Nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc phụ tử trồng hái ở sapa

Bộ Y tê TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘIHOÀNG MINH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỊ THUỐC PHỤ TỬ TRỒNG Ở SAPA Người hướng dẫn: Tiến sĩ... Tôi hết sức cảm ơn Tiến sỹ Phạm Văn Thanh

Bộ Y tê TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

HOÀNG MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA VỊ THUỐC PHỤ TỬ TRỒNG Ở SAPA

Người hướng dẫn: Tiến sĩ Phùng ĩ

Dược sĩ Vũ Chí Nguyễn Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền

Đại học Dược — Viện Dược liệu Thời gian thực hiện: 1-3-2004 đến 28-5-2004

Hà Nội, tháng 5 - 2004

LÒI CẢM ƠN

Với nỗ lực của bản thân và sự hướng dẫn giúp đỡ tận tình của các thầy

cô, gia đình, bè bạn, tôi đã hoàn thành khóa luận của mình trong thời gian quy định

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sỹ Phùng Hòa Bình, Thạc

sỹ Bùi Hồng Cường và Dược sỹ Vũ Chí Nguyễn đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giảng viên, kỹ thuật viên trong

Bộ môn Dược học cổ truyền Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm

Tôi hết sức cảm ơn Tiến sỹ Phạm Văn Thanh (Trưởng khoa) và các cô, các chú, các chị trong Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu đã luôn luôn giúp

đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong thời gian làm thực nghiệm khóa luận

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bè bạn, những người đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài này

Hà Nội, ngày 30 tháng 5 năm 2004

Sinh viên Hoàng Minh Phương

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TổNG QUAN 2

1.1- Đặc điểm thực vật của chi Aconitum 2

1.1.1- Vị trí phân lo ạ i 2

1.1.2- Phân bố 2

1.1.3- Đặc điểm thực vật 2

1.1.4- Bộ phận dùng 3

1.2- Thành phần hóa học: 6

1.2.1- Thành phần hóa học 6

1.2.2- Cấu trúc hóa học 6

1.2.3- Tính chất của aconitin và sản phẩm thủy phân 9

1.2.4- Định lượng alcaloid toàn phần và aconitin 9

1.3- Tác dụng sinh học 10

1.4- Tác dụng và công dụng của phụ tử: 12

1.4.1- Phụ tử sống 12

1.4.2- Phụ tử chế: 12

1.5- Một số phương thuốc cổ truyền có v| thuốc phụ tử 13

1.5.2- Bát vị quế phụ 13

1.5.3- Một số phương thuốc cổ truyền khác: 14

1.6- Một số phương pháp chế biến 14

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15■ ■

2.1- Nguyên liệu, phương tiện nghiên cứu và phương pháp thực nghiệm 15

2.1.1- Nguyên liệu: 15

2.1.2- Phương tiện nghiên cứu 16

2.1.3- Phương pháp nghiên cứu 16

2.2- Thực nghiệm và kết quả 17

2.2.1- Nghiên cứu định tính 17

2.2.2- Định lượng alcaloỉd toàn phần 27

2.3- Bàn luận: 30

2.3.1- Định tính: 30

2.3.2- Định lượng: 30

PHẦN 3: KÊT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33

1- Kết luận 33

1.1- Thành phần hóa học: 33

1.2- Phân tích alcaloid bằng SKLM: 33

1.3- Định lượng alcaloỉd toàn phần: 33

2- Đề xuất: 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Phụ tử - một vị thuốc quý trong 4 đầu vị của y dược học cổ truyền

“sâm, nhung, quế, phụ”, có tác dụng cải tử hoàn sinh, từ lâu đã được các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu và sử dụng

Vào những năm 1970-1990, Giáo sư - Tiến sỹ Phạm Thanh Kỳ và các cộng sự đã nghiên cứu về thực vật, chế biến, hóa học và thử một số tác dụng sinh học của cây ô đầu Việt Nam, tên khoa học là Aconitum Fortunei [9]

Sau chiến tranh biên giới (1979), cây ô đầu - phụ tử bị triệt phá và mất giống hoàn toàn Nhân dân Sapa phục hồi lại giống ô đầu - phụ tử không rõ nguồn gốc Gần đây, một số nhà khoa học của Việt Nam đã nghiên cứu về một loài phụ tử ở Sapa có tên khoa học là Aconitum carmichaeli Debx Họ Ranumculaceae [1]

