch chỉ, bạchtruật, đương quy…

Ngoài ra còn có những nguyên liệu từ dạng gỗ, hoặc vỏ quả (cam, chanh, quýt), vỏcây các loại (quế) và các loại nhựa (cánh kiến, thông)… (Vũ Ngọc Lộ, 1996)

2.1.5 Các công dụng của tinh dầu

Là nguyên liệu chính trong dược phẩm, mỹ phẩm & thực phẩm Được sử dụng rấtnhiều trong trị liệu và chăm sức khỏe trên thế giới từ rất lâu Khử mùi, tạo hương thiênnhiên cho hầu hết các doanh nghiệp, gia đình

Không có gì là ngạc nhiên khi giá thành của mỗi loại tinh dầu rất cao Bên cạnhquy trình chiết xuất phức tạp thì những lợi ích mà tinh dầu mang lại cũng góp phần làmcho giá thành các loại sản phẩm này cao: tinh dầu có thể giúp khử trùng, giảm sưng tấy,tăng tuần hoàn máu, giúp làm lành các vết thương hay bỏng một cách nhanh chóng, …

Ngoài ra, về mặt tinh thần tinh dầu giúp đầu óc minh mẫn, thoải mái, tăng cườngkhả năng tập trung và lấy lại nguồn cảm hứng Một số bài nghiên cứu gần đây đã có nhiềuphát hiện thú vị về ảnh hưởng của tinh dầu đối với tinh thần cảm xúc của con người như

nó làm tăng sự hứng thú, dễ thông cảm, khiến con người trở nên ôn hòa hơn

Tuy nhiên, tăng cường khả năng hấp thụ khí oxy của tế bào là một trong những lợiích quan trọng của tinh dầu Những hạt tinh dầu khiết sẽ sản sinh ra các chất kháng thể vàgiải phóng các hormone giảm đau cũng như các chất dẫn truyền dây thần kinh Mỗi hạt

13

tinh dầu sẽ có tần số giải phóng cao hơn nhiều so với tần số nếu cơ thể tự sản sinh ra Vìvậy tinh dầu còn có khả năng chữa một số bệnh.

Một số thực vật, như Rose (Hoa Hồng) hoặc Jasmine (Hoa Nhài) chứa rất ít tinhdầu Thành phần mang hương thơm của thực vật được chiết xuất bằng cách sử dụng một

số dung môi hóa chất Sản phẩm cuối cùng, được gọi là chất toàn hương (absolute), chứamột ít tinh dầu cùng với những thành phần mang hương khác Mặc dù đây không thực sự

là tinh dầu, chất toàn hương (absolute) vẫn thường được sử dụng để tạo hương cho mỹphẩm, chẳng hạn như nước hoa cao cấp

Ngoài ra, có sự khác biệt đáng kể giữa hương liệu thơm hóa tổng hợp (syntheticfragrance oil) và tinh dầu nguyên chất (pure essential oil) Dầu thơm hóa tổng hợp đượcsản xuất bằng cách pha trộn những hóa chất có mùi thơm chủ yếu có nguồn gốc từ nhựathan đá Những loại dầu này có thể bắt chước khá giống các mùi thơm của tinh dầunguyên chất, nhưng thành phần hóa học phức tạp của tinh dầu nguyên chất mới chính làyếu tố xác định lợi ích thật sự của tinh dầu

Trong khi hương liệu thơm hóa tổng hợp (synthetic fragrance oil) không phù hợpvới liệu pháp tinh dầu, người ta vẫn dùng để thêm những mùi hương bắt chước này vàohàng thủ công, hương liệu hỗn hợp, xà phòng, nước hoa để giảm giá giá thành

Ngoài ra, có sự khác biệt đáng kể giữa hương liệu thơm hóa tổng hợp (syntheticfragrance oil) và tinh dầu nguyên chất (pure essential oil) Dầu thơm hóa tổng hợp đượcsản xuất bằng cách pha trộn những hóa chất có mùi thơm chủ yếu có nguồn gốc từ nhựathan đá Những loại dầu này có thể giả các mùi thơm của tinh dầu nguyên chất, nhưngthành phần hóa học phức tạp của mỗi tinh dầu tạo ra trong tự nhiên xác định lợi ích thật

sự hương thơm của tinh dầu

Trong khi hương liệu thơm hóa tổng hợp (synthetic fragrance oil) không phù hợpvới liệu pháp tinh dầu, người ta thêm những mùi hương bắt chước này vào hàng thủ công,hương liệu hỗn hợp, xà phòng hay nước hoa để giảm giá giá thành (Văn Ngọc Hướng,2003)

2.2 Tổng quan về Tràm gió

Tên khoa học: Melaleuca cajuputi Powell

Tên đồng nghĩa: Myrtus leucadendra L., 1759, Myrtus saligna Burm f., 1786,Melaleuca leucadendra (L.) L., 1767, Melaleuca minor Smith, 1812, Melaleucaleucadendron (L.) L var minor (Smith) Duthie, 1878

