Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của flavonoid lá chay (artocarpus tonkinensis a chev ex gagnep)

Một số vấn đề về Aavonoid và tác dụng sinh học của chúng 3 1.2 Một số tác dụng sinh học của ílavonoid 4 2.2 Tình hình nghiên cứu về tác dụng làm thuốc của cày chay 9 Chương n : Nguyên li

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHOÁ 1997 - 2002

Người hướng dẫn :TS Trần Lưu Vân Hiền

GS TS Phạm Thanh Kỳ

Trường đại học Dược Hà Nội Phòng Đông Y thực nghiệm Viện Y học Cổ truyền Việt Nam

Thời gian thực hiện : 3/2002

-Hà Nội, 5-2002

LỜI CÁM ƠN

(J)âi lềậup kính ỉron/ị t%à hiỉi òa Síĩu sảa, tồi xiềi hàiị tả lồi eáễti ờti ahàtt

th àn h tjớl:

Ç7& ÇjfUfL Jhi'u (ĩ)ãtL Jôieic

(ìlhữtuị, »upười đ ĩt true, tiếp, hưổttạ, (lấn íùi eíủ hảfr tồ i hớàti iíu ìtth kítớú Luận

t ó / iUfhiêjfL nàụ, Çîôi (tủtup æiit ỈHUỊ, tfr Lòiitp (tảtn ổtL tố i ^ ) < í ộ .Çj& ^ỗũỈLtup

úiêiL p h m u ị (Hiíwm QJ- thưa iU ịldent dã n ldêt tìn h (jJúft đií eii& tò i ttônụ, ếịưá

triait thu!e kiejt UltöCL Luậểi iiùip.

MỤC LỤC

1 Một số vấn đề về Aavonoid và tác dụng sinh học của chúng 3

1.2 Một số tác dụng sinh học của ílavonoid 4

2.2 Tình hình nghiên cứu về tác dụng làm thuốc của cày chay 9

Chương n : Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 11

1.1 Định tính một số nhóm hợp chất trong lá chay 131.2 Định ỉượrig ílavonoid toàn phần trong lá 191.3 Chiết xuất ílavonoid toàn phần từ lá chay 201.4 Phân tích ílavonoid toàn phần bằng sắc kí lớp mỏng 221.5 Phân lập ílavonoid bằng sắc kí cột kết hợp với SKLM điều chế 23

2.1 Thử tác dụng chống oxy hoá của Ftp, Fj, F2 30 2.2 So sánh tác dụng chống oxy hoá của Ftp, Fj, F2 36

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

AOA Hoạt tính chống oxy hoá

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, gốc tự do và vai trò của gốc tự do trong cơ chế bệnh sinh và phát triển cúa nhiều loại bệnh đã thu hút sự chú ý của rất nhiều nhà y sinh học, các phòng thí nghiệm trên thế giới Trong số các loại gốc tự do người ta quan tâm nhiều nhất đến các dạng oxy hoạt động

Mặc dù với nồng độ rất thấp nhưng do có tính oxy hoá mạnh các dạng oxy hoạt động dễ dàng tương tác với hầu hết các chất hữu cơ ở nơi sinh ra gây tổn thương tế bào Vì một lý do nào đó, thường là do ảnh hưởng của các tác nhân gây bệnh, các dạng oxy hoạt động gia tăng khó kiểm soát trong khi đó hệ thống các chất chống oxy hoá không đủ để triệt tiêu chúng, kết quả là trong cơ thể tồn nhiều gốc tự do của oxy Nhiều bệnh nguy hiểm như các bệnh tim mạch, thấp khớp, ung thu', các rối loạn viêm nhiễm cũng như quá trình lão hoá đều đã được coi là đưực phát sinh do stress oxy hoá Trong các trường hợp này người ta nghĩ đến việc đưa thêm các chất chống oxy hoá từ ngoài vào, chúng ta đã biết đến vitaminC, vitaminE, caroten, các flavonoid [2]

Flavonoid là một hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong thực vật Chúng

có nhiều tác dụng sinh học quan trọng Đặc biệt tác dụng dọn gốc tự do và chống oxy hoá của các flavonoid đang được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới rất quan tâm nghiên cứu