Với mục tiêu xác định sự có mặt của các thành phần hóa học có trong phụ tử Sapa cũng như sự thay đổi của hàm lượng alcaloid toàn phần trong giai đoạn có thể thu hoạch củ qua các thời kỳ trước, trong và sau thời kỳ ra hoa, ra quả của cây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu vị thuốc phụ tử Sapa với các nội dung sau:

Định tính các nhóm chất hóa học trong phụ tử sống Định lượng alcaloid toàn phần của phụ tử ở một số thời điểm phát triển của cây

PHẦN 1: TổNG QUAN 1.1- Đặc điểm thực vật của chi Aconitum

1.1.1- Vị trí phân loại [4]

Chi Aconitum thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng Liên (Ranunculales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsita), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

1.1.2- Phân bô

Chi Aconitum có khoảng 300 loài [5] phân bố chủ yếu ở các vùng cận

nhiệt đới và ôn đới châu Âu, châu Á, Bắc Mỹ, có nhiều nhất ở Trung Quốc (167 loài) [26]

Âu ô đầu (Aconitum napellus và Aconitum spp.) mọc hoang và trồng

ở châu Âu [2]

Ô đầu Trung Quốc (Aconitum carmichaeli, Aconitum chinense, Aconitum spp.) mọc hoang và trồng ở các vùng Tứ Xuyên, Quý Châu, Vân Nam, Thiểm Tây, Cam Túc (Trung Quốc) [2]

Ô đầu Việt Nam mọc hoang và được trồng ở các vùng núi cao như Hà Giang, Lào Cai (Sapa) [2], [7]

1.1.3- Đặc điểm thực vật

Chi Aconitum: cây thảo, sống lâu năm, thân thẳng hoặc leo, gốc thường nạc, hình củ, nhiều loài có củ mẹ hỗn hợp giữa rễ củ và thân [26]

Lá thùy hoặc xẻ chân vịt, ít khi nguyên

Cụm hoa thường mọc thành chùm ở ngọn cành hoặc nách lá Hoa không đều, xanh nhạt hoặc vàng nhạt, có cuống, bao hoa dạng tràng, 5 cánh đài không đều, cánh trên thường có hình mũ, cánh dưới hình trái xoan hoặc

mũi mác bé hơn, cánh đài bên hình trái xoan ngược không dối xứng, móng rộng Tuyến mật dạng cánh hoa nằm trong mũ rất phát triển, hai cánh hoa ở trên dạng mũ, thường có móng dài mang các tuyến nằm trong mũ, nhị nhiều, chỉ nhị có răng hoặc không, có nhiều lông hoặc nhẵn, 3-5 lá noãn, nhiều noãn [26].

Quả phức gồm 3-5 nang nhỏ Hạt nhiều, bề mặt sần sùi, có nếp nhăn[26]

Ô đầu [2]:

Cây ô đầu thuộc loại cỏ, mọc hàng năm, cao chừng 0,6-lm, rễ phát triển thành củ có hình nón, thân mọc thẳng đứng, có ít cành Lá mọc so le, hình dáng, kích thước lá có khác nhau chút ít tùy theo loài:

+ Aconitum napellus: lá xẻ chân vịt gần như lá ngải cứu, mặt trên màu xanh sẫm, mặt dưới màu nhạt hơn [2], [13]

+ Aconitum carmichaeli: phiến lá rộng 5-12cm, xẻ thành 3 thùy, 2 thùy 2 bên lại xẻ làm 2, thùy giữa xẻ làm 3 thùy con, mép các thùy đều có răng cưa thô, to [2], [13]

+ Aconitum íortunei: lá hình mắt chim [13], xẻ thùy hình chân vịt [8] thành 3 thùy không đều, mép các thùy có khía răng cưa nhọn [2], [8], [9]; thùy hơi hình trứng dài, có răng cưa ở nửa trên [13]