Tên khác: Chè cay, chè đồng, khuynh diệp, bạch thiên tầng

Họ: Sim - Myrtaceae

Hình 2.2 Cây tràm gió trong tự nhiên Hình 2.3 Hình thái sinh học của cây Tràm gió

Tên thương phẩm: Cajeput oil, cineol oil, 1,8-cineol oil

2.2.1 Phân loại

Melaleuca cajuputi Powell subsp cajuputi: hoa nở vào tháng 3 đến tháng 11 Cây

phát triển và phân bố ở bán đảo Dampier, sông Calder, Tây Úc và Đông Timor

Melaleuca cajuputi subsp cumingiana ( Turcz.) Barlow: hoa nở từ tháng 2 đến

tháng 12 Rừng tràm gió phân bố ở ven biển Việt Nam, Myanmar, Thái Lan, Malaysia vàIndonesia

Melaleuca cajuputi subsp platyphylla Barlow: hoa nở từ tháng 1 đến tháng 5 và

tháng 8 đến tháng 9 Cây phát triển ở New Guinea, đảo Torres Strait và tây bắcQueensland

2.2.2 Hình thái

Cây gỗ nhỏ hay trung bình, thường xanh, cao 10-15 m (đôi khi tới 20-25 m), vàđường kính có thể đạt 50-60 cm Đôi khi là cây bụi, cao 0,5-2 m, nếu mọc ở vùng đồi cằncỗi thân thường không thẳng, vỏ ngoài mỏng, xốp, màu trắng xám, thường bong thànhnhiều lớp Hệ rễ phát triển mạnh Lá đơn, mọc so le, phiến lá hình mác hay hình trái xoanhẹp, thường không cân đối, kích thước 4-8 (-10) x 1-2,0 (- 2,5) cm, đầu nhọn hoặc tù, gốctròn hoặc hơi hình nêm, dày, lúc non có lông mềm màu trắng bạc, sau nhẵn, màu xanhlục, gân chính 5 (đôi khi 6), hình cung, cuống lá ngắn, có lông

15

Cụm hoa bông mọc ở đầu cành hay nách lá Hoa nhỏ, màu trắng, trắng xanh nhạt,trắng vàng nhạt hoặc trắng kem, đài hợp ở gốc thành ống hình trụ hay hình trứng, 5 thuỳđài rất ngắn, cánh tràng 5, có móng rất ngắn (các thuỳ đài và cánh tràng đều sớm rụng),nhị nhiều, hợp thành 5 bó, xếp đối diện với thuỳ đài, đĩa mật chia thuỳ, có lông mềm, bầu

ẩn trong ống đài, 3 ô

Quả nang gần hình chén hoặc hình bán cầu hoặc hình cầu, kích thước 3- 4mm, khi chín nứt thành 3 mảnh Hạt hình nêm hoặc hình trứng Sau khi hoa nở, tạo quả,trục cụm hoa tiếp tục sinh trưởng, phát triển tạo thành từng đoạn mang hoa quả và mang

3,5x3,5-lá xen kẽ nhau

2.2.3 Đặc điểm sinh học

Tràm (M cajuputi) có biên độ sinh thái rộng Song rừng tràm nguyên sinh thường

phân bố trên các bãi cửa sông, các bãi lầy ven biển trong vùng nhiệt đới nóng, ẩm Tràmsinh trưởng tốt ở những khu vực có nhiệt độ trung bình tối đa khoảng 31-330oC và trungbình tối thấp khoảng 17-220oC Tràm không chịu được băng giá Các khu vực tràm phân

bố tập trung thường có lượng mưa trung bình năm 1.300-1.700 mm và có gió mùa điểnhình Ở nước ta, “tràm đồi” thường mọc trong các thảm cây bụi ưa sáng, trên các đồi đấtthấp, đất feralit, đất cát, đất pha cát, đất lầy phèn mặn, đất khô hạn hay ngập nước theomùa, đất chua (pH 3,7-5,5) và nghèo dinh dưỡng Dạng “tràm cừ” mọc trên các khu vựcđất phèn ngập nước theo mùa hay thường xuyên thuộc vùng Đồng Tháp Mười, như ở cáctỉnh Long An, An Giang, Đồng Tháp, Cà Mau, Kiên Giang Tại khu vực này, đất thường

có thành phần cơ giới nặng, rất chua (pH 3-3,5), giàu mùn hoặc tích tụ thành lớp than bùndày 0,3-1,0 m

Tràm là cây lâu năm, ưa sáng và có bộ tán thưa Trong tự nhiên, tràm phát tán, táisinh từ hạt, từ gốc hoặc từ rễ Tràm cừ có tốc độ tăng trưởng khá nhanh, có thể đạt tới 2,3m/năm theo chiều cao và 7 cm/năm theo đường kính thân Với điều kiện nước ta, câythường bắt đầu ra hoa ở giai đoạn 2-3 tuổi Hoa thụ phấn chéo nhờ côn trùng là chủ yếu.Tại các tỉnh miền Trung, tràm thường ra hoa vào tháng 10-12 và quả chín vào các tháng1-3 năm sau

2.2.5 Bộ phận dùng

Cành mang lá - Ramulus cum folio Melaleucae

Tinh dầu - Oleum Cajeputi.