Tại Việt Nam lá cây chay (Artocapus tonkinensis A.chev.ex Gagnep họ dâu tằm Moraceae) được sử dụng trong nhân dân dưới dạng nước sắc để chữa các bệnh đau lưng, tê mỏi Nhóm nghiên cứu Viện y học cổ truyền và bộ môn miễn dịch học viện Quân y đã tiến hành nhiều nghiên cứu về mặt sinh học miễn dịch của thành phần flavonoid tổng số từ lá cây chay, và đã chứng minh là thành phần này có tác dụng chống lại tổn thương màng tế bào thận sau thiếu máu- tưới máu irở lại [5], tác dụng ức chế sự chuyển dạng lympho bào khi có mặt PHA một chất kích thích phân bào không đặc hiệu [6]

1

v ề mặt hoá học chúng tôi chưa tìm thấy các tài liệu nghiên cứu có liên quan về các chất có hoạt tính sinh học trong dịch chiết lá chay Để có thêm những cơ sở khoa học cho việc dùng lá chay làm thuốc chữa bệnh, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với nhiệm vụ là:

- Chiết xuất và phân lập một số ílavonoid chính trong lá chay và nhận dạng chúng

- Thăm dò tác dụng chống oxy hoá của ílavonoid tổng số từ lá chay và so sánh khả năng chống oxy hoá của các phân đoạn qua test xác định MDA trong dịch đồng thể tế bào gan

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN

1 Một sô vấn đề về flavonoid và tác dụng sinh học của chúng

1.1 Đại cương về flavonoid [7]

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật Phần

lớn các chất flavonoid có màu vàng( flavus tiếng la tinh có nghĩa là màu

vàng) Cũng có một số chất có màu xanh, tím, đỏ hoặc không màu cũng thuộc

nhóm Mặt khác từ thực vật một số nhóm hợp chất không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotennoid, anthranoid, xanthon

Cấu trúc hoá học: ßavonoid là những chất có cấu trúc hoá học kiểu c 6-

C3 - C6 tức là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon vòng hoặc mở

Ö

( mạch c vòng ) ( mạch c mở )

Bản chất hoá học của flavonoid là những polyphenol, chúng thường ở dạng gỉycosid hay dạng aglycon Hầu hết các flavonoid tồn tại ở các dạng

gỉycosid khác nhau Sự đa dạng của các flavonoid do bởi sự khác nhau của

nhóm đường và vị trí liên kết của chúng vào các vị trí khác nhau của phân tử

flavonoid Đường có thể khác nhau về độ lớn của vòng oxy, cấu hình của các

liên kết glycosid và thứ tự liên kết giữa chúng Trong các flavonoid glycosid, đường thường gặp ở vị trí 7- sau đó là vị trí 3- rất hiếm khi gặp ở vị trí 5 Trong các flavonoid glycosid loại đường đơn thường gặp D-gỉycosa, D-

qaìactosa, L-arabinosa, L-rhamnosa Các aglycon và các gỉycosid của nó rất

đa dạng Có tới hơn 2000 các hợp chất flavonoid tự nhiên, tuy nhiên hiện nay

3

chỉ mới có khoảng 500 flavonoid đã được nghiên cứu về mặt hoá học và hoạt

tính sinh học của chúng

Flavonoid có ở tất cả các bộ phận của cây, nhất là ở hoa, là chất màu

tạo màu sắc rực rỡ cho hoa có sức quyến rũ côn tràng, giúp cho việc thụ phấn

của hoa Trong cây, flavonoid đảm nhận các chức năng như: là chất bảo vệ của

cây, CCOXH, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào thực vật Chất ức chế các tác nhân phá hoại cây như: vi khuẩn, vi rút, côn trùng, động vật ăn cỏ Một số

flavonoid có tác dụng điều hòa sinh trưởng.

Trong y học flavonoid đã được dùng làm thuốc chữa bệnh có nhiều tác dụng như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus Flavonoid còn có tác dụng làm tăng sức bền thành mao mạch chống xơ vữa động mạch (như rutin,

kesperidiỉi) Một số flavonoid có tác dụng bảo vệ tế bào gan, nhuận gan, lợi

mật Một số flavonoỉd khác như eupatin, eupatovetỉn có tác dụng ức chế khối

u.