Hoa lưỡng tính, không đều, có màu xanh lơ thẫm hay xanh tím mọc thành chùm ở ngọn thân Có 5 lá đài, trong đó có một cái khum thành hình

mũ Quả có 5 đại mỏng Hạt có vẩy [2]

1.1.4- Bộ phận dùng

Rễ củ: Củ cái gọi là ô đầu, chỉ được dùng ngoài, củ nhánh gọi là phụ

tử được chế biến thành phụ tử chế để dùng trong

+ Aconitum napellus chứa 0,2-3% alcaloid toàn phần Trong đó,

aconitin chiếm tới 85-90% [2] Ngoài ra còn có benzoylaconin, aconin,

napellin, neopellin, magnoflorin, hypaconitin, và có vết spartein, ephedrin

[ 2 ].

+ Aconitum carmichaeli chứa 0,32-0,77% alcaloid toàn phần, trong đó

có hypaconitin, aconitin, mesaconitin, jesaconitin, atisin, kobusin, ignavin,

songorin, hygenamin, corynein, yokonosid [2]; karakolin [19], uracil, neolin,

fuzitin, neojiangyouaconitin [25]; benzoyl mesaconitin [24]; chuan-wu base

A, chuan-wu base B [11]

+ Aconitum fortunei đối với cây trồng ở Sapa (Lào Cai) alcaloid toàn phần ở cụ mẹ: 0,36-0,80%, củ con: 0,78-1,17% [2], [10] Cây trồng ở Hà Giang có alcaloid toàn phần ở củ con: 0,63% Trong ô đầu Việt Nam có aconitin, hypaconitin và còn ít nhất 8 vết hiện màu với thuôcs thử dragendorff trên sắc ký lớp mỏng nhưng chưa phân lập được để xác định cấu trúc hóa học [2]

Ngoài alcaloid, trong ô đầu phụ tử còn có acid hữu cơ (acid aconitic, acid citric, acid maltic ), tinh bột, đường, muối vô cơ [2]

1.2.2- Cấu trúc hóa học

- Các aconit alcaloid có tác dụng sinh học đặc trưng hầu hết là các alcaloid có khung diterpen được phân thành 3 nhóm [18]:

+ Nhóm 1: các alcaloid có 2 nhóm chức esther gắn vào khung diterpen

+ Nhóm 2: các alcaloid có 1 nhóm chức esther gắn vào khung diterpen

+ Nhóm 3: các alcaloid không có nhóm chức esther gắn vào khung

diterpen

Công thức cấu tạo của một số alcaloid:

N-DESACETYLLAPPACONITIN

DELSOLÈN LYCACONITIN PERCHLORAĨ

o

SONGORÍN

1.2.3- Tính chất của aconitỉn và sản phẩm thủy phân:

Aconitin trong môi trường nước dễ bị thủy phân thành benzoylaconin

và acid actic Benzoylaconin chỉ bằng 1/400-1/500 aconitin; độ độc của aconin bằng khoảng 1/10 benzoyl aconin [2]

Aconitin (Acetylbenzoylaconin C34H47NO u ) là alcaloid có trong tất cả các loài thuộc chi Aconitum: M = 645,75 đvC; t°nc = 204°C; [a] D = +17,3° (cloroform); lg tan trong 2ml cloroform, 7ml benzen, 28ml cồn tuyệt đối, 50ml ether, 3.300ml nước, ít tan trong ether dầu hỏa [23]

Aconin (C25H41N 0 9) dạng bột vô định hình, vị cay tê M = 449 vđC; t°nc = 132°C; [a] D = +23° Tan tốt trong nước và cồn, tan vừa trong cloroform, ít tan trong benzen, rất ít tan trong ether và ether dầu hỏa [23]

1.2.4- Định lượng alcaloỉd toàn phần và aconitin:

1.2.4.1- Định lượng alcaloid toàn phần

- Theo phương pháp của Dược điển Việt Nam in [5]:

Kiềm hóa mẫu, chiết alcaloid dạng base bằng dung môi hữu cơ có độ phân cực thấp như chloroform, ether Chuẩn độ bằng dung dịch HC1 0,1N Chỉ thị là hỗn hợp đỏ methyl và xanh methylen

lml dung dịch HC1 0,1N tương ứng với 64,6mg alcaloid toàn phần tính theo aconitin