Đặc điểm vi học của lá tràm:

- Biểu bì có lớp cutin dày mang nhiều lỗ khí ở cả 2 mặt lá

- Mô mềm giậu có từ 1 đến 2 hàng tế bào ở cả 2 mặt của phiếu lá

- Bó libe gỗ được bao bọc bởi 1 vòng nội bì và 1 vòng sợi trụ bì

- Các túi tiết tinh dầu nằm rải rác trong mô mềm

2.2.6 Thành phần hóa học

Lá có chứa tinh dầu Hàm lượng tinh dầu thay đổi theo từng vùng và theo mùa ởcác tỉnh miền Trung DĐVN IV qui định hàm lượng tinh dầu không dưới 1% (tính trênnguyên liệu khô tuyệt đối)

Tinh dầu tràm gió, Oleum Cajeputi, tên thương phẩm Cajeput oil là chất lỏng màuvàng nhạt, mùi dễ chịu, d20 : 0,910 - 0,925, nD20 : 1,466 - 1,472, D20 : - 30 đến – 10

Thành phần chính là cineol Hàm lượng cineol thay đổi theo từng vùng Tinh dầutràm Long An chứa từ 52 đến 69% cineol, Quảng Bình 51 - 72% Ngoài ra trong tinh dầucòn có chứa một hàm lượng đáng kể linalol (2 - 5%) và terpineol (6 - 11%)

2.2.7 Công dụng

Tràm gió được trồng và sử dụng như nguồn nhiên liệu, làm than ở Đông Nam Á

Gỗ cây Tràm gió còn được dùng làm cột, sàn nhà, hàng rào,… Vỏ cây được dùng làmnguyên liệu để lợp, tráng kín thuyền,…

Người Úc bản địa đã sử dụng lá của loài này để chữa bệnh đau nhức, trị bệnh vềđường hô hấp Tại Thái Lan, lá tràm gió được sử dụng để chế trà thảo dược để trị bệnh

Cây Tràm Gió được dùng chủ yếu để chiết xuất tinh dầu tràm gió Cajuput, hay còn gọi tắt

là dầu tràm Tnh dầu tràm gió trên thị thường hầu hết là từ loại Melaleuca cajuputi subsp.

cajuputi

Dầu Tràm chứa đến 60% 1,8 – cineole (Cineol), thành phần kháng khuẩn chính tạonên tác dụng của của dầu Dầu tràm gió được phân loại là không độc, không nhạy cảm(mặc dù kích ứng da có thể xảy ra ở nồng độ cao) Dầu tràm có nhiều tác dụng hữu íchnhư chữa bệnh đường hô hấp, an thần, điều trị giun, nhiễm trùng đường sinh dục, đuổicôn trùng,…

Lá tràm (ngọn mang lá) được dùng trong phạm vi nhân dân để chữa cảm phonghàn, tiêu hoá kém, ho có đờm

17

Hình 2.4 Vi khuẩn Salmonella typhymủium soi trên kính hiển vi

Tinh dầu tràm và cineol có tác dụng sát khuẩn đường hô hấp, kích thích trung tâm

hô hấp, chữa viêm nhiễm đường hô hấp Có khoảng hơn 200 chế phẩm có cineol Tinhdầu tràm còn có tác dụng kháng khuẩn, làm lành vết thương, chữa bỏng, làm chóng lành

da Từ nước ót tinh dầu khi đã loại cineol đã chiết xuất được linalol và terpineol.Terpineol có tác dụng kháng khuẩn mạnh

Tinh dầu tràm được sử dụng để tạo hương vị cho thực phẩm, xà phòng, mỹ phẩm,

… và trong liệu pháp hương thơm Aromatherapy (Nguyễn Năng Vinh, 1977)

2.3 Tổng quan về chủng vi khuẩn nghiên cứu

2.3.1 Salmonella typhimurium

2.3.1.1 Đặc điểm sinh vật học

Salmon phân lập từ năm l885 giống như các vi khuẩn đường ruột khác: Hình trực,Gram âm, có nhiều lông nên di động

Nuôi cấy: Trong môi trường canh thang, mọc nhanh, sau 10 giờ và làm đục môi

trường Môi trường thạch thường, Salmonella phát triển tốt sau 24 giờ, tạo khuẩn lạc dạng

s màu trắng xám

2.3.1.2 Tính chất sinh vật hoá học

- Lên men và sinh hơi đường glucose (trừ Salmonella typhi lên men nhưng không

sinh hơi)