1.2 Một số tác dụng sinh học của flavonoid

1.2.1 Khái niệm về gốc tự do [11]

Gốc tự do là những tiểu phân hoá học (nguyên tử, phân tử, ion ) có điện

tử không cặp đôi ở orbital hoá trị Ví dụ: gốc methyl *CH3 , gốc *H , gốc Cl*,

gốc Superoxyd 0 2~ *.

Đặc trưng của gốc tự do:

• Do có điện tử độc thân (tức là một tiểu phân mang điện, luôn chuyển động), nên gốc tự do có mô men từ spin

• Các gốc tự do có khả năng phản ứng cao

1.2.2 Sự hình thành các dạng oxy hoạt động [11]

Oxy được hít thở theo đường hô hấp vào máu rồi tới tận các tế bào, tham gia nhiều phản ứng sinh hoá học cơ bản để duy trì sự sống Những phản ứng sinh hoá học quan trọng nhất có sự tham gia của oxy là một loạt các phản ứng

4

oxy hoá khử liên tiếp xảy ra ở chuỗi hô hấp tế bào ứ ig với mỗi giai đoạn oxy nhận một điện tử, tạo ra một trạng thái gốc trung gian Đầu tiên oxy nhận một điện tử từ phân tử cytocrom, tạo ra gốc Superoxyd 0 2“ *, gốc Superoxyd này nhanh chóng được các enzym Superoxyd dismutase (SOD) phân huỷ, tạo ra

hydroperoxyd (H20 2) theo phản ứng:

0 2~ *+ 0 2~ * + 2H+ - SQD ► H202 + '02

Ở những nấc tiếp theo là những tiểu phân trung gian như hydroperoxyd(H20 2), gốc hydroxyl (OH*) Những tiểu phân này rất dễ nhường hoặc nhận điện tử Vì thế người ta gọi chúng là những tiểu phân có khả năng phản ứng cao

Một số ion kim loại chuyển tiếp Fe2+ , Cu2+ có thể xúc tác cho quá trình tạo

ra nhiều gốc hydroxyl trong phản ứng của 0 2~* với H207 (phản ứng Fenton)

02~# + H 202 -— -► “OH + *OH + ^ 2

Các gốc OH* có khả năng phản ứng nhanh với các acid béo chưa no tạo ra các hydroperoxyd lipid (LOOH) Sự phân huỷ các LOOH tiếp theo tạo ra các gốc mới như: gốc alkoxyl (LO*), gốc peroxyl (LOO*) Những tiểu phân gốc này cũng có tính oxy hoá mạnh, dễ dàng tương tác với các phân tử bên cạnh tạo ra các phân tử mới

Tất cả các tiểu phân chứa oxy có hoạt tính này ( 0 2_ *, *0H, H20 „ LO*, LOO* ) được gọi là các dạng oxy hoạt động (DOXHĐ)

1.2.3 Các chất chống oxy hoá [2]

Các phản ứng oxy hoá là một phần thiết yếu trong quá trình chuyển hoá để cung cấp năng lượng cho cơ thể Các phản ứng thường xảy ra với sự tham gia của các DOXHĐ Đó là những chất có hoạt tính cao về mặt hoá học Bản thân các DOXHĐ là những dạng chuyển hoá sinh lý bình thường của cơ thể

Nhưng vì ở trạng thái gốc tự do, hoạt tính oxy hoá lớn nên hầu như tức thì chúng phản ứng với các phân tử hữu cơ bèn cạnh tạo ra quá trình oxy hoá và phản ứng gốc tự do lan truyền trong cơ thể Những chất có khả năng phân huỷ, loại bỏ các DOXHĐ được gọi là CCOXH (antioxydant) Bình thường, trong cơ thể luôn có một hệ thống CCOXH để điều hoà quá trình sản sinh ra các DOXHĐ Những CCOXH điển hình trong cơ thể như: enzim Superoxyd dismutase chứa Mn/ty thể (SOD), catalase, vitamin E, vitamin c, transferin, ceruloplasmin, .chính nhờ những CCOXH này mà việc sinh ra các DOXHĐ

vẫn duy trì được cân bằng thích hợp, lượng các DOXHĐ trong cơ thể rất thấp, tác hại do chúng gây ra không lớn Khi có mặt những tác nhân oxy hoá thì hàm lượng các DOXHĐ tăng lên dần trong cơ thể dẫn đến xuất hiện các tĩnh trạng bệnh lý