Hàm lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu tính theo công thức:

x% = 0.0646.Ĩ1.100

pp: khối lượng dược liệu khô kiệt tương ứng đem định lượng (khoảng4g)

n: số ml HC1 0,1N đã dùng

Định lượng theo phương pháp của Dược điển Trung Quốc [22]: Khi kiềm hóa 1 lượng bột đã cân chính xác bằng amoniac đặc, sau đó chiết kiệt bằng dung môi EteOH:CHC13 (3:1) Định lượng bằng H2S 04 0,01M Chỉ thị là đỏ methyl

Iml dung dịch H2S04 0,01M tương đương với 12,9mg aconitin

Hàm lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu tính theo công thức:

p.10p: khối lượng dược liệu khô kiệt tương ứng đem định lượng (khoảng10g)

n: số ml H2S 0 4 0,0IM

1.2.4.2- Định lượng aconitin:

Phương pháp SKLM [10] định lượng aconitin: Dùng SKLM tách aconitin ra khỏi hỗn hợp ancaloid, sau đó đem đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 273nm Căn cứ vào đường chuẩn của aconitin mẫu suy ra hàm lượng aconitin có trong các mẫu đó

1.3- Tác dụng sinh học

Các alcaloid trong phụ tử đóng vai trò rất quan trọng trong tác dụng sinh học của phụ tử

- Tác dụng trên hệ tim mạch:

+ Tác dụng trợ tim, cường tim [10], [11], [13].

c Phụ tử sống (ô đầu) rất độc Độc tính của phần tan trong cồn rất cao

so với phần tan trong nước [11] LD50 của củ con ô đầu Sapa trên chuột nhắt trắng là 2g/kg thể trọng [10]; LD50 của củ Aconitum bracchypodum là 1,02± 0,18g/kg thể trọng [20]

Phụ tử chế Sapa (Aconitum fortunei) LD50 = 78,75g/kg thể trọng; bạch phụ Trung Quốc LD50 = 45,00g/kg thể trọng [10]; phụ tử chế Trung Quốc LD50 = 17,42g/kg thể trọng (đường uống) và 3,5g/kg thể trọng (đường tiêm)

[20].

+ Ngộ độc phụ tử: độc tính của phụ tử chủ yếu là do aconitin, các biểu hiện ngộ độc như ngộ độc aconitin:

a Ngộ độc nhẹ: ngứa, nóng ở miệng, lưỡi, dạ dày (là đặc trưng quan trọng nhất) kéo theo tê liệt và mất cảm giác Một số triêu chứng khác là rối loạn đường ruột, rối loạn mạch, khó thở, lạnh, da tím tái, nhược cơ, chóng mặt và không làm chủ [21].

b Ngộ độc nặng: co giật ở mặt, chảy đờm rãi, nôn mửa mệt mỏi, khó thở, giãn đồng tử, mạch đập yếu và không đều, sắc mặt trắng bệch [2], thân nhiệt hạ thấp [6], [13], liệt chân tay, chóng mặt, ù tai [12] Chết do ngạt thở

và ngừng tim [2], do loạn nhịp nhanh thất và rung tim, chết trong phạm vi 6 giờ, thậm chí ngay tức khắc [21]

c Điều trị ngộ độc: rửa dạ dày bằng tanin, hô hấp nhân tạo lâu [6]

1.4- Tác dụng và công dụng của phụ tử:

1.4.1- Phụ tử sống

- Phụ tử sống thường chỉ được dùng ngoài [5], [7], [13], được bào chế dưới dạng cồn ô đầu, dùng để chữa đau dây thần kinh ngoại biên, đau dây thần kinh tọa, tật máy giật, viêm phế quản cấp, viêm thanh quản, viêm họng, cảm cúm, ho, thấp khớp [6], [7], [14], chấn thương phần mềm gây tụ huyết [20].