- Không lên men đường lactose, saccharose

- Sinh H2S trong môi trường thạch chì

- Không sinh indol trong môi trường pepton

- Không có urease, có enzym catalase

- Không chuyển hoá được citrat trong môi trường Simmons

2.3.1.3 Sức đề kháng

- Ở tự nhiên: Trong nước sống được 1 tuần, trong phân sống được 2 tháng Đây là lý

Có nội độc tố với các đặc điểm:

- Là độc tố chính trong việc gây bệnh

- Có độc lực cao: 400 mg/chết người

- Có khả năng chịu nhiệt độ cao: Ở 100°C sau 2 giờ vẫn còn tác dụng

- Gây tổn thương: Ruột non, dạ dày, mảng payer, tuyến thượng thận, tim, não thấtШ

2.3.1.5 Kháng nguyên

Có 2 loại chính

- Kháng nguyên O: Có tính đặc hiệu cao, tạo được miễn dịch sớm (kháng thể xuất

hiện sau 7 ngày và hết sau 3 tháng) vì thế được dùng trong chẩn đoán bệnh thương hàn

- Kháng nguyên H: Tạo miễn dịch muộn và hết muộn (kháng thể xuất hiện sau 12

ngày và hết sau 1 năm), thường đùng trong điều tra dịch tễ bệnh thương hàn

2.3.1.6 Phân loại:

Salmonella được phân loại dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên Hiệnnay có khoảng 1.500 typ huyết thanh (còn gọi là loài) Salmonella Đặt tên cho mỗi loàiSalmonella mới tìm ra có thể lấy tên động vật mang mầm bệnh hoặc tên địa phương đãphân lập ra chúng lần đầu tiên

Sau đây là một số loài Salmonella đáng được chú ý nhất:

- S.typhi: Chỉ gây bệnh cho người Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu do S.typhigây ra

- S.paratyphi A: Cũng chỉ gây bệnh thương hàn cho người Ở nước ta cũng hay gặploài này sau S.typhi

- S.paratyphi В: Gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi ở cả súc vật Bệnhthường gặp ở các nước Châu Âu

- S.paratyphi С: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn, vừa có khả năng gây viêm

dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết thường gặp ở các nước đông nam Châu Á

- S.typhimurium và S enteritidis gây bệnh cho người và súc vật Hai loài này lànguyên nhân chủ yếu của nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn do Salmonella

- S.choleraesuis: Là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do

Salmonella ở nước ta (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003)

19

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg

và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis” Gần 30 năm sau, CasimirDavaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium” Năm 1872, Ferdimand Cohn xác

định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis.

Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học

Nazi của Đức Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đứcchiến đấu ở Bắc Phi Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần

khiết của Bacillus subtilis Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời Bacillus subtilis được sử dụng

ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đườngtiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…

Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm

năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…

2.3.2.2 Phân loại

Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:

- Giới (Kingdom): Bacteria

- Ngành (Division): Firmicutes

- Lớp (Class): Bacilli

- Bộ (Order): Bacillales

- Họ (Family): Bacillaceae

- Giống (Genus): Bacillus

- Loài (Species): Bacillus subtilis

2.3.2.3 Đặc điểm của Bacillus subtilis

a Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.

Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏkhô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 106 –

107 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện củachúng rất hiếm Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì

(trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về

mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học

Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi

một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ làvitamin và amino acid cho sự sinh trưởng Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae,Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môitrường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB)

Năm 1993, giáo sư Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston (Mỹ)

và Jose Gonzalez-Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Madrid (Tây Ban

Nha) đã chứng minh được loài Bacillus subtilis có tập tính ăn thịt đồng loại Chúng dùng

cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời sống giớihạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt Một cách đơn giản là các cá thể khỏemạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả khác loài lẫn cùngloài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ đến khi môi trườngthuận lợi hơn Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúngthường tạo ra bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng (Nguyễn Lân Dũng

và cộng sự, 2003)

b Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước

0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có

8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước

từ 0,8 – 1,8µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không khángacid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ,

áp suất, chất sát trùng Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm Đã có những chứng

cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 – 300 năm.