Các tác nhân oxy hoá kể trên làm tăng các DOXHĐ trong cơ thể Đó cũng chính là nguyên nhân sâu xa của hàng trăm chứng bệnh như các trường hợp viêm, thiếu máu cục bộ, xơ vữa động mạch, sự thoái hoá của hệ thần kinh, sự phát triển của các khối u, sự lão hoá của các cơ quan phủ tạng và của toàn cơ thể

Do vậy, việc nghiên cứu các CCOXH (antioxyđant) được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới ngày càng quan tâm Khó có thể tìm thấy một tạp chí y - sinh học nào không nói đến các chất oxy hoá, các CCOXH đã được

biết đến như vitamin c, vitamin E, caroten Trong các CCOXH có nguồn gốc

tự nhiên người ta thường quan tàm đến các flavonoid.

Đặc biệt trong những thập kỷ gần đây người ta chú ý nhiều đến vai trò chống oxy hoá (antioxydant) bảo vệ tế bào, chống lão hoá tế bào Các

biflavonoid đã được chứng minh có tác dụng tạo ra gốc bền (tức là các gốc ít

độc hại với cơ thể xét về mặt phản ứng) Flavonoid có thể tạo ra sự “khoá” các phức hợp có kim loại như Fe2+ , Cu2+ là các chất xúc tác cho phản ứng Fenton

sinh ra gốc tự do độc hại với cơ thể Ngoài ra flavonoid còn góp phần loại trừ

RO*2 + ArOH -► R 0 2H + ArO*

Trong đó: ArOH : flavonoid

RO*2: gốc tự do hoạt độngArO*: gốc tự do bền vững

ArO* ở dạng quỉnon hoặc semiquinon có khả năng phản ứng với các gốc tự

do hoạt động để loại trừ chúng trong cơ thể:

ArO* + R* - ► Ar ORKết quả là gốc tự do hoạt động R* bị tiêu diệt, phản ứng dây chuyền bị cắtđứt Gần đây, một số tác giả đưa ra cơ chế giải thích tác dụng chống oxy hoá

của flavonoid là do sự tương tác mang tính hiệp đồng của flavonoid với các chất chống oxy hoá sẩn cỏ trong tế bào, như glutathion peroxydase (GSH-PO) Như vậy, các flavonoịd có khả năng dọn gốc tự do hoặc biến gốc tự do hoạt

động thành gốc trơ

1.2.5 ứng dụng của flavonoid trong y học [2]

Trong y học lâm sàng, tác dụng của flavonoid rất đa dạng, dưới đây là một

số phương hướng ứng dụng chính

+ Củng cố và làm giảm tính thấm thành mạch và thành tế bào nên được sử dụng trong những trường hợp chẩn đoán hoặc có nguy cơ chảy máu như cao

huyết áp, bảo vệ mao mạch khỏi bị histamin làm tổn thương, tăng nhanh sự phục hồi các mao mạch đã bị ảnh hưởng xấu của tia tử ngoại và tia X.

+ Chống dị ứng

+ Chống viêm loét do các nguyên nhân nội sinh hoặc ngoại sinh, kháng nhiều loại vi khuẩn và nấm khó tiêu diệt

+ Điều trị nhiều bệnh về gan, mật

+ Phòng và chữa một số bệnh liên quan đến chuyển hoá như :

- Điều hoà hàm lương các dạng cholesteron trong máu, tránh nguy cơ

xơ vữa mạch, phục hồi trương lực cơ tim, điều hoà nhịp tim và huyết áp, điều hoà chuyển hoá calci

- Ảnh hưởng lên hệ thống nội tiết nên có vai trò đáng kể trong việc điều hoà cân bằng sinh học của cơ thể

+ Dùng bioflavonoid để hỗ trợ cho cơ thể khi dùng nhiều kháng sinh hoặc

sống trong môi trường có nhiều bức xạ ion

+ Về phương diện miễn dịch học: nhiều bioflavonoid có khả năng kích

ihíeh limpho bào sản xuâì inteferon, chống virus xâm nhập vào cơ thể và kìm hãm sự nhân lên của virus

Giảm đau do tác dụng chống co thắt, giãn cơ trơn Làm giảm các đám xuấl huyết nhỏ trong bệnh đái đường

+ Loại trừ dấu hiệu thần kinh do thiếu vitamin c

2 Cây chay, một dược liệu có tác dụng chống oxy hoá

2.1 Đặc điểm thực vật [10]