- Trường hợp đặc biệt dùng uống để chữa bán thân bất toại, chân tay

co quắp, mụn nhọt lâu ngày không liền miệng [12] Người Mèo ở đỉnh núi

cao gió lạnh còn dùng để ngâm rượu uống [7]

1.4.2- Phụ tử chế:

- Tính vị, quy kinh: vị cay, ngọt, tính rất nóng, rất độc, quy kinh vào

cả 12 kinh [6]

- Công năng, chủ trị:

+ Hồi dương cứu nghịch: dùngtrong trường hợp tâm thận dương hư,

mồ hôi tự vã ra, nôn nhiều, người lạnh toát, chân tay co quắp, mạch nhỏ

muốn tuyệt, dùng phối hợp với can khương, cam thảo (bài tứ nghịch thang)[3]

+ Khứ hàn, giảm đau: dùng trong các chứng phong hàn, thấp tỳ, đau nhức xương khớp, chân tay lạnh, thường phối hợp với quế chi, can khương [3]; chữa đau dây thần kinh ngoại biên, viêm khớp [21]

+ Ấm thận hành thủy: dùng trong trường hợp viêm cầu thận mạn tính, hoặc chức năng thận kém, dương khí không đủ, lưng gối đau lạnh, nhất là những người già, chức năng thận suy yếu, chân tay phù nề (phương thức: bát

vị quế phụ) [3]

+ Kiện tỳ vị: dùng trong trường hợp tỳ vị hư hàn, đau bụng tiêu chảy

do hàn tà nhập lý [3]; đau bụng, đau vùng thượng vị kèm vói cảm giác lanh chữa chứng đồng thời nôn và tiêu chảy hoặc phù kèm cảm giác lạnh hoặc lạnh chân tay [22]

Liều dùng: thường dùng cho thuốc thang là 4-12g [3]; 3-15g [11], [22]; có thể tới lOOg hay cao hơn [11]

Kiêng kỵ: những người âm hư, dương thịnh; trẻ em; phụ nữ có thai, đang cho con bú không dùng [3] Không dùng chung với bán hạ, bạch cập, bối mẫu, qua lâu nhân [5], [22]

1.5- Một số phương thuốc cổ truyền có vị thuốc phụ tử

1.5.3- Một số phương thuốc cổ truyền khác:

- Hồi dương cấp cứu thang [6]

- Đại hoàng phụ tử tế tan thang [3]

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1- Nguyên liệu, phương tiện nghiên cứu và phương pháp thực nghiệm

+ M2: lấy của gia đình bà Vũ Thị Miên (hay ông Trần Văn Tâm), tổ

11, Khu lâm trường, thị trấn Sapa

+ M3: trồng tại Công ty TNHH Traphaco Sapa tại thị trấn Sapa

Các mẫu được thu hái vào các tháng:

+ 14-7-2003: cây chưa ra hoa

+ 18-8-2003: cây bắt đầu ra nụ

+ 17- 9-2003: cây đang nở hoa rộ

+ 18- 10-2003: cây ra quả

+ 6-12-2003: cây lụi

• Các mẫu của bộ phận dưới mặt đất:

Rễ của cây ô đầu — phụ tử: 6-12-2003

Ô đầu củ cái của cây ô đầu - phụ tử: 6-12-2003

• Các mẫu mua trên thị trường:

Xuyên ô Trung Quốc mua tại Tứ Xuyên (Trung Quốc) 2003

1-10-Thảo ô Trung Quốc mua tại Tứ Xuyên (Trung Quốc) 1-10-2003 Một số mẫu chế:

+ Hắc phụ Trung Quốc, bạch phụ Trung Quốc mua tại Tứ Xuyên

2.1.2- Phương tiện nghiên cứu

Thiết bị: máy cân đo độ ẩm Prerisa (Thụy Sỹ), Buret định lượngchính xác

Hóa chất, thuốc thử:

+ Dung dịch chuẩn H2S 04 0,1N; NaOH 0,1N; HC1 0,1N do Công ty

Hóa chất vật liệu điện và vật tư khoa học kỹ thuật TPHCM cung cấp

+ Cồn tuyệt đối C2H5OH do Công ty cổ phần hóa chất tinh khiết Hà

Nội cung cấp

+ Aconitin chuẩn do hãng Latoxan (Pháp) cung cấp

+ Các hóa chất và thuốc thử khác đạt tiêu chuẩn phân tích

+ Bản mỏng silicagel 60F254 (Merk)

2.1.3- Phương pháp nghiên cứu

a Định tính