21

Hình 2.5 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi

c Đặc điểm sinh hóa

Lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol,saccharose, xylose và arabinose

Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase(+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+)

Hình 2.6 Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtillis 2.3.2.4 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát

triển được trong môi trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 –7,4

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ

bản:

- Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìarăng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhănnheo, màu hơi nâu

- Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đụcmôi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều

- Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lanrộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4cm sau 72 giờ nuôi cấy

Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vilượng khác Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (nhưglucose) và nitơ (như peptone)

2.3.2.5 Bộ gen của Bacillus subtilis

Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn này Bộ gen chứa 4,2 mega-base,

xấp xỉ 4.110 gen Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán

là thiết yếu Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào

2.3.2.6 Bào tử và khả năng tạo bào tử

a Bào tử:

Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bảnnhư ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và cóthêm một số thành phần mới

Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0

– 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein,peptidoglycan…

Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảymầm tại phần đầu của ruột non Đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất

probiotic từ Bacillus subtilis.

b Khả năng tạo bào tử:

Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bấtlợi (dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi chất

có hại và nhiệt độ cao…)

Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:

- Hình thành những búi chất nhiễm sắc

- Tạo tiền bào tử

- Tiền bào tử hình thành hai lớp mảng, tăng cao tính bức xạ

- Tổng hợp các lớp vỏ bào tử

- Giải phóng bào tử

23

- Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng mới (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003)

2.4 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Phương pháp này dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo hơi nướccủa những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ởnhiệt độ cao Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyênliệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định Trường hợp mô thực vật

có chứa sáp, nhựa, acid béo chi phương dây dài thì phải dùng nhiều hơi nước hơn và sựchưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm ápsuất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn

Hình 2.7 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước bằng bộ clevenger

2.4.1 Lý thuyết chưng cất

Chưng cất có thể được định nghĩa là: “Sự tách rời các cấu phần của một hỗn hợpnhiều hợp chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng” Trong trường hợpđơn giản, khi chưng cất một hỗn hợp gồm hai hợp chất lỏng không hòa tan vào nhau, ápsuất hơi tổng cộng là tổng của hai áp suất hơi riêng phần Do đó, nhiệt độ sôi của hỗn hợp

sẽ tương ứng với một áp suất hơi tổng cộng xác định, không tùy thuộc vào thành phầnbách phân của hỗn hợp, miễn là lúc đó hai pha lỏng vẫn còn tồn tại nếu vẽ đường cong ápsuất hơi của từng hợp chất theo nhiệt độ, rồi vẽ đường cong áp suất hơi tổng cộng, thì ứngvới mỗi áp suất ta dễ dàng suy ra nhiệt độ sôi tương ứng của hỗn hợp và nhận thấy lànhiệt độ sôi của hỗn hợp nhiêt độ sôi của hỗn hợp luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi củatừng hợp chất Ví dụ: Ở áp suất 760 mmHg nước sôi ở 100ºC và benzene sôi ở 80ºC vàchúng là hai chất lỏng không tan vào nhau Thực hành cho thấy nếu đung hỗn hợp này

dưới áp suất 760 mmHg nó sẽ sôi ở 69ºC cho đến khi nào còn hỗn hợp hai pha lỏng ở bất

kỳ tỷ lệ nào Giản đồ nhiệt độ thép áp suất cho thấy tại 69ºC áp suất hơi của nước là 225mmHg và benzene là 535 mmHg

Chính vì những đặc tính làm giảm nhiệt độ sôi này mà từ lâu phương pháp chưngcất hơi nước là phương pháp đầu tiên dùng để tách tinh dầu ra khỏi nguyên liệu thực vật

2.4.2 Những ảnh hưởng chính trong sự chưng cất hơi nước

2.4.2.1 Sự khuếch tán

Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụ thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu là bị vỡ

và cho tinh dầu thoát ra tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi Phần lớn tinh dầu còn lạitrong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩmthấu Von Rechenberg đã mô tả quá trình chưng cất hơi nước như sau: “Ở nhiệt độ nướcsôi, một phần tinh dầu hòa tan vào trong nước có sẵn trong tế bào thực vật Dung dịch này

sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nước lôi cuốn đi Còn nước đi vàonguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục hòa tan vào lượng nước này Quytrình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát ra ngoài hết Như vậy, sựhiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong trường hợp chưng cất sử dụng hơi nướcquá nhiệt, chú ý tránh đừng để nguyên liệu bị khô Nhưng nếu lượng nước sử dụng thừaquá cũng không có lợi, nhất là trong trường hợp tinh dầu có chứa những cấu phần tan dễtrong nước

Ngoài ra, vì nguyên liệu được làm vỡ vụn ra càng nhiều càng tốt, cần làm cho lớpnguyên liệu có một độ xốp nhất định để hơi nước có thể đi xuyên ngang lớp này đồng đều

và dễ dàng Vì các cấu phần tinh dầu được chưng cất hơi nước theo nguyên tắc nói trêncho nên thông thường những hợp chất nào dễ hòa tan trong nước sẽ được lôi cuốn trước

Ví dụ, khi chưng cất hơi nước hạt caraway nghiền nhỏ và không nghiền, đối vớihạt không nghiền thì carvon (nhiệt độ sôi cao nhưng tan nhiều trong nước) sẽ ra trước,còn limonen (nhiệt độ sôi thấp nhưng ít tan trong nước) sẽ ra sau Nhưng với hạt carawaynghiền nhỉ thì kết quả chưng cất ngược lại