8

Cây chay có tên khoa học là Artocapus tonkinensis A Chev ex Gagnep thuộc họ dâu tằm (Moraceae) Cây to, cao từ 10 đến 15m, phân cành nhiều Cành lúc non có lông hung, sau nhẩn, vỏ màu xám Lá mọc hình so le, xếp thành hai dãy, phiến lá hình trái xoan hay bầu dục, dài 7 - 1 5 cm, rộng 3 - 7

cm, gốc Iròn, đầu nhọn, mặt trên của lá nhẵn bóng, mặt dưới có lông và các đường gân Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái ở cùng một cây Quả phức, hình cầu không đều, lúc còn non vỏ nhẵn và màu xanh nhạt, lúc chín màu vàng có lông nhung, bên trong có nhiều hạt trắng ngà được bọc một lớp cùi màu đỏ Cùi ăn được có vị ngọt hơi chua Mùa ra hoa là tháng 3- 4, mùa thu hoạch quả là tháng 7 - 8 hàng năm Cây mọc hoang dại, nhưng do tập tục

ăn trầu bằng vỏ chay nên nhân dân ở một số vùng đã trồng cây chay ở vườn nhà để lấy vỏ

2.2 Tình hình nghiên cứu về tác dụng làm thuốc của cây chay.

Trên thế giới chúng tỏi chưa thấy tài liệu nào công bố về tác dụng chữa bệnh của cây chay

Ở Việt Nam, theo kinh nghiệm dân gian dùng lá và rễ cây chay sắc uống

để chữa đau lưng, tê m ỏi Đ ã có nhiều tác giả nghiên cứu về tác dụng chữa bệnh của các sản phẩm chiết xuất từ lá chay, phân tích các thành phần có hoạt tính chữa bệnh và bước đầu tìm hiểu cơ chế tác dụng của nó GS Phan Trúc Lâm và cộng sự đã dùng nước sắc lá chay chữa thành công cho những trường hợp bị bệnh nhược cơ nặng, một bệnh tự miễn phải chữa bằng các thuốc ức

chế miễn dịch như: prednisoỉon, azathioprin [9]

Phạm Mạnh Hùng và cộng sự đã dùng flavonoid của G ây chay với liều 125mg/kg thể trọng trên chuột thực nghiệm ghép da dị gien thấy thuốc có tác dụng làm kéo dài thời gian sống dư của mảnh da ghép

Lê Đình Khánh thăm dò tác dụng của flavonoid cây chay với liều 5mg/kg

thể trọng trên chuột ghép thận đồng loại thấy thuốc có tác dụng ức chế thải ghép

9

Tại khoa Dược lý, phòng Đông y thực nghiệm, Viện Y học cổ truyền trung

ương đã đánh giá độc tính cấp diễn của f l avonoid tổng số từ lá cây chay thấy

LD50 là 5,750 mg/kg thể trọng chuột, liều an toàn tối đa là 1,250 mg/kg thể trọng chuột

Nguyễn Thái Hồng , Vũ Tân Trào, Trần Lưu Vân Hiền đã nghiên cứu thấy

tác dụng của f ìavonoỉd lá chay ức chế sự chuyển dạng của limpho bào ở bệnh

nhân Lupus ban đỏ hệ thống [6]

Ngô Quốc Anh, Trần Văn Sung đã nghiên cứu về thành phần hoá học và

tác dụng ức chế miễn dịch của fỉavonoid lá chay trên thực nghiệm và bước đầu

nghiên cứu tác dụng trên lâm sàng [1]

Nhìn chung, các tác giả đã chứng minh được tác dụng ức chế miễn dịch

của Ịìavonoìd lá chay trên thực nghiệm và bước đầu nghiên cứu tác dụng trên

lâm sàng

10

CHƯONG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

1 Nguyên liệu nghiên cứu

Dược liệu là lá của câv chay, được thu hái tại Phú Thọ Mẫu cây được xác định tên khoa học là: Artocarpus tonkinensis A-chev.ex Gagnep, họ dâu tằm (Moraceae) Mẫu lá được lưu tại phòng Đông y thực nghiệm- Viện y học cổ truyền Việt Nam