2.4.2.2 Sự thủy giải

Những cấu phần ester trong tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho ra acid và alcol khiđun nóng trong một thời gian dài với nước Do đó, để hạn chế hiện tượng này, sự cất hơinước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt

2.4.2.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi nước quánhiệt (trên 100°C) nên thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của sự chưng cất, sau

25

khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết Thực ra, hầu hết các tinh dầu đều kém bềndưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề là làm sao cho thời gian chịu nhiệt độ cao của tinh dầucàng ngắn càng tốt Tóm lại, dù ba ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế thìchúng có liên quan với nhau và quy về ảnh hưởng của nhiệt độ Khi tăng nhiệt độ, sựkhuyếch tán thẩm thấu sẽ tăng, sự hòa tan tinh dầu trong nước sẽ tăng nhưng sự phân hủycũng tăng theo.

Trong công nghiệp, dựa trên thực hành người ta chia các phương pháp chưng cấthơi nước ra ba loại chính:

- Chưng cất bằng nước

- Chưng cất bằng nước và hơi nước

- Chưng cất bằng hơi nước

Cả ba phương pháp này đều có lý thuyết giống nhau nhưng khác nhau ở cách thựchiện

2.4.2.4 Chưng cất bằng nước

Trong trường hợp này, nước phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảngkhông gian tương đối lớn phía trên lớp nước, để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chấtnạp qua hệ thống hoàn lưu Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặc đunbằng hơi nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy) Trong trường hợp chấtnạp quá mịn lắng chặt xuống đáy nồi gây hiện tượng cháy khét nguyên liệu ở mặt tiếp xúcvới đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị những cánh khuấy trộn đều bên trong trong suốt thờigian chưng cất

Sự chưng cất này thường không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải.Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này Những cấu phần cónhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ đầykhiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những hợp chất này Thí dụ điển hình là mùi tinhdầu hoa hồng thu được từ phương pháp chưng cất hơi nước kém hơn sản phẩm tẩm trích

từ eugenol và alcol phenetil nằm lại trong nước khá nhiều, vì thế người ta chỉ dùngphương pháp này khi không thể sử dụng các phương pháp khác

2.4.2.5 Chưng cất bằng nước và hơi nước

Trong phương pháp này, nguyên liệu được xếp trên một vỉ đục lỗ và nồi cất được

đổ nước sao cho nước không chạm đến vỉ

Nhiệt cung cấp có thể là ngọn lửa đốt trực tiếp hoặc dùng hơi nước từ nồi hơi dẫnvào lớp bao chung quanh phần đáy nồi Có thể coi phương pháp này là một trường hợpđiển hình của phương pháp chưng cất bằng hơi nước với hơi nước ở áp suất thường Như

vậy chất ngưng tụ sẽ chứa ít sản phẩm phân hủy hơn là trường hợp chưng cất bằng hơinước trực tiếp, nhất là ở áp suất cao hay hơi nước quá nhiệt

Việc chuẩn bị nguyên liệu trong trường trường hợp này quan trọng hơn nhiều sovới phương pháp trước, vì hơi nước tiếp xúc với chất nạp chỉ bằng cách xuyên qua nó nênphải sắp xếp thế nào để chất nạp tiếp xúc tối đa với hơi nước thì mới có kết quả tốt Muốnvậy, chất nạp nên có kích thước đồng đều không sai biệt nhau quá

Nếu chất nạp được nghiền quá mịn, nó dễ tụ lại vón cục và chỉ cho hơi nước đi quamột vài khe nhỏ do hơi nước tự phá xuyên lên Như vậy phần lớn chất nạp sẽ không đượctiếp xúc với hơi nước Ngoài ra, luồng hơi nước đầu tiên mang tinh dầu có thể bị ngưng tụ

và tinh dầu rơi ngược lại vào lớp nước nòng bên dưới gây hư hỏng thất thoát Do đó việcchuẩn bị chất nạp cần được quan tâm nghiêm túc và đòi hỏi kinh nghiệm tạo kích thướcchất nạp cho từng loại nguyên liệu

Tốc độ chưng cất trong trường hợp này không quan trọng như trong trường hợpchưng cất bằng nước Tuy nhiên, tốc độ nhanh sẽ có lợi vì ngăn được tình trạng quá ướtcủa chất nạp và gia tăng vận tốc chưng cất Về sản lượng tinh dầu mỗi giờ, người ta thấy

nó khá hơn phương pháp chưng cất bằng nước nhưng vẫn còn kém hơn phương phápchưng cất bằng hơi nước sẽ đề cập sau

So với phương pháp chưng cất bằng nước, ưu điểm của nó là ít tạo ra sản phẩmphân hủy Do đó, dù với thiết bị loại nào đi nữa, ta phải đảm bảo là chỉ có phần đáy nồi làđược phép đốt nóng và giữ cho phần vỉ chứa chất nạp không tiếp xúc với nước sôi.Phương pháp này cũng tốn ít nhiên liệu, tuy nhiên nó không thể áp dụng cho nhữngnguyên liệu dễ bị vón cục

Khuyết điểm chính của phương pháp là do thực hiện ở áp suất thường, nên cấuphần có nhiệt độ sôi cao sẽ đòi hỏi một lượng rất lớn hơi nước để hóa hơi hoàn toàn vànhư thế sẽ tốn rất nhiều thời gian Về kỹ thuật, khi xong một lần chưng cất, nước ở bêndưới vỉ phải được thay thế để tránh cho mẻ sản phẩm sau có mùi lạ

2.4.2.6 Chưng cất bằng hơi nước

Hơi nước tạo ra từ nồi hơi, thường có áp suất cao hơn không khí, được đưa thẳngvào bình chưng cất Trong kỹ nghệ này phương pháp này thường dùng để chưng cất tinhdầu từ các nguyên liệu thực vật

Điểm ưu việt của phương pháp này là người ta có thể điều chỉnh áp suất, nhiệt độnhư mong muốn để tận thu sản phẩm, nhưng phải giữ nhiệt độ ở mức giới hạn để tinh dầukhông bị phân hủy

27

Việc sử dụng phương pháp này cũng lệ thuộc vào những điều kiện hạn chế như đãtrình bày đối với hai phương pháp chưng cất nói trên cộng thêm hai yếu tố nữa là yêu cầuhơi nước không quá nóng và quá ẩm Nếu quá nóng nó có thể phân hủy những cấu phần

có độ sôi thấp, hoặc làm chất nạp khô quá khiến hiện tượng thẩm thấu không xảy ra Do

đó trong thực hành, nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại sớm quá, người ta phải chưngcất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong một thời gian cho đến khi sự khuyếch tán hơi nướcđược tái lập lại, khi đó mới tiếp tục dùng lại hơi nước quá nhiệt Còn trong trường hợp,hơi nước quá ẩm sẽ đưa đến hiện tượng ngưng tụ, phần chất nạp phía dưới sẽ bị ướt, trongtrường hợp này người ta phải tháo nước ra bằng một van xả dưới đáy nồi Trong côngnghiệp, hơi nước trước khi vào bình chưng cất phải đi ngang một bộ phận tách nước

Với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng, nên tốt nhất làbắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết thúc Không cómột quy tắc chung nào cho mọi loại nguyên liệu vì mỗi chất nạp đòi hỏi một kinh nghiệm

và yêu cầu khác nhau

Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ thuộc vào đặc tính của tinh dầu và cách chọnphương phảp chưng cất Thí dụ như tinh dầu hương bài, nếu chưng cất hơi nước ở áp suấtthường thì thời gian kéo dài trên 12 giờ mà hiệu suất thu được chỉ khoảng 1, nhưng nếuchưng cất ở thiết bị có áp suất 4 – 5 atm thì hiệu suất thu được đạt 10 -12‰ và thời gianchưng cất chỉ còn 6 giờ Thường thì các loại tinh dầu có tỉ trọng lớn hơn nước, khi chưngcất hơi nước trong thiết bị áp suất cao, cho hiệu suất ly trích cao trong thời gian chưng cấtngắn

2.4.2.7 Thu hồi thêm tinh dầu từ nước chưng

Thường tinh dầu trong nước chưng nằm dưới hai dạng phân tán và hòa tan Dạngphân tán thì có thể dùng phương pháp lắng hay ly tâm, còn dạng hòa tan thì phải chưngcất lại Nếu trọng lượng riêng của tinh dầu và nước quá gần nhau thì có thể thêm NaCl đểgia tăng tỉ trọng của nước làm tinh dầu tách ra dễ dàng Trong phòng thí nghiệm, đểchưng cất hơi nước tinh dầu, người ta thường dùng bộ dụng cụ thủy tinh Clevenger vớihai loại ống hứng tinh dầu, tùy theo tinh dầu nặng hay nhẹ (Nguyễn Năng Vinh, 1977),(Nguyễn Văn Minh, 2004)

2.4.3 Ưu điểm và hạn chế của phương pháp

- Thời gian tương đối nhanh.