Lá hái vào tháng 3, chọn những lá xanh tốt, không sâu bệnh Lá hái về bỏ cành non, sấy khô ở nhiệt độ 50-60° c trong tủ sấy có thông gió

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Các phương pháp nghiên cứu hoá học [3], [4], [8]

Định tính các nhóm chất hoá học trong lá chay bằng các phản ứng định tính

Định lượng Aavonoid toàn phần trong lá chay bằng phương pháp cân

Dùng phương pháp sắc kí cột để phân lập các íìavonoid Rửa giải cột bằng các hệ dung môi khác nhau Dùng sắc kí lớp mỏng, với bản mỏng silicagel

GF754 (MERCK) để kiểm tra các phân đoạn thu được

- Đo phổ tử ngoại UV-VIS trên máy GBC2855

Đo phổ hồng ngoại trên máy PERKIN ELMER

Sắc kí lỏng hiệu năng cao trên máy IMPACT-400HP

- Ghi phổ khối trên máy MS-ENGIN 5989 N/S

Ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên máy BRUKER AVANCE-500

( Các phổ được ghi tại viện Hoá-TTKHTN & CNQG và phòng thí nghiệm trung tâm đại học Dược Hà Nội)

2.2 Phương pháp thử hoạt tính sinh học [13]

Thăm dò tác dụng chống peroxy hoá lipid màng tế bào gan chuột nhắl trắng, theo phương pháp của Jawiga Robak ( Ba Lan 1974) và Misno Tanaka (Nhật Bản 1994) Phưưng pháp này dựa trên sự xác định Malonyldialdehyd

(MDA),một trong các sản phẩm của sự, peroxy hoá lipid Chất này phản ứng ' với acid thiobarbituric tạo phức hợp trimethine có màu hồng, sản phẩm phức hợp này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 532nm ( đo quang trên máy ELx800 tại phòng Đông y thực nghiệm viện YHCTVN ).

12

CHƯONGIII: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ■ ■

1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

1.1 Định tính một số nhóm hợp chất trong lá chay

Ạ Định tính alcaloid:

Cho khoảng 3g nguyên liệu vào bình nón dung tích lOOml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch NH4OH 0,5N Sau 30phút cho cloroíorm vào, đậy kín Ngâm 12h, gạn dịch cloroíorm vào bình gạn Sau đó lắc kỹ với dung dịch H2S 04 IN, gạn lấy dịch chiết acid để làm các phản ứng với thuốc thử chung của alcaloid

- Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 - 3giọt thuốc thử Dragendorffkhông thấy xuất hiện tủa da cam

- Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Maver, không thấy xuất hiện tủa trắng

- Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện tủa nâu

Kết luận: Không có alcaloid

¿*>\* Định tính anthraglycosid:

-Phản ứng Bomtraeger

Lấy 3g nguyên liệu cho vào bình nón dung tích lOOml, thêm 40ml dung dịchH2S 0 4, đun sôi cách thuỷ trong 15phút Để nguội, lọc Cho dịch lọc vào bình gạn Lắc với 5ml ether ethylic, thêm 3ml dung dịch NaOH 10%, thấy lớp nước màu đỏ sim, lớp ether không màu Phản ứng dương tính

-Phản ứng vi thăng hoa:

Đặt một ít dược liệu trong một nắp chai, hơ nhẹ trên đèn cồn cho đến khi bay hơi hết nước Đặt lên miệng nắp chai một lam kính, trên lam kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh Để nắp chai trực tiếp trên nguồn nhiệt, sau 5- lOphút lấy lam kính để nguội soi trên kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu vàng Phản ứng dương tính

13

Kết luận: Có anthraglycosid

ĩ ^ * Định tính acid hữu cơ:

Cho lg nguyên liệu vào ống nghiệm, thêm 10ml nước cất Đun sôi trực tiếp lOphút, để nguội, lọc Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể N aiC 03 Không thấy

có bọt C 02 bay lên Phản ứng âm tính

Kết luận: Không có acid hữu cơ

Ống 1: Có tủa đục màu vàng

Ống 2: Trong

+ Thêm vào cả hai ống mỗi ống 2ml nước cất Lắc đều, quan sát:

Ông 1: Trong suốt

- Phản ứng diazo hoá:

Cho một lm l dịch chiết vào ống nghiệm, Thêm lml dung dịch NaOH 10% Đun sôi cách thuỷ 5phút Lấy ra để nguội rồi thêm vào đó 2 - 3gịọt thuốc thử diazo, thấy xuất hiện màu đỏ Phản ứng dương tính.