2.4.3.2 Khuyết điểm

- Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp

- Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần

dễ bị phân hủy

- Không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó là những chấtđịnh hương thiên nhiên rất có giá trị)

- Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn

- Nhưng tinh dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém

2.5 Phương Pháp Tẩm trích bằng dung môi dễ bay hơi

Phương pháp này có nhiều ưu điểm vì tiến hành ở nhiệt độ phòng, nên thành phầnhóa học của tinh dầu ít bị thay đổi

Phương pháp này không những được áp dụng để ly trích cô kết (concrete) từ hoa

mà còn dùng để tận trích khi các phương pháp khác không ly trích hết hoặc dùng để lytrích các loại nhựa dầu (oleoresin) gia vị

- Hòa tan hoàn toàn và nhanh chóng các cấu phần có mùi thơm trong nguyên liệu

- Hòa tan kém các hợp chất khác như sáp, nhựa dầu có trong nguyên liệu

- Không có tác dụng hóa học với tinh dầu

- Không biến chất khi sử dụng lại nhiều lần

- Hoàn toàn tinh khiết, không có mùi lạ, không độc, không ăn mòn thiết bị, khôngtạo thành hỗn hợp nổ với không khí và có độ nhớt kém

- Nhiệt độ sôi thấp vì khi chưng cất dung dịch ly trích để thu hồi dung môi, nhiệt độsôi cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu Điểm sôi của dung môi nên thấp hơnđiểm sôi của cấu phần dễ bay hơi nhất trong tinh dầu

- Ngoài ra, cần có thêm những yếu tố phụ khác như: giá thành thấp, nguồn cung cấp

dễ tìm, …

Thường thì không có dung môi nào thỏa mãn tất cả những điều kiện kể trên Người

ta sử dụng cả dung môi không tan trong nước như: dietil eter, eter dầu hỏa, hexan,

29

cloroform… lẫn dung môi tan trong nước như: etanol, aceton … Trong một số trường hợp

cụ thể, người ta còn dùng một hỗn hợp dung môi

2.5.3 Quy trình tẩm trích

Phương pháp ly trích này thích hợp cho các nguyên liệu có chứa lượng tinh dầukhông lớn lắm hoặc có chứa những cấu phần tan được trong nước và không chịu đượcnhiệt độ quá cao Quy trình kỹ thuật gồm các giai đoạn sau đây:

- Tẩm trích: nguyên liệu được ngâm vào dung môi trong bình chứa Trong một sốtrường hợp, để gia tăng khả năng ly trích, nguyên liệu cần được xay nhỏ trước Hỗn hợpnguyên liệu và dung môi cần được xáo trộn đều trong suốt thời gian ly trích Nên khảo sáttrước xem việc gia nhiệt có cần thiết hay không, nếu cần, cũng không nên gia nhiệt quá

500C để không ảnh hưởng đến mùi thơm của sản phẩm sau này

- Xử lý dung dịch ly trích: sau khi quá trình tẩm trích kết thúc, dung dịch ly tríchđược lấy ra và có thể thay thế bằng dung môi mới sau một khoảng thời gian nhất định, tùytheo nguyên liệu Tách nước (nếu có) ra khỏi dung dịch, rồi làm khan bằng Na2SO4 vàlọc Dung môi phải được thu hồi ở nhiệt độ càng thấp càng tốt để tránh tình trạng sảnphẩm bị mất mác và phân hủy Do đó, nên loại dung môi ra khỏi sản phẩm bằng phươngpháp chưng cất dưới áp suất kém (cô quay) Dung môi thu hồi có thể dùng để ly trích lầnnguyên liệu kế tiếp

- Xử lý sản phẩm ly trích: sau khi thu hồi hoàn toàn dung môi, sản phẩm là một chấtđặc sệt gồm có tinh dầu và một số hợp chất khác như nhựa, sáp, chất béo, cho nên cầnphải tách riêng tinh dầu ra Chất đặc sệt này đem đi chưng cất bằng hơi nước để tách riêngtinh dầu ra Tinh dầu có mùi thơm tự nhiên, nhưng khối lượng thu được kém, ngoài ra tinhdầu này có chứa một số cấu phần thơm có nhiệt độ sôi cao nên có tính chất định hương rấttốt

- Tách dung dịch từ bã: sau khi tháo hết dung dịch ly trích ra khỏi hệ thống, trong bãcòn chứa một lượng dung dịch rất lớn (khoảng 20 – 30% lượng dung môi ly trích) Phầndung dịch còn lại nằm trong nguyên liệu thường được lấy ra bằng phương pháp chưng cấthơi nước (trường hợp dung môi không tan trong nước), ly tâm, lọc ép (trường hợp dungmôi tan trong nước) Sau đó dung dịch này cũng được tách nước, làm khan và nhập chungvới dung dịch ly trích

Chất lượng thành phẩm và hiệu quả của phương pháp ly trích này phụ thuộc chủyếu vào dung môi dùng để ly trích Để đạt kết quả tốt thì dung môi sử dụng phải thoả mãnđược các yêu cầu đã được trình bày ở trên

Vì dung môi dễ bay hơi nên chúng ta cần phải lưu ý đến tỉ lệ thất thoát dung môitrong quy trình ly trích vì việc này có thể ảnh hưởng rất lớn đến giá thành sản phẩm