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%:

Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm 5 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy xuất hiện tủa xanh Phản ứng dương tính

Ị- f * Định tính glycosid tim:

Cho vào bình nón duns tích 100ml khoảng I0g dược liệu, thêm 80ml cồn 25° Ngâm 24giờ, gạn lấy dịch chiết Loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% dư Lọc bỏ tủa, dịch lọc cho vào bình gạn và lắc kỹ 2 lần với cioroform mỗi lần 20ml, gạn lấy dịch cloroform vào cốc thuỷ tinh Bốc hơi cách thuỷ đến khô Cắn được hoà tan bằng cồn 90°, dịch chiết cồn để làm phản ứng định tính glycosid tim

- Phản ứng Legal:

Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dung dịch Natri nitroprussiat

1% và vài giọt dung dịch NaOH 10% để đảm bảo kiềm dư, không thấy xuất hiện màu hồng Phản ứng âm tính

- Cho 2 giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm có 5ml nước, lắc mạnh trong 15 giây, không có bọt Phản ứng âm tính.

Kết luận: Không có saponin

Kết luận: Có sterol

Kết quả định tính các nhóm chất trong lá chay tóm tắt ở bảng 1.

17

Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm chất trong lú chay

TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Đánh giá sơ bộ Ị

CóPhản ứng với gelatin 1% +

7

1

*Nhận xét: Qua các phản ứng định tính sơ bộ, chúng tôi thấy trong lá chay

có chứa ílavonoiđ, anthranoid, đường khử tự do, acid amin, sterol, coumarin, tanin, không thấy có alcaloiđ, glycosid tim, saponin, acid hữu cơ, chất béo

1.2 Định lượng Aavonoid toàn phần trong lá

• Loại tạp:

Trong lá chay có nhiều cloroíin, có thể tan trong ether dầu hoả, đoroíorm , ethylethylic Lấy 2g bột lá chay cho vào bình soxhlet chiết với từng loại dung môi Dịch chiết được thử flavonoiđ bằng cách rỏ giọt trên giấy lọc rồi hơ amoniac Kết quả cho thấv ether dầu hoả có khả năng loại cloroíin tốt nhất mà không hoà tan ílavonoid

• Định lượng:

Cân chính xác khoảng 5g bột lá chay đã xác định độ ẩm Cho vào bình soxhlet chiết với ether dầu hoả trên cách thuỷ cho đến khi dịch chiết trên bình

hết màu xanh Lấy gói dược liệu ra để ở nhiệt độ phòng cho bay hơi hết dung

môi, tiếp tục chiết bằng methanol cho đến khi dịch chiết trên soxhlet hết màu vàng Cất thu hồi methanoỊ hoà tan cắn bằng nước nóng, lọc để nguội rồi lắc với ethylacetat nhiều lần trong bình gạn cho tới khi lớp ethylacetat hết màu vàng Gộp dịch chiết ethylacetat lại bốc hơi dung môi thu được cắn ílavonoid toàn phần Sấy cắn ở 60°c đến khối lượng không đổi Cân khối lượng cắn thu được

* Công thức tính:

Hàm lượng P tp = _t _ 100

a ( ì - m )

b: Khối lượng Ftp a: Khối lược dược liệu, m: Độ ẩm

19

Bảng 2 Kết quả định ỉượnqỷĩavonoỉd toàn phần

STT Khối lượng dược

liệu (g)

Độ ẩm (%)

Số mẫu n = 5 Đo độ ẩm trên máy GRAINERII

* Giá trị thực được tính theo công thức:

Dùng phương pháp toán thống kê tính được hàm lượng Ftp = 1,83 ± 0,19 %

1.3 Chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá chay

Lấy 500g dược liệu được sấy khô ở 60°c, đem tán nhỏ Bột dược ỉiệu được chiết cách thuỷ bằng 1500ml nước trong 5giờ, lọc lấy dịch chiết nước, bã dược liệu được chiết lần nữa với lOOOmỉ nước trong 4giờ, lọc và gộp dịch chiết của 2 lẩn Dịch chiết nước được loại tạp bằng n- hexan sau đó chiết

20

ílavonoid bằng ethylacetat cất thu hồi' ethylacetat thu được ílavonoid toàn phần Qui trình chiết xuất được tóm tắt trong sơ đồ 1:

Sơ đồ ỉ : Olli trình chiết Flavonoid

21

• Khai triển sắc ký lớp mỏng (SKLM) bằng hệ dung môi

Hệ I: Toluen - EtOAc - HCOOH (5:6:1,5)

• Các thuốc thử: Hơi amoniac, dung dịch A1C13 3 % /ethanol

Bảng 3 Kết quả SKLM một chiều Flp bằng hệ dung mồi Ị.

Thứ tự

Rf.100

Hiện màu với thuốc thử

1

Hệ I: Toluen - EtOAc - HCOOH (5:6:1,5)

Hệ H: EtOAc - HCOOH - CHCI3 (2:1:2)

22

Hình 1 SKLM hai chiềụ với 2 hệ dung môi.

*Nhận xét:

Kết quả SKLM một chiều cho thấy trong dịch chiết ethylacetat có ít nhất 6

vết chất Kết quả SKLM hai chiểu cho thấy trong dịch chiết ethylacetat có ít nhất 7 vết chất do vết thứ nhất đã tách thành 2 vết Trong đó có ít nhất 4 vết đặc trưng là flavonoid (cho màu vàng với thuốc thử A1G3)

1.5 Phân lập flavonoid bằng sắc ký cột kết hợp với SKLM điều chế.

• Chuẩn bị cột:

Chất hấp phụ là Silicagel loại dùng cho sắc ký cột (SKC) Cột sắc ký có kích thước 3xó0cm, silicagel được nhồi vào cột theo phương pháp nhổi cột ướt, flavonoid toàn phần trộn với một lượng Silicagel thành bột khô tơi và được đưa lên bề mặt cột, sau đó phủ nhẹ lên trên một lớp mỏng silicagei

• Khai triển và rửa giải cột:

Phản hấp phụ bằng các hệ dung môi khác nhau Hứng các phân đoạn, kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi EtOAc - MeOH - H20 (100:17:13), tính Rf, gộp các phân đoạn giống nhau

23

- Khi rửa giải với hệ dung môi CHCI3 : EtOAc ở các tỉ lệ 6:4, 5:5, 4:6, 3:7; bốc hơi dung môi thu được cùng một chất gọi là Fị dưới dạng bột màu

vàng Kiểm tra Fj bằng SKLM với 3 hệ dung mồi khác nhau đểu cho một vết

Sơ bộ kết ]uận F, là một đơn chất

Khi rửa giải với hệ dung môi EtOAc : Aceton ở các tỉ lệ 4:1, 3:1, bốc

hơi dung môi thu được cùng một chất gọi ỉà FA Kiểm tra FA bằng SKLM với 3

hệ dung môi đều cho 2 vết

* Sử dụng phương pháp SKC cải tiến kết hợp với SKLM điều c h ế đ ể phân lập các flavonoid trong FA.

SKC cải tiến: Dùng silicagen G (SKLM) hoạt hoá ở 110°c trong 30 phút

để nhồi cột Trộn flavonoid FA trong cồn với một ít silicagen hoạt hoá trong

cùng điều kiện rồi chuyển lên cột, cột có kích thước l ,8x20cm ú p ngược cột

sắc ký đã nhồi vào bình có sẵn dung môi Khi dung mồi đã lên hết cột, lật cột

trở lại và tiếp tục dùng hệ duns môi trên cho chạy qua cột Các phân đoạn tách

ra được để riêng và kiểm tra bằng SKLM

Hệ dung môi khai triển Toluen: EtOAc: HCOOH 5 : 6 : 1,5

SKLM : từng phân doạn tách ra được chấm sắc ký và khai triển với hệ

dung môi trên Chọn riêng những phân đoạn chỉ có một vết trên sắc đồ Bốc

hơi dung môi thu được cắn flavonoid

Hoà tan cắn trở lại trong MeOH rồi tiến hành SKLM Mẫu chấm dưới dạng

vạch trên bản mỏng 20 X 20 cm, khai triển với hệ dung môi trên Sau khi khai

triển xong để bay hết dung môi, trên sắc đổ có 2 vết chất trong đó có một vết

rất nhạt có Rí=0,64 và một vết đậm có Rf=0,5 Cạo riêng lấy vết chất có